Name: synthesis of near-infrared emitting gold nanoclusters for biological applications
Uploaded: 2020-03-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications at JoVE.com

De auteurs zijn Alzbeta Magdolenova dankbaar voor haar hulp bij flow cytometrie. De auteurs erkennen de financiële steun van GACR project Nr. 18-12533S. Microscopie werd uitgevoerd in het Laboratorium voor Confocale en Fluorescentie Microscopie mede gefinancierd door het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling en de staatsbegroting van de Tsjechische Republiek, projecten nr. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 en CZ.2.16/3.1.00/21515, ondersteund door het Tsjechisch-BioImaging grote RI-project LM2015062.

1. Voorbereiding van nabij-infrarode emitterende AuNOCs (1)
<ol><li>Voeg 7,8 mg (37,8 μmol) thioctisch zuur (TA) en 60 μL van 2 M NaOH toe tot 23,4 mL ultrazuiver water (weerstand 18,2 MΩ.cm bij 25 °C) en roer (ten minste 1.000 tpm) tot het volledig oplost (~15-20 min). Voor een snellere ontbinding van TA, sonicate het mengsel. Voor de synthese wordt een vers bereide TA-oplossing aanbevolen.</li>
	<li>Voeg 10,2 μL HAuCl4·3H2O (470 mg/mL) waterige oplossing toe aan de oplossing.</li>
	<li>Voe...

NIR-emitterende AuNO's werden gesynthetiseerd met behulp van een bottom-up benadering waarbij de goudprecursoroplossing (HAuCl4)werd behandeld met geschikte thiolliganden, gevolgd door reductie van Au3+. Vermindering van metaalionen in waterige oplossing hebben de neiging om te aggregeren en resulteert in grote nanodeeltjes in plaats van ultrakleine NC's21. Om ultrakleine PL AuNCs (≤2 nm) voor te bereiden, werden de synthetische omstandigheden aangepast om de vorming van gr...

In de afgelopen tien jaar zijn ultrakleine (≤ 2 nm) fotoluminescente goudnanoclusters (PL AuNC's) naar voren gekomen als veelbelovende sondes voor zowel fundamenteel onderzoek als praktische toepassingen1,2,33,4,5,,67,8,8,9,10. Hun vele wenselijke kenmerken zijn hoge fotostabiliteit, tunable emissie maxima, lange emissie levensduur, grote Stokes verschuivingen, lage toxiciteit, goede biocompatibiliteit, nierklaring en facile bioconjugatie. PL AuNC's kunnen fotoluminescentie van het blauwe naar het spectrale gebied (NEAR-infrared (NIR) leveren, afhankelijk van het aantal atomen binnen cluster11 en de aard van het oppervlak ligand12. NIR (650-900 nm) die AuNC's uitzenden zijn bijzonder veelbelovend voor langdurige in vitro en in vivo beeldvorming van cellen en weefsels, omdat ze een hoge signaal-ruisverhouding bieden als gevolg van minimale overlap met intrinsieke autofluorescentie, zwakkere verstrooiing en absorptie, en hoge weefselpenetratie van NIR-licht13,14.
In de afgelopen jaren zijn verschillende benaderingen ontwikkeld die gebruik maken van covalente interacties van Au-S om NIR-PL AuNC's voor te bereiden, afgetopt met een verscheidenheid aan thiolbevattende liganden13,15,16,17. Voor biomedische toepassingen moeten AuNC's worden gefunctionaliseerd met een biologische component om bindende interacties te vergemakkelijken. AuNC's met een hoge colloïdale stabiliteit die gemakkelijk te functionaliseren zijn in waterig oplosmiddel, zijn dus zeer wenselijk. Het algemene doel van het huidige protocol is om een eerder gerapporteerde18 preparaat van AuNOCs met een functionalizable carboxylic zuurgroep op het oppervlak te beschrijven door thioctisch zuur en polyethyleenglycol (PEG) in een waterige omgeving in detail te gebruiken en hun vervoegingsmoleculen met een primaire amine volgens de zuur-aminekoppelingsmethode. Vanwege het gemak van synthese en hoge reproduceerbaarheid, kan dit protocol worden gebruikt en aangepast door onderzoekers met een niet-chemische achtergrond.
Een van de belangrijkste vereisten voor toepassingen van AuNC's in biomedisch onderzoek is de mogelijkheid om AuNC's in cellen te observeren en te meten. Onder de beschikbare methoden om de opname van nanodeeltjes door cellen te monitoren, bieden flow cytometrie (FCM) en confocale laserscanmicroscopie (CLSM) robuuste, hoge doorvoermethoden die snelle metingen van internalisatie van fluorescerende nanomaterialen in een groot aantal cellen mogelijk maken19. Hier zijn ook FCM- en CLSM-methode voor directe meting en analyse van PL AuNC's in cellen gepresenteerd, zonder dat extra kleurstoffen nodig zijn.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D1601</td>
			<td>https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4161</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&#38;region=CZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>15130-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Thioctic acid, 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04711</td>
			<td>https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 35%</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>19350-11000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36400</td>
			<td>https://www.alfa.com/en/catalog/036400/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(2-Mercaptoethyl)-O&#8242;-methylpolyethylene glycol 2000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>743127</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&#38;region=CZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>16200-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&#38;region=CZ&#38;gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>16610-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>12330-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>15740-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X12223</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of near-infrared emitting gold nanoclusters for biological applications

