Name: synthesis of near-infrared emitting gold nanoclusters for biological applications
Uploaded: 2020-03-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelige for Alzbeta Magdolenova for hendes hjælp med flow cytometri. Forfatterne anerkender den finansielle støtte fra GACR-projektet Nr. 18-12533S. Mikroskopi blev udført i laboratoriet for konfokal og fluorescens mikroskopi medfinansieret af Den Europæiske Fond for Regionaludvikling og den tjekkiske statsbudget, projekter nr. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 og CZ.2.16/3.1.00/21515, og støttet af det tjekkiske BioImaging store RI-projekt LM2015062.

1. Forberedelse af nær-infrarøde udsender AuNC'er (1)
<ol><li>Der tilsættes 7,8 mg (37,8 μmol) thioctisk syre (TA) og 60 μL på 2 M NaOH til 23,4 ml ultrarent vand (resistivitet 18,2 MΩ.cm ved 25 °C) og omrøres (mindst 1.000 omdr./min.), indtil det opløses helt (~15-20 min). For hurtigere opløsning af TA, sonikere blandingen. Til syntesen anbefales frisklavet TA-opløsning.</li>
	<li>10,2 μL HAuCl4·3H2O (470 mg/ml) af vandig opløsning tilopløsningen.</li>
	<li>Efter 15 min tilsættes...

NIR-udsender AuNC'er blev syntetiseret ved hjælp af en bottom-up-metode, hvor guldprækursoropløsningen (HAuCl4) blev behandlet med egnede thiolligands efterfulgt af en reduktion af Au3+. Reduktion af metalioner i vandig opløsning har tendens til at samle og resulterer i store nanopartikler i stedet for ultrasmå NCs21. For at forberede ultrasmå (≤2 nm) PL AuNC'er blev de syntetiske forhold justeret for at forhindre dannelse af store partikler og fremme dannelsen af ult...

I det seneste årti har ultrasmå (≤ 2 nm) fotoluminescerende guldnanoklynger (PL AuNC'er) vist sig at være lovende sonder til både grundforskning og praktiske anvendelser1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Deres mange ønskelige egenskaber omfatter høj fotostabilitet, afstemmelige emissionsmaksima, lange emissionslevetider, store Stokes skift, lav toksicitet, god biokompatibilitet, nyreclearance og letkøbt biokonjugering. PL AuNC'er kan levere fotoluminescens fra det blå til det nær-infrarøde (NIR) spektrale område, afhængigt af antallet af atomer i klyngen11 og overfladens art ligand12. NIR (650-900 nm) udsender AuNC'er er særligt lovende for langsigtede in vitro og in vivo billeddannelse af celler og væv, da de tilbyder høj signal-støj-forhold på grund af minimal overlapning med iboende autofluorescens, svagere spredning og absorption, og høj væv penetration af NIR lys13,14.
I de senere år er der udviklet forskellige tilgange , der udnytter Au-S's kovalente interaktioner til at forberede NIR-PL AuNCs udjævnet med en række thiolholdige ligander13,15,16,17. Til biomedicinske anvendelser skal AuNC'er funktionaliseres med en biologisk komponent for at lette bindende interaktioner. Således aunccs med høj kolloid stabilitet, der er let funktionsdygtige i vandigopløsningsmiddel er meget ønskeligt. Det overordnede mål med den nuværende protokol er at beskrive et tidligere rapporteret18 præparat af AuNC'er med en funktionaliserbar carboxylsyregruppe på overfladen ved at anvende thioctisk syre og polyethylenglycol (PEG) i et vandigt miljø og deres bøjning med molekyler, der bærer en primær amin efter syreaminkoblingsmetoden. På grund af den lette syntese og høje reproducerbarhed, kan denne protokol bruges og tilpasses af forskere fra ikke-kemiske baggrunde.
En af de vigtigste forudsætninger for anvendelse af AuNC'er i biomedicinsk forskning er evnen til at observere og måle AuNC'er inde i celler. Blandt de metoder til rådighed til at overvåge nanopartikel optagelse af celler, flow cytometri (FCM) og konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) tilbyder robuste, høj-throughput metoder, som giver mulighed for hurtige målinger af internalisering af fluorescerende nanomaterialer i stort antal celler19. Her er FCM- og CLSM-metoden til direkte måling og analyse af PL AuNC'er i celler, uden behov for yderligere farvestoffer, også blevet præsenteret.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D1601</td>
			<td>https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4161</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&#38;region=CZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>15130-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Thioctic acid, 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04711</td>
			<td>https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 35%</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>19350-11000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36400</td>
			<td>https://www.alfa.com/en/catalog/036400/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(2-Mercaptoethyl)-O&#8242;-methylpolyethylene glycol 2000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>743127</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&#38;region=CZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>16200-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&#38;region=CZ&#38;gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>16610-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>12330-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>15740-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X12223</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of near-infrared emitting gold nanoclusters for biological applications

