Name: synthesis of near-infrared emitting gold nanoclusters for biological applications
Uploaded: 2020-03-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications at JoVE.com

Les auteurs sont reconnaissants à Alzbeta Magdolenova pour son aide avec la cytométrie du flux. Les auteurs reconnaissent le soutien financier du projet Nr. 18-12533S du GACR. La microscopie a été réalisée au Laboratoire de microscopie confocale et fluorescence cofinancée par le Fonds européen de développement régional et le budget de l’Etat de la République tchèque, projets non. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 et CZ.2.16/3.1.00/21515, et soutenu par le grand projet tchèque-BioImaging LM2015062.

1. Préparation des auNC électroluminescents électroluminescents (1)
<ol><li>Ajouter 7,8 mg (37,8 kmol) d’acide thioctique (TA) et 60 ll de 2 M NaOH à 23,4 ml d’eau ultrapure (résistance 18,2 M.cm à 25 oC) et remuer (au moins 1 000 tr/min) jusqu’à ce qu’il se dissout complètement (15-20 min). Pour une dissolution plus rapide de TA, sonicate le mélange. Pour la synthèse, une solution TA fraîchement préparée est recommandée.</li>
	<li>Ajouter 10,2 L de HAuCl4'3H2O (470 mg/mL) de...

Les AuNC émettant du NIR ont été synthétisés à l’aide d’une approche ascendante dans laquelle la solution de précurseur d’or (HAuCl4) a été traitée avec des ligands thiol appropriés, suivis d’une réduction de Au3 . La réduction des ions métalliques dans la solution aqueuse ont tendance à s’agréger et se traduit par de grandes nanoparticules plutôt que des NCs ultrasmall21. Pour préparer les AUCN PL ultrasmall (2 nm), les conditions synthétiques on...

Au cours de la dernière décennie, ultrasmall (2 nm) nanoclusters d’or photoluminescents (PL AuNC) ont émergé comme des sondes prometteuses pour la recherche fondamentale et les applications pratiques1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Leurs nombreuses caractéristiques souhaitables comprennent une photostabilité élevée, des maxima d’émissions de thon, de longues durées de vie d’émission, de grands changements stokes, une faible toxicité, une bonne biocompatibilité, un dégagement rénal et une bioconjugation facile. Les AUCN PL peuvent fournir une photoluminescence du bleu à la région spectrale proche infrarouge (NIR), selon le nombre d’atomes dans l’amas11 et la nature du ligand de surface12. NIR (650-900 nm) les AuCN émettant sont particulièrement prometteurs pour l’imagerie in vitro et in vivo à long terme des cellules et des tissus, car ils offrent un rapport signal-bruit élevé en raison d’un chevauchement minimal avec l’autofluorescence intrinsèque, une dispersion et une absorption plus faibles, et une pénétration élevée des tissus de la lumière NIR13,14.
Ces dernières années, diverses approches qui tirent parti des interactions covalentes Au-S ont été développées pour préparer les AUCN NIR-PL plafonnés à une variété de ligands contenant du thiol13,15,16,17. Pour les applications biomédicales, les AUNC doivent être fonctionnalisés avec un composant biologique pour faciliter les interactions contraignantes. Ainsi, les auNC avec une grande stabilité colloïdale qui sont facilement fonctionnables chez les solvants aqueux sont hautement souhaitables. L’objectif global du protocole actuel est de décrire une préparation précédemment rapportée de18 AuNC avec un groupe d’acide carboxylique fonctionnel sur la surface en employant l’acide thioctic et le polyéthylène glycol (PEG) dans un environnement aqueux en détail et leur conjugaison avec des molécules portant une amine primaire suivant la méthode d’accouplement acide-amine. En raison de la facilité de synthèse et de la haute reproductibilité, ce protocole peut être utilisé et adapté par des chercheurs issus de milieux non chimiques.
L’une des principales exigences pour les applications des AuNC dans la recherche biomédicale est la capacité d’observer et de mesurer les AUNC à l’intérieur des cellules. Parmi les méthodes disponibles pour surveiller l’absorption des nanoparticules par les cellules, la cytométrie des débits (FCM) et la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) offrent des méthodes robustes et à haut débit qui permettent des mesures rapides de l’internalisation des nanomatériaux fluorescents dans un grand nombre de cellules19. Ici, la méthode FCM et CLSM pour la mesure et l’analyse directes des PNC à l’intérieur des cellules, sans avoir besoin de colorants supplémentaires, ont également été présentées.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D1601</td>
			<td>https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4161</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&#38;region=CZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>15130-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Thioctic acid, 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04711</td>
			<td>https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 35%</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>19350-11000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36400</td>
			<td>https://www.alfa.com/en/catalog/036400/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(2-Mercaptoethyl)-O&#8242;-methylpolyethylene glycol 2000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>743127</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&#38;region=CZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>16200-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&#38;region=CZ&#38;gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>16610-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>12330-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>15740-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X12223</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of near-infrared emitting gold nanoclusters for biological applications