In de afgelopen tien jaar, fluorescerende goud nanoclusters (AuNCs) zijn getuige van een groeiende populariteit in biologische toepassingen en enorme inspanningen zijn gewijd aan hun ontwikkeling. In dit protocol is een onlangs ontwikkelde, facile methode voor de bereiding van in water oplosbaar, biocompatibel en colloïdaally stabiel nabij-infrarood uitzendende AuNC's in detail beschreven. Deze kamertemperatuur, bottom-up chemische synthese biedt gemakkelijk functionalizable AuNOCs bedekt met thioctisch zuur en thiol-gemodificeerde polyethyleenglycol in waterige oplossing. De synthetische aanpak vereist noch organische oplosmiddelen of extra ligand uitwisseling, noch uitgebreide kennis van synthetische chemie te reproduceren. De resulterende AuNOCs bieden vrije oppervlakte carboxylic zuren, die kunnen worden gefunctionaliseerd met verschillende biologische moleculen met een vrije amine groep zonder nadelige gevolgen voor de fotoluminescente eigenschappen van de AuNOCs. Een snelle, betrouwbare procedure voor flow cytometrische kwantificering en confocale microscopische beeldvorming van AuNC opname door HeLa cellen ook beschreven. Door de grote Stokes-verschuiving is een goede instelling van filters in stromingscytometrie en confocale microscopie noodzakelijk voor een efficiënte detectie van nabij-infrarood fotoluminescentie van AuNC's.

NIR PL AuNCs werden bereid van Au3+ in aanwezigheid van TA, en vervolgens thiol-beëindigd PEG (MW 2.000) was gebonden op het AuNC-oppervlak om 1 te verkrijgen volgens de workflow in figuur 1. Amidic koppeling tussen 1 en 3-(aminopropyl) triphenylfosphonium (TPP) bromide verstrekt 2. Zoals verwacht gaven absorptiespectra (figuur 2a)aan dat AuNOCs 1 en 2 geen karakteri...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications at JoVE.com

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Een betrouwbare en gemakkelijk reproduceerbare methode voor de voorbereiding van functionalizable, nabij-infrarood uitzendende fotoluminescente goudnanoclusters en hun directe detectie in HeLa-cellen door stromingscytometrie en confocale laserscanningmicroscopie wordt beschreven.

Synthese van near-infrared emitting gold nanoclusters voor biologische toepassingen