I løbet af det seneste årti har fluorescerende guld nanoclusters (AuNCS) været vidne til stigende popularitet i biologiske applikationer og enorme indsats har været afsat til deres udvikling. I denne protokol er en nyligt udviklet, letkøbt metode til fremstilling af vandopløselige, biokompatible og i daglige stabile nær-infrarøde udleder AuNC'er blevet beskrevet i detaljer. Denne rum-temperatur, bottom-up kemisk syntese giver let funktionsdygtige AuNC'er udjævnet med thioctisk syre og thiol-modificeret polyethylenglycol i vandig opløsning. Den syntetiske tilgang kræver hverken organiske opløsningsmidler eller yderligere ligandudveksling eller omfattende viden om syntetisk kemi for at reproducere. De resulterende AuNC'er tilbyder gratis overfladecarboxylsyrer, som kan funktionaliseres med forskellige biologiske molekyler, der bærer en gratis amingruppe uden at påvirke AuNC'ernes fotoluminescerende egenskaber negativt. En hurtig, pålidelig procedure for flow cytometrisk kvantificering og konfokal mikroskopisk billeddannelse af AuNC optagelse af HeLa celler også blevet beskrevet. På grund af den store Stokes skift, korrekt indstilling af filtre i flow cytometri og konfokal mikroskopi er nødvendig for effektiv påvisning af nær-infrarød fotoluminescens af AuNC'er.

NIR PL AuNCs blev udarbejdet fra Au3+ i overværelse af TA, og derefter thiol-opsagt PEG (MW 2.000) var bundet på AuNC overfladen for at opnå 1 efter arbejdsgangen vist i figur 1. Amidisk kobling mellem 1 og 3-(aminopropyl) triphenylphosphonium (TPP) bromid forudsat 2. Som forventet viste absorptionsspektre (figur 2a), at AuNC1 1 og 2 ikke har et karakteristisk plas...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications at JoVE.com

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

En pålidelig og let reproducerbar metode til fremstilling af funktionaliserbare, nær-infrarøde udsender fotoluminescerende guld nanoclusters og deres direkte detektion inde HeLa celler ved flow cytometri og konfokal laser scanning mikroskopi er beskrevet.