Au cours de la dernière décennie, les nanoamas d’or fluorescent (AUNC) ont connu une popularité croissante dans les applications biologiques et d’énormes efforts ont été consacrés à leur développement. Dans ce protocole, une méthode récemment développée et facile pour la préparation des AuNC solubles, biocompatibles et colloïde stables ont été décrites en détail. Cette synthèse chimique ascendante à température ambiante fournit des AUNC facilement fonctionnels recouverts d’acide thioctique et de polyéthylène glycol modifié au thiol dans une solution aqueuse. L’approche synthétique ne nécessite ni solvants organiques ni échange de ligands supplémentaires, ni connaissance approfondie de la chimie synthétique pour se reproduire. Les AuNC qui en résultent offrent des acides carboxyliques de surface gratuits, qui peuvent être fonctionnalisés avec diverses molécules biologiques portant un groupe d’amine libre sans nuire aux propriétés photoluminescentes des AuNC. Une procédure rapide et fiable pour la quantification cytométrique de flux et la formation image microscopique confocale de l’absorption d’AuNC par les cellules de HeLa a également été décrite. En raison du grand changement de Stokes, un réglage approprié des filtres dans la cytométrie de débit et la microscopie confocienne est nécessaire pour une détection efficace de la photoluminescence proche infrarouge des AuNC.

NIR PL AuNCs ont été préparés à partir d’Au3 en présence de TA, puis LE PEG (MW 2 000) a été lié sur la surface d’AuNC pour obtenir 1 suite au flux de travail indiqué à la figure 1. Couplage amidique entre 1 et 3-(aminopropyl) triphenylphosphonium (TPP) bromure fourni 2. Comme prévu, les spectres d’absorption(figure 2a) ont indiqué que les AuCN 1 et 2</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications at JoVE.com

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Une méthode fiable et facilement reproductible pour la préparation de neurocomanes d’or photoluminescents fonctionnables et de leur détection directe à l’intérieur des cellules HeLa par cytométrie de flux et microscopie confocale de balayage laser est décrite.

Synthèse des nanoamas d’or électroluminescents électroluminescents pour les applications biologiques