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Dit is een eenvoudig protocol voor de synthese van functionalizable, nabij-infrarood emitterende fotoluminescente gouden nanoclusters en hun detectie met behulp van een commerciële setup. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek is dat de bevestiging van thiol-gefunctionaliseerde ligand en de koppeling van amine-gefunctionaliseerde ligand op het oppervlak van gouden nanoclusters geen negatieve invloed heeft op de fotoluminescente eigenschappen en spoelstabiliteit. Het kan worden overwogen dat de combinatie van intense fotoluminescentie eigenschappen en vervoeging met biomoleculen zal zorgen voor de in vitro detectie van lage concentratie anilides, biosensing, solubling, en bio-imaging.Het aantonen van de procedure zal Klaudia Kvakova, mijn promovendus. De stromingscytometrie wordt gedemonstreerd door onderzoeksassistent Alzbeta Magdolenova. Het microscopische deel zal worden aangetoond door Vaclav Bocan, een grad student van Lenka Libusova Laboratory.Begin met het toevoegen van 7,8 milligram thioctisch zuur in 60 microliter natriumhydroxide van twee kiezen aan 23,4 milliliter ultrazuiver water en het roeren van het mengsel tot het volledig is opgelost. Voeg vervolgens 10,2 microliter waterstoftetrachlorauraat toe aan de oplossing en voeg na 15 minuten 480 microliter vers bereide natriumboorhydride toe terwijl u krachtig roert. Blijf het reactiemengsel 's nachts roeren.Op de volgende dag, zuiveren van de oplossing met behulp van drie cycli van ultrafiltratie met een moleculair gewicht cut-off van drie kilodaltons, voeg vervolgens 15,6 milligram thiol-beëindigde polyethyleenglycol aan de oplossing, pas de pH aan tussen 7 en 7,5, en roer het mengsel 's nachts om nanocluster 1 te verkrijgen. Herhaal de volgende dag de drie cycli van centrifugatie en filtratie om de dispersie te zuiveren. Meng de nanocluster 1-oplossing met TPP en pas de pH aan op 4,5 met een molaire waterstofchloride.Start de reactie door het toevoegen van een overmaat van EDC HCL en controleer de pH van het mengsel voor het eerste uur. Als de pH boven de zes toeneemt, verklein deze dan door waterstofchloride toe te voegen. Roer het reactiemengsel 's nachts op kamertemperatuur.Voer de volgende dag drie cycli van centrifugatie en filtratie uit zoals eerder beschreven om nanocluster 2 te verkrijgen. Verdun 2 met ultrazuiver water tot een volume van 24 milliliter. Zaad de cellen in een 12-well plaat bij een dichtheid van 20.000 cellen per put.Broed ze 48 uur uit, vervolgens het medium aanzuigen en voeg 400 microliters van compleet kweekmedium toe met of zonder 500 microgram nanodeeltjes per put. Breng de cellen terug naar de 37 graden Celsius incubator voor nanocluster internalisatie. Na twee uur, los de cellen met standaard trypsinisatie.Verzamel ze in polypropyleen microcentrifugebuizen en centrifuge gedurende vijf minuten bij 350 keer g en vier graden Celsius. Bereid FCM buffer volgens manuscript aanwijzingen en gebruik een milliliter van de buffer om de cel pellets te wassen. Centrifuge de cellen voor nog eens vijf minuten, dan resuspend ze in 500 microliters van de FCM buffer en bewaar ze op vier graden Celsius.Voordat het monster wordt geacquisd, moet u ervoor zorgen dat het instrument de bijbehorende optische configuratie heeft. Plaats de 780 over 60 bandpass filter voor de 405A detector. Filter alle monsters met behulp van een vijf-milliliter polystyreen ronde bodem buis met een cel zeef dop.Geef de cytometerconfiguratie op. Plot een dotplot met twee parameters van de FSC-A en SSC-A om de verdeling van cellen weer te geven. Als u doublets wilt uitsluiten, maakt u een dotplot met twee parameters van FSC-H versus FSC-A en plott u een histogram met één parameter voor het fluorescerende kanaalgebied om de relatieve fluorescentieintensiteit in het monster te controleren.Verkrijg onbehandeld monster bij een lage stroomsnelheid om toevallige gebeurtenissen te minimaliseren. Pas tijdens de overname de PMT-spanningen aan om de onbehandelde populatie op schaal op het FSC versus SSC-perceel te krijgen. Pas indien nodig de PMT-spanningen voor het FL-kanaal aan om de niet-gekleurde populatie op de linkerhoek van het histogram te plaatsen.Selecteer vervolgens het specifieke tabblad Poort in de software