Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

ونشكر السيدة بيا ستير علي المساعدة التقنية الممتازة. يتم دعم m. فون ليلينفيلد-Toal من قبل مركز التحكم في الانتان والرعاية (وزاره التعليم والصحة الاتحادية المانيه ، BMBF ، FKZ 01E01002) والحرم الجامعي للبحوث InfectoGnostics (BMBF ، FKZ 13GW0096D). ويدعم ثي نغوك ماي هوانغ من قبل مدرسه جينا للاتصالات الميكروبية (Deutsche Forschنجوجيميندينشافت ، FKZ 214/2)

ويشمل هذا البروتوكول استخدام معاطف بافي البشرية التي تم الحصول عليها من معهد طب نقل الدم ، ومستشفي جامعه جينا والدماء الوريدية الطازجة المسحوبة من المرضي ، سواء بعد موافقه خطيه مستنيرة من المانحين وفقا لموافقه لجنه الأخلاقيات 4357-03/15.
1. اعداد الرشاشيات تبخير كونيديا
<o...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

ويقدم هذا البروتوكول طريقه تدفق سريع الخلوي لقياس التفاعل من ا. تبخير كونيديا مع عدد كبير من الكريات البيضاء البشرية الاساسيه التي ليس من الممكن في البروتوكولات المجهرية المشتركة. خلايا التصوير مع المجهر والعد يدويا كونيديا المستوعبة مرهقه ويمكن ان يتم واقعيا لبضع مئات من الخلايا ف?...

داء الرشاشيات الرئوي الغازي يشكل تهديدا كبيرا للمرضي الذين يعانون من نقص المناعة لان خيارات العلاج محدوده وناجحه فقط عند التشخيص المبكر ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدلات الوفاات1. العوامل المعدية هي كونيديا (جراثيم) من العفن الرشاشيات التبخير التي هي في كل مكان إلى معظم الموائل2. كونيديا يتم استنشاقها ، تمر عبر الخطوط الجوية ويمكن ان تدخل في النهاية الحويصلات الهوائية الرئوية. في البشر المناعي ، يتم مسح هذه الكونيديا من قبل الخلايا المناعية الفطرية مثل الكريات الوحيدة أو الضامة والمحببة العدلات ، التي تتناول (فاجوسيتوسي) وهضم مسببات الامراض3. كثرة المحببات مهمة لعلماء الاحياء المجهرية وعلماء المناعة بالمثل عند المهتمين بالتفاعلات بين المضيف والممرض. اختبارات المواجهة ، مثل المشاركة في حضانة الكريات البيضاء والكونيديا ، وغالبا ما تشمل وضع العلامات من الجراثيم بواسطة فلوريسئين أو مشتقه فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC). باستخدام المجهر ، فمن الواضح لتحديد الكونيديا الفلورية المستوعبة وتحديد الكونيديا المرفقة/الملتصقة ، علي الرغم من ان هذا النهج هو مرهق ومقيد واقعيا إلى بضع مئات من الخلايا4. ومع ذلك ، في التدفق الخلوي الذي يسمح بسهوله تحليل مئات آلاف من الخلايا في غضون دقائق ، تلطيخ التفاضلية من الكونيديا والملتصقة أمر حيوي. ولذلك ، العديد من البروتوكولات تعتمد علي الترلون الأزرق لإخماد fitc-الفلورية من الكونيديا الملتصقة5،6،7،8. نهج آخر هو استغلال الطاقة بالرنين الفلوري نقل بروميد ايثيديوم و fitc لتنبعث منها الأحمر بدلا من الفلورية الخضراء من تمسك كونيديا9,10,11. إذا كانت الأجسام المضادة المحددة متوفرة ، كما هو الحال بالنسبة لبعض البكتيريا ، يمكن ان تكون الجزيئات المرتبطة بالخلايا ملطخه مباشره ب12،13.
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لتقييم بسرعة وكميه كثرة المحببات من FITC-المسمي ا. تبخير كونيديا من قبل الكريات البيضاء البشرية جنبا إلى جنب مع المرفق من الجراثيم إلى الخلايا وعدم التفاعل من خلال توظيف الوفيكوسيانين (APC)-المضادة لل fitc الأجسام. كما يسمح الأسلوب للتحليل الخلوي تدفق في وقت واحد من علامات الخلية الأخرى التي يمكن استخدامها لتحليل منفصلة من كثرة الخلايا الاحاديه والعدلات من نفس العينة.
يمكن تطبيق البروتوكول لتوصيف سلالات الفطرية (علي سبيل المثال ، عده أنواع من الرشاشيات وغيرها من قوالب من جنس mucorales المقدمة هنا) والمسوخ بهم14 والبحوث المناعية علي البالعات ، مثل الكريات البيضاء من الافراد المناعية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