Syntese af nær-infrarøde udsender guld nanoklynger til biologiske anvendelser

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Dette er en simpel protokol til syntese af funktionelle, nær-infrarød udsender fotoluminescerende guld nanoklusiner og deres detektion ved hjælp af en kommerciel opsætning. En af de store fordele ved denne teknik er, at fastgørelsen af thiol-funktionaliseret ligand og kobling af amin-funktionaliseret ligand på overfladen af guld nanoklynger ikke påvirker fotoluminescerende egenskaber og spole stabilitet. Det kan forestilles, at kombinationen af intense fotoluminescensegenskaber og bøjning med biomolekyler vil gøre det muligt at in vitro-detektion af lavkoncentrations anilider, biosensing, opløselighed og bioafbildning.Demonstration af proceduren vil være Klaudia Kvakova, min ph.d.-studerende. Flowcytometrien vil blive demonstreret af forskningsassistent Alzbeta Magdolenova. Den mikroskopiske del vil blive demonstreret af Vaclav Bocan, en grad studerende fra Lenka Libusova Laboratory.Start med at tilsætte 7,8 milligram thioctic syre i 60 mikroliter af to-molar natriumhydroxid til 23,4 milliliter ultrarent vand og omrøring blandingen indtil helt opløst. Dernæst tilsættes 10,2 mikrokludatorer af hydrogentrachlorsyre til opløsningen og tilsættes efter 15 minutter 480 mikroliter frisklavet natriumborohydrid under kraftig omrøring. Fortsæt omrøring reaktionen blandingen natten over.På den næste dag, rense opløsningen ved hjælp af tre cyklusser af ultrafiltrering med en molekylvægt cut-off på tre kilodaltons, derefter tilføje 15,6 milligram thiol-afsluttet polyethylenglycol til opløsningen, justere pH til mellem 7 og 7,5, og rør blandingen natten over for at opnå nanoklyster 1. Den følgende dag gentages de tre centrifugerings- og filtreringscyklusser for at rense spredningen. Bland nanoklynge 1-opløsningen med TPP, og juster derefter pH-1-1-1 til 4,5 med en-molar hydrogenchlorid.Start reaktionen ved at tilsætte et overskud af EDC HCL og overvåge pH af blandingen for den første time. Hvis pH-chlorid stiger over seks, reduceres den ved at tilsætte hydrogenchlorid. Rør reaktionsblandingen natten over ved stuetemperatur.På den næste dag udføres tre cyklusser af centrifugering og filtrering som tidligere beskrevet for at opnå nanoklusion 2. Fortyndes 2 med ultrarent vand til et volumen på 24 milliliter. Frø cellerne i en 12-brønd plade på en tæthed på 20,000 celler pr brønd.Inkuber dem i 48 timer, derefter aspirere mediet og tilsæt 400 mikroliter af komplet kulturmedium med eller uden 500 mikrogram nanopartikler pr. brønd. Returner cellerne til 37-grader Celsius inkubator for nanocluster internalisering. Efter to timer skal cellerne løsnes med standard trypsinisering.Saml dem i polypropylen mikrocentrifuge rør og centrifuge i fem minutter ved 350 gange g og fire grader Celsius. Forbered FCM buffer i henhold til manuskript retninger og bruge en milliliter af bufferen til at vaske cellen pellets. Centrifuge cellerne i yderligere fem minutter, derefter resuspend dem i 500 mikroliter af FCM buffer og gemme dem på fire grader Celsius.Før prøven anskaffes, skal du sørge for, at instrumentet har den tilsvarende optiske konfiguration. Placer 780 over 60 bandpass filter foran 405A detektoren. Alle prøver filtreres ved hjælp af et polystyrenrør med fem milliliter med en cellesalthætte.Angiv cytometerkonfigurationen. Plot en to-parameter prik plot af FSC-A og SSC-A for at vise fordelingen af celler. Hvis du vil udelukke doubler, skal du oprette et prikplot med to parametre FSC-H versus FSC-A og afbilde et histogram med en enkelt parameter for fluorescerende kanalområdet for at overvåge den relative fluorescensintensitet i prøven.Anskaf ubehandlet prøve ved en lav strømningshastighed for at minimere tilfældige hændelser. Under overtagelsen justeres PMT-spændingerne for at få den ubehandlede befolkning på skalaen på FSC versus SSC-plottet. Hvis det er nødvendigt, skal du justere PMT-spændingerne for FL-kanalen for at placere den ikke-indgroede