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Il s’agit d’un protocole simple pour la synthèse de nanoamas photoluminescents photoluminescents fonctionnalisables et proche infrarouges et leur détection à l’aide d’une configuration commerciale. Un des principaux avantages de cette technique est que l’attachement du ligand thiol-fonctionnalisé et le couplage du ligand amine-fonctionnalisé sur la surface des nanoamas d’or n’affecte pas défavorablement les propriétés photoluminescentes et la stabilité de bobine. On peut envisager que la combinaison de propriétés intenses de photoluminescence et de conjugaison avec des biomolécules permettra la détection in vitro d’anilides à faible concentration, de biocapsage, de solubling et de bio-imagerie.Klaudia Kvakova, ma doctorante, démontrera la procédure. La cytométrie du débit sera démontrée par l’assistante de recherche Alzbeta Magdolenova. La partie microscopique sera démontrée par Vaclav Bocan, un étudiant diplômé du laboratoire Lenka Libusova.Commencez par ajouter 7,8 milligrammes d’acide thioctic dans 60 microlitres d’hydroxyde de sodium bi molaire à 23,4 millilitres d’eau ultrapure et en remuant le mélange jusqu’à dissolution complète. Ajouter ensuite 10,2 microlitres de tétraloraurate d’hydrogène à la solution et, après 15 minutes, ajouter 480 microlitres de borohydride de sodium fraîchement préparé tout en remuant vigoureusement. Continuer à remuer le mélange de réaction pendant la nuit.Le lendemain, purifier la solution à l’aide de trois cycles d’ultrafiltration avec une coupure de poids moléculaire de trois kilodaltons, puis ajouter 15,6 milligrammes de polyéthylène glycol thiol-terminé à la solution, ajuster le pH entre 7 et 7,5, et remuer le mélange pendant la nuit pour obtenir nanocluster 1. Le lendemain, répétez les trois cycles de centrifugation et de filtration pour purifier la dispersion. Mélanger la solution nanocluster 1 avec le TPP, puis ajuster le pH à 4,5 avec du chlorure d’hydrogène uni molaire.Commencez la réaction en ajoutant un excès de HCL EDC et surveillez le pH du mélange pendant la première heure. Si le pH dépasse six, réduisez-le en ajoutant du chlorure d’hydrogène. Remuer le mélange de réaction pendant la nuit à température ambiante.Le lendemain, effectuer trois cycles de centrifugation et de filtration comme décrit précédemment pour obtenir nanocluster 2. Diluer 2 avec de l’eau ultrapure à un volume de 24 millilitres. Ensemencer les cellules dans une plaque de 12 puits à une densité de 20 000 cellules par puits.Incubez-les pendant 48 heures, puis aspirez le milieu et ajoutez 400 microlitres de milieu de culture complet avec ou sans 500 microgrammes de nanoparticules par puits. Retournez les cellules à l’incubateur de 37 degrés Celsius pour l’internalisation nanocluster. Après deux heures, détachez les cellules avec la trypsinisation standard.Collectez-les dans des tubes de microcentrifugeuse en polypropylène et une centrifugeuse pendant cinq minutes à 350 fois g et quatre degrés Celsius. Préparez le tampon FCM selon les instructions manuscrites et utilisez un millilitre du tampon pour laver les granulés cellulaires. Centrifugez les cellules pendant encore cinq minutes, puis réutilisez-les dans 500 microlitres du tampon FCM et stockez-les à quatre degrés Celsius.Avant l’acquisition de l’échantillon, assurez-vous que l’instrument a la configuration optique correspondante. Placez le filtre 780 sur 60 bandpass devant le détecteur 405A. Filtrer tous les échantillons à l’aide d’un tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres avec un bouchon de passoire cellulaire.Spécifiez la configuration du cytomètre. Tracez une parcelle à points à deux paramètres du FSC-A et du SSC-A pour montrer la distribution des cellules. Pour exclure les doublets, créez une parcelle à points à deux paramètres de FSC-H contre FSC-A et tracez un histogramme à paramètres unique pour la zone du canal fluorescent afin de surveiller l’intensité relative de fluorescence de l’échantillon.Acquérir un échantillon non traité à un faible débit afin de minimiser les événements coïncidents. Lors de l’acquisition, ajuster les tensions pmt pour obtenir la population non traitée sur l’échelle sur la parcelle FSC par rapport à SSC. Si nécessaire, ajustez les tensions pmt pour le canal FL pour placer la population non tachée sur le coin gauche de l’histogramme.Sélectionnez ensuite l’onglet Gate spécifique dans le logiciel et dessinez une porte appropriée autour de la population désirée. Les cellules à l’intérieur de la porte se déplaceront vers le prochain point de contrôle. Configurez l’expérience et enregistrez les données.