العدوى الرئوية الغازية من قبل العفن الرشاشيات التبخير يشكل تهديدا كبيرا للمرضي المناعي. يتم مسح الكونيديا الفطرية المستنشقة (الجراثيم) من الحويصلات الرئوية البشرية بواسطة الخلايا الفطرية و/أو العدلات. يوفر هذا البروتوكول قياسا سريعا وموثوقا به لندره الكريات بواسطة التدفق الخلوي باستخدام فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC)-المسمي كونيديا لاحتضان المشتركة مع الكريات البيضاء البشرية والمضادة اللاحقة مع الأضداد المناهضة لل FITC للسماح بالتمييز الداخلي والخلوي كونيديا. المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي توفر خدمه ، وامكانيه الجمع بين المقايسة مع تحليل الخلوية من علامات الخلية الأخرى من الفائدة ، والتحليل في وقت واحد من الخلايا الاحاديه والعدلات من عينه واحده وقابليتها للتطبيق علي الخلايا الأخرى التي تحمل الجدار الفطريات أو البكتيريا. تحديد النسب المئوية من الكريات البيضاء فاجوسيتوسينج يوفر وسيله لعلماء الاحياء المجهرية لتقييم ضراوة من الممرض أو للمقارنة بين الأنواع البرية الممرض والمسوخ وكذلك لعلماء المناعة للتحقيق في قدرات الكريات البيضاء البشرية لمكافحه مسببات الامراض.

في قياس ندره الكريات ا. تبخير كونيديا بواسطة خلايا الإنسان البشرية ، التمييز بين الاستيعاب الداخلي الحقيقي ومجرد التعلق كونيديا إلى الخلايا هو عقبه ، وخصوصا عندما يتعلق الأمر بطرق عاليه الانتاجيه مثل تدفق الخلوي. من أجل التغلب علي هذه العقبة ، ونحن نقدم بروتوكول سريع وموثوق بها علي أ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

يوفر هذا البروتوكول طريقه سريعة وموثوق بها لقياس كثرة المحببات من الرشاشيات التبخير كونيديا بواسطة الخلايا الاساسيه البشرية باستخدام التدفق الخلوي والتمييز بين ندره الكونيديا من مجرد التصاق إلى الكريات البيضاء.

قياس كثرة الفندره من الرشاشيات تبخير كونيديا من قبل الكريات البيضاء البشرية باستخدام تدفق الخلوي