population i venstre hjørne af histogrammet.Vælg derefter den specifikke gatefane i softwaren, og tegn en passende port rundt om den ønskede population. Cellerne inde i porten vil flytte til det næste checkpoint. Konfigurer eksperimentet, og post dataene.Ved 24 timer efter såning tilsættes 100 mikrogram 2 til hvert skålkammer, der indeholder 0,5 milliliter medium med HeLa-celler. Returner skålen til rugemaskinen og lad cellerne internalisere nanoklyngerne, derefter kassere mediet og vaske cellerne med forvarmet, frisk medium. Fyld hvert kammer med 800 mikroliter frisk medium og fortsæt med billeddannelse.For at afbilde cellerne skal du bruge et konfokalt mikroskop med Plan-APOCHROMAT og en 63x oliemållinse. Monter skålen på den omvendte scene med kammeret varmet op til 37 grader Celsius og leveres med en befugtet, 5% kuldioxid atmosfære. Detekter internaliserede guldnanoklynger ved hjælp af en 405-nanometerlaser indstillet til 2% effekt med en passende strålesplitter, der indstiller rækken af detektionsbølgelængder mellem 650 og 760 nanometer.Indstil billedets opløsning til 2048 med 2048 pixel. I anskaffelseshastighedsindstillingen skal du sigte mod en pixelbop-tid omkring fire mikrosekunder og erhverve billedet med to gange i gennemsnit, derefter indstille pinhole til en områdeenhed og, for højere følsomhed, bruge fotontællingstilstanden. For korrekt belysning og transmitteret lys med DIC brug Kohler's indstilling af kondensatoren og feltet stop.For at erhverve transmitteret lys, skal du bruge en 488-nanometer laser på 0,7% magt uden nogen fluorescens detektor tildelt, og sørg for at indstille en passende stråle splitter til laser bølgelængde. Absorptionsspektre indikerede, at guldnanoklynge 1 og 2 ikke har et karakteristisk overfladeplasmonbånd og udviser bred emission fra 550 til 850 nanometer. Fotoluminescens stærkt steget efter fastgørelse af TPP til overfladen af 1.Emission fra nanoklyngerne var også synlig under et 365-nanometer UV-lys. Emissionen var stabil, og dens bølgelængde var uafhængig af excitation bølgelængde, men intensiteten var maksimal, når ophidset med UV-lys. Flow cytometri blev brugt til at bekræfte nanocluster 2 optagelse af HeLa celler.Nær fluorescens var afhængig af både inkubationstid og koncentration af nanoklynge 2. Guld nanoclusters i celler blev afbildet noninvasively med en standard konfokal laser scanning mikroskop. Cellerne blev plettet med nanoklynge 2, og efter 24 timers inkubation blev der observeret lys rød fotoluminescens inde i cellerne.Når du forsøger denne protokol, er det vigtigt at huske, at fjernelsen af ureageret og hydrolyseret natriumborohydrid er meget vigtigt, ellers thiolated polyethylenglycol vil ikke binde sig til overfladen af guld nanocluster. Derudover starter fotoluminescensen af guldnannanclusters fra 560 nanometer. For at undgå baggrunden autofluorescerende i konfokale mikroskopi eksperimenter, bør fotoner indsamles over 650 nanometer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

Guld Nanostar Syntese med en Silver Seed medierede væksthæmning Metode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Wideband optisk detektor af ultralyd til medicinsk billedbehandling

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

På stedet TEM af biologiske samlinger i væske

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-quenching af et liposomalt indkapslet Near-infrarøde fluorofor som et værktøj til<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Syntese af Keratin-baserede Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Syntese af Gold Nanopartikel Integrated Foto-responsive Liposomer og måling af deres Mikroboble Kavitation på Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Selektiv Cell Elimination fra Mixed 3D Kultur Ved hjælp af en i nærheden af ​​infrarød Photoimmunotherapy Teknik

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Udarbejdelse af Silicon nanotrådene Field-effekt Transistor for Kemiske og biosensorer Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...