À 24 heures après l’ensemencement, ajouter 100 microgrammes de 2 à chaque chambre à vaisselle contenant 0,5 millilitres de milieu avec des cellules HeLa. Retourner le plat à l’incubateur et permettre aux cellules d’intérioriser les nanoamas, puis jeter le milieu et laver les cellules avec préchawarmed, milieu frais. Remplissez chaque chambre de 800 microlitres de milieu frais et procédez à l’imagerie.Pour imager les cellules, utilisez un microscope confocal avec Plan-APOCHROMAT et une lentille objectif huile 63x. Monter le plat sur la scène inversée avec la chambre réchauffée jusqu’à 37 degrés Celsius et fourni avec une atmosphère humidifiée, 5% de dioxyde de carbone. Détecter les nanoamas d’or intériorisés à l’aide d’un laser de 405 nanomètres réglé à 2 % de puissance avec un séparateur de faisceau approprié, en fixant la plage de longueurs d’onde de détection entre 650 et 760 nanomètres.Réglez la résolution de l’image à 2048 par 2048 pixels. Dans le réglage de la vitesse d’acquisition, visez un temps de vie pixel autour de quatre microsecondes et d’acquérir l’image avec deux fois la moyenne, puis réglez le sténopé à une unité de zone et, pour une sensibilité plus élevée, utilisez le mode de comptage photon. Pour un éclairage correct et une lumière transmise avec DIC, utilisez le réglage par Kohler du condenseur et de l’arrêt sur le terrain.Pour acquérir la lumière transmise, utilisez un laser de 488 nanomètres à 0,7 % de puissance sans aucun détecteur de fluorescence assigné, en vous assurant de régler un séparateur de faisceau approprié pour la longueur d’onde laser. Les spectres d’absorption ont indiqué que les nanoamas d’or 1 et 2 n’ont pas de bande de plasmon de surface caractéristique et montrent une large émission de 550 à 850 nanomètres. La photoluminescence a fortement augmenté après l’attachement du TPP à la surface de 1.L’émission des nanoamas était également visible sous une lumière UV de 365 nanomètres. L’émission était stable et sa longueur d’onde était indépendante de la longueur d’onde d’excitation, mais l’intensité était maximale lorsqu’elle était excitée par la lumière UV. La cytométrie d’écoulement a été employée pour confirmer l’absorption de nanocluster 2 par des cellules d’HeLa.La quasi-fluorescence dépendait à la fois du temps d’incubation et de la concentration du nanoclusteur 2. Les nanoamas d’or dans les cellules ont été photographiés non invasivement avec un microscope à balayage laser confocal standard. Les cellules ont été tachées de nanocluster 2 et, après 24 heures d’incubation, la photoluminescence rouge vif a été observée à l’intérieur des cellules.Lorsque l’on tente ce protocole, il est important de se rappeler que l’élimination du borohydride de sodium non réagi et hydrolysé est très importante, sinon le polyéthylène glycol thiolé ne se liera pas à la surface du nanoamas d’or. En outre, la photoluminescence des nanoamas d’or commence à partir de 560 nanomètres. Pour éviter l’autofluorescence de fond dans les expériences de microscopie confoccale, les photons doivent être recueillis au-dessus de 650 nanomètres.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Synthèse, l&#39;Assemblée, et caractérisation des nanoparticules Monocouche protégées Films d&#39;or pour Electrochimie monocouche de protéines

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Recherche

Bio-ingénierie

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

Or Nanostar synthèse avec une méthode de graines Silver croissance Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Wideband détecteur optique des ultrasons pour les applications d&#39;imagerie médicale

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM d’assemblages biologiques dans un liquide

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-trempe d&#39;un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie optique

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Synthèse de nanofibres à base de kératine de génie biomédical

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Synthèse de l&#39;or nanoparticules liposomes intégré photosensible et mesurer leur microbulles cavitation sur Pulse Laser excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Selective Cellule élimination de Mixed Culture 3D en utilisant une technique proche infrarouge Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Préparation de la Silicon Nanowire à effet de champ Transistor pour chimiques et les biocapteurs Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...