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يقيس كميا phagocytosis من المسمى Aspergillus fumigateurs Conidia بواسطة الكريات البيض البشرية، جنبا إلى جنب مع تعلق كونيديا إلى الخلايا، وعدم التفاعل عن طريق تدفق الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يسهل التحليل السريع لعدد كبير من الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح وضع علامات الخلية بفصل تقييم العدلات والوحديات داخل نفس العينة.في أي يمكن استخدام هذه التقنية لتحليل الفطريات الأخرى ذات الصلة السريرية مثل Mucorales. بدلا من ذلك قد تستخدم خلايا الدم الحمراء والبلعات. لبدء هذا الإجراء، الرطب منشفة ورقية مع مطهر، ووضعها في مجلس الوزراء السلامة الحيوية.وضع لوحة من نمت Aspergillus fumigatus على رأس منشفة ورقية لمنع الإفراط في توزيع كونيديا متقلبة. إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.01٪ المنظفات على رأس الفطريات، واستخدام ملعقة Drigalski لنشر السائل على لوحة، وفرك قبالة كونيديا الملونة الداكنة. نقل تعليق كونيديا إلى 50 ملليلتر من خلال مصفاة 30 ميكرومتر, والتي سوف إزالة أي mycelia المتبقية.إضافة 10 ملليلتر آخر من برنامج تلفزيوني مع المنظفات إلى لوحة، ونشرها مع ملعقة، ونقلها إلى نفس الأنبوب من خلال مصفاة. المقبل، وإعداد حل معقمة من 0.1 كربونات الصوديوم الضرس، حل في برنامج تلفزيوني. وإعداد حل 0.1 ملليمولار من مسحوق FITC، في هذا المحلل كربونات الصوديوم.إعادة تعليق 100 مليون أو أقل كونيديا, في خمسة ملليلتر من هذا الحل FITC, في أنبوب 15 ملليلتر. احتضان في دوار في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لتضخم إلى كونيديا، resuspend فيتك المسمى كونيديا في خمسة ملليلتر من متوسطة RPMI، تكمل مع 10٪ FCS.واحتضان في دوار في 37 درجة مئوية للوقت المطلوب. في خزانة السلامة الحيوية، ضع خمسة ملليلترات من المعطف البافي في أنبوب 50 ملليلتر. ملء أنبوب مع عازلة EL، وعكس ثلاث مرات.احتضان أفقيا لمدة خمس إلى ثماني دقائق، حتى ظهور حليبي من الخليط يتحول واضحة. ثم، الطرد المركزي في 300 مرة G، وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تجاهل افراط و resuspend بيليه في ملليلتر واحد من عازلة EL عن طريق الأنابيب.إضافة 24 ملليلتر آخر من العازلة EL، وعكس الأنبوب عدة مرات. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تجاهل افراط و resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من وسائل الاعلام RPMI, تكملت مع 10٪ FCS.للبدء، نقل مليوني الكريات البيض وأربعة ملايين من FITC المسمى كونيديا في 1.5 ملليلتر من RPMI تكملها 10٪ FCS، إلى لوحة ثقافة 12-well. وتشمل السيطرة على الخلايا فقط مع عدم كونيديا، والسيطرة على الخلايا مع كونيديا unlaed. احتضان لوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطب، في 37 درجة مئوية للفترة المطلوبة من الوقت.عند اكتمال الحضانة، استخدم مكشطة الخلايا لحصاد الخلايا، ونقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر. أولاً، ضع 100 ميكرولترات من كل عينة وتحكم في بئر واحد من لوحة V-القاع 96-well. إضافة 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني يحتوي على اثنين من ملليلتر من EDTA للغسيل.للحصول على تعويض اللون، وضع مليون خلية دون كونيديا لكل لون، في آبار أخرى من لوحة. وتشمل بئر من الخلايا التي سيتم تركها غير مدربين. إضافة 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني يحتوي على اثنين من ملليلتر من EDTA إلى كل بئر للغسيل.بعد ذلك، غطي الطبق برقائق لاصقة، وطاردة مركزية بمعدل 300 مرة في درجة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم، إزالة احباط والتخلص من supernatant عن طريق عكس بسرعة وبقوة لوحة مرة واحدة فقط على الحوض، أو منشفة ورقية يمكن التخلص منها. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولترات من مزيج الأجسام المضادة، ومزيج جيد عن طريق الأنابيب.للحصول على تعويضات اللون، resuspend الخلايا المعنية في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تحتوي على اثنين من مللي ميللي من EDTA، وإضافة نوع واحد من الأجسام المضادة لكل بئر، في نفس الكمية المستخدمة في مزيج الأجسام المضادة. يُغطّى مع رقاقة لاصقة، ويحتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة الرقائق وأضف 150 ميكرولترات من PBS تحتوي على ميليمولار اثنين من EDTA إلى كل بئر للغسيل.