en teken een geschikte poort rond de gewenste populatie. De cellen in de poort gaan naar het volgende controlepunt. Stel het experiment in en neem de gegevens op.Voeg na 24 uur zaaien 100 microgram van 2 toe aan elke schotelkamer met 0,5 milliliter medium met HeLa-cellen. Breng de schotel terug naar de couveuse en laat de cellen de nanoclusters internaliseren, gooi het medium weg en was de cellen met voorverwarmd, vers medium. Vul elke kamer met 800 microliter vers medium en ga verder met beeldvorming.Om de cellen in beeld te brengen, gebruikt u een confocale microscoop met Plan-APOCHROMAT en een 63x olie-objectieve lens. Monteer de schotel op het omgekeerde podium met de kamer opgewarmd tot 37 graden Celsius en voorzien van een bevochtigde, 5%kooldioxide atmosfeer. Detecteer geïnternaliseerde gouden nanoclusters met behulp van een laser van 405 nanometer die is ingesteld op 2%-vermogen met een geschikte bundelsplitser, waarbij het bereik van detectiegolflengten tussen 650 en 760 nanometer wordt ingesteld.Stel de resolutie van de afbeelding in op 2048 bij 2048 pixels. In de instelling voor de aanschafsnelheid moet u streven naar een pixeltijd van ongeveer vier microseconden en het beeld met twee keer gemiddeld verkrijgen, stelt u het gaatje in op één gebiedseenheid en gebruikt u voor een hogere gevoeligheid de fotontelmodus. Voor correcte verlichting en uitgezonden licht met DIC gebruik Kohler's instelling van de condensor en veld stop.Om uitgezonden licht te verkrijgen, gebruik dan een 488-nanometer laser op 0,7%-vermogen zonder dat een fluorescentiedetector is toegewezen, om ervoor te zorgen dat een geschikte bundelsplitser voor de lasergolflengte wordt ingesteld. Absorptiespectra gaf aan dat gouden nanoclusters 1 en 2 geen karakteristieke oppervlakteplasmonband hebben en een brede emissie vertonen van 550 tot 850 nanometer. De fotoluminescentie sterk verhoogd na gehechtheid van TPP aan de oppervlakte van 1.De emissie van de nanoclusters was ook zichtbaar onder een 365-nanometer UV-licht. De emissie was stabiel en de golflengte was onafhankelijk van de opwinding golflengte, maar de intensiteit was maximaal wanneer opgewonden met UV-licht. Flow cytometrie werd gebruikt om nanocluster 2 opname door HeLa cellen te bevestigen.In de buurt van fluorescentie was afhankelijk van zowel incubatietijd en concentratie van nanocluster 2. De gouden nanoclusters in cellen werden niet-invasief afgebeeld met een standaard confocale laserscanmicroscoop. De cellen werden bevlekt met nanocluster 2 en, na 24 uur van incubatie, heldere rode fotoluminescentie werd waargenomen in de cellen.Bij een poging tot dit protocol is het belangrijk om te onthouden dat het verwijderen van ongereacteerd en gehydrolyseerd natriumbohydride erg belangrijk is, anders zal thiolische polyethyleenglycol zich niet binden aan het oppervlak van gouden nanocluster. Bovendien begint de fotoluminescentie van gouden nanoclusters vanaf 560 nanometer. Om te voorkomen dat de achtergrond autofluorescentie in confocale microscopie experimenten, de fotonen moeten worden verzameld boven 650 nanometer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Synthese, Vergadering, en de karakterisatie van monolaag Protected gouden nanodeeltjes Films voor eiwit monolaag Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

Goud Nanostar Synthese met een Silver Zaad gemedieerde groei Methode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Wideband Optische Detector van Echografie voor Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Ter plaatse TEM van biologische assemblages in vloeistof

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Synthese van Keratine-gebaseerde Nanovezel voor Biomedische Technologie

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Synthese van gouden nanodeeltjes geïntegreerde Photo-responsieve liposomen en waardering van hun Microbel Cavitatie bij Pulse Laser Excitatie

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Selectieve Cell Eliminatie van Gemengde 3D Cultuur Met behulp van een Near Infrared Photoimmunotherapy Techniek

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Bereiding van silicium Nanowire veldeffecttransistor voor chemische en biosensoren toepassingen

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...