تغطية لوحة مع احباط لاصقة مرة أخرى. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم إزالة احباط، والتخلص من supernatant عن طريق عكس بسرعة وبقوة لوحة على إما بالوعة أو منشفة ورقية يمكن التخلص منها.resuspend الخلايا في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تحتوي على 2 ملليمتر EDTA، ونقل تعليق الخلية من كل بئر، إلى أنبوب أسفل جولة منفصلة. بدء تدفق مقياس الدراجات، والسماح لها الاحماء. في برنامج الاكتساب، قم بإنشاء تجربة جديدة، ثم قم بإعداد وتسمية العينات الجديدة.إعداد المعلمات وأجهزة الكشف عن الفلوروفوريس المناسبة، كما هو مبين في بروتوكول النص. في هذا البرنامج، عرض رسم نقطة المناسبة كما هو موضح في بروتوكول النص. باستخدام الخلايا عينة فقط، والحصول على بعض الخلايا وتعيين بوابة حول الكريات البيض.استنادا إلى بوابة الكريات البيض، بوابة للخلايا إيجابية CD45، لفصل من كونيديا في مؤامرة CD45 SSC. في مؤامرة نقطة، CD14، CD66b، العدلات بوابة ومحاديات منفصلة. بعد ذلك، تغيير من الخلايا عينة فقط، إلى كونيديا unlaidied.في مؤامرة نقطة، المضادة FITC، APC FITC، عرض العدلات في رباعيات مجموعة لإشارات مكافحة FITC، و FITC. افتح عرض الإحصائيات واضبط الأرباع، مع السماح بـ 1٪ كحد أقصى من الخلايا في الأرباع Q1 و Q2 و Q4 كحد أقصى. كرر هذه العملية لبوابة أحادية. في بوابة الكريات البيض، تسجيل جميع العينات مع ما لا يقل عن 20،000 الأحداث.يمكن قراءة البلعمة من CONIDIA المسمى FITC من قبل العدلات البشرية من وجهات النظر الإحصاءات. في هذه الدراسة، يتم استخدام طريقة تدفق سريع السيتوميتري لقياس تفاعل أسبيرجيلوس تبخير كونيديا مع عدد كبير من الكريات البيض البشرية الأولية. باستخدام الأجسام المضادة المناسبة واستراتيجية الغاءة هو مبين هنا، وهو الغات العام من الكريات البيض البشرية من قبل FSC وسمات SSC، ويتبع فصل الكريات البيض في كونيديا الحرة، من قبل علامة عموم الكريات البيض، CD45.يمكن أن تصل كونيديا حجم الخلية تقريبا في وقت تدفق القياس الخلوي، وخاصة عند استخدام Conidia منتفخة، أو فترة حضانة طويلة، وبالتالي يمكن أن تشتري لنا التحليل. منذ أحاديات الإنسان الأساسية والعدلات تناول Conidia بشكل مختلف، وهذا البروتوكول يسمح لتحليل منفصل من هذه الخلايا السكانية على أساس، على تلطيخ مع علامات نسب الخلايا الراسخة، CD14 ل monocytes، وD66b للعدلات. يمكن أن تكون النسبة المئوية للباترات الأولية البشرية التي تُستوعب كونيديا متغيرة للغاية بين المتبرعين بالدم ، ولكنها تعتمد أيضًا على عوامل تجريبية ، مثل وقت الحضانة وحالة التورم في Conidia.يمكن الكشف عن استيعاب البوغ بعد 0.5 ساعة من الحضانة المشتركة ، ويزيد مع مرور الوقت. يتم تناول كونيديا ما قبل التورم أسهل من جراثيم الراحة ، حتى في أوقات الحضانة القصيرة. إذا تم إصلاح كونيديا مع الفورمالديهايد، يتم تقليل البلعوم مقارنة Conidia الأصلي.بعد هذا الإجراء، يمكن جمع super من الخلايا المناعية المشتركة وكونيديا وتحليلها من قبل إليزا للتحقق مما إذا كان التفاعل يثير إطلاق السيتوكين من قبل الخلايا المناعية. يرجى تذكر، يمكن أن الدم البشري يحتمل أن تنقل الأمراض المعدية. يتطلب هذا العمل التطعيم عبر التهاب الكبد B، واستخدام خزانة السلامة الحيوية، بالإضافة إلى ارتداء القفازات في معطف المختبر.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

قياس مرفق والتطبع الأنفلونزا A الفيروسات في خلايا A549 بواسطة التدفق الخلوي

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

التصوير المباشر لآخر مضاد من قبل العدلات الإنسان الأساسية وحيدات في الاستجابة لل<em&gt; A. فوميجاتوس</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

عزل الكريات البيض عن حليب الثدي البشري للاستخدام في فحص الفيغوسية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة لأهداف فيروس نقص المناعة البشرية

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

قياس مستقبلات مكملة الإريثروسيت 1 باستخدام قياس التدفق الخلوي

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...