Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Vi takker fru Pia stier for fremragende teknisk assistance. M. von Lilienfeld-Toal understøttes af Center for sepsis Control and Care (det tyske Forbundsministerium for uddannelse og sundhed, BMBF, FKZ 01E01002) og InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang støttes af Jena skolen for mikrobiel kommunikation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)

Denne protokol omfatter brugen af humane Buffy frakker opnået fra Institut for transfusion Medicine, Jena Universitets Hospital og frisk veneblod fra patienter, både efter skriftlig informeret samtykke fra donorer i overensstemmelse med etiske komité godkendelse 4357-03/15.
1. klargøring af Aspergillus fumigatus conidia
<ol><li>Grow A. fumigatus på 1,5% malt agar Petri skåle i 5 dage ved 37 °C uden Co2. Forsigtig: a. fumigatus ...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

Denne protokol præsenterer en hurtig flow cytometrisk metode til at måle interaktion af a. fumigatus conidia med et stort antal primære humane leukocytter, der ikke er muligt i almindelige mikroskopiske protokoller. Imaging celler med et mikroskop og manuelt tælle internaliseret conidia er besværligt og kan realistisk set gøres for et par hundrede celler kun. Flowcytometri overvinder dette problem ved at måle tusindvis af celler inden for minutter. En forhindring, der er fælles for begge fremgangsmåder,...

Invasiv pulmonal aspergillose er en stor trussel mod immunkompromitterede patienter, da behandlingsmulighederne er begrænsede og kun lykkes ved tidlig diagnose, hvilket fører til høje dødelighedsrater1. Infektiøse agenser er conidia (sporer) af formen Aspergillus fumigatus , der er allestedsnærværende til de fleste levesteder2. Conidia inhaleres, passere gennem luftvejene og kan endelig komme ind i lunge alveolerne. Hos immunkompetente mennesker, disse conidia er ryddet af medfødte immunceller såsom monocytter eller makrofager og neutrofile granulocytter, som tager op (fagocytose) og fordøje patogener3. Fagocytose er vigtigt for mikrobiologer og immunologer ligeledes når interesserede i vært-patogen interaktioner. Konfrontationsassays, såsom Co-inkubation af leukocytter og conidia, omfatter ofte mærkning af sporer ved fluorescein eller dets afledte fluorescein isothiocyanat (FITC). Ved hjælp af et mikroskop er det ligetil at identificere internaliseret fluorescerende conidia og til at bestemme fastsiddende/klædelig conidia, selv om denne fremgangsmåde er tung og realistisk begrænset til et par hundrede celler4. Men i flow cytometri, som let giver mulighed for analyse af hundredtusinder af celler inden for minutter, er differentiel farvning af fagocytoseret og vedliggende conidia afgørende. Derfor er mange protokoller afhængige af trypan Blue til at slukke FITC-fluorescens fra vedsiddende conidia5,6,7,8. En anden fremgangsmåde er at udnytte fluorescens resonans energioverførsel af ethidium bromid og FITC til at udsende rødt i stedet for grøn fluorescens fra vedsiddende conidia9,10,11. Hvis specifikke antistoffer er tilgængelige, som det er tilfældet for nogle bakterier, celle bundne partikler kan være direkte plettet12,13.
Her præsenterer vi en protokol til hurtigt og kvantitativt vurdere fagocytose af FITC-mærket a. fumigatus conidia af humane leukocytter sammen med fastgørelse af sporer til celler og manglende interaktion ved at ansætte en allophycocyanin (APC)-koblede anti-FITC-antistof. Metoden giver også mulighed for samtidig flow cytometrisk analyse af yderligere celle markører, der kan anvendes til separat analyse af fagocytose af monocytter og neutrofiler fra samme prøve.
Protokollen kan anvendes til karakterisering af svampe stammer (f. eks. flere arter af Aspergillus og andre forme fra slægten mucorales præsenteret her) og deres mutanter14 og immunologisk forskning på phagocytter, såsom leukocytter fra immunkompromitterede individer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

Invasiv lungebetændelse af formen Aspergillus fumigatus udgør en stor trussel mod immunkompromitterede patienter. Inhalerede svampe nåle (sporer) udskilles fra den menneskelige lunge alveolerne ved at være fagocytoseret af medfødte monocytter og/eller neutrofiler. Denne protokol giver en hurtig og pålidelig måling af fagocytose ved flow cytometri ved hjælp af fluorescein isothiocyanat (FITC)-mærket conidia for Co-inkubation med humane leukocytter og efterfølgende kontra farvning med et anti-FITC antistof til at tillade diskrimination af internaliseret og celle-overbærende conidia. Store fordele ved denne protokol er dens rapidness, muligheden for at kombinere analysen med cytometrisk analyse af andre celle markører af interesse, den samtidige analyse af monocytter og neutrofiler fra en enkelt prøve og dens anvendelighed til andre celle vægbærende svampe eller bakterier. Bestemmelse af procentdele af fagocytoserende leukocytter giver et middel til mikrobiologer til vurdering af virulens af et patogen eller til sammenligning af patogener og mutanter samt til immunologer til undersøgelse af human leukocyt kapaciteter til bekæmpelse af patogener.

Ved måling af fagocytose af A. fumigatus conidia af humane fagocytiske celler, forskelsbehandling mellem ægte internalisering og blotte fastgørelse af conidia til cellerne er en hindring, især når det kommer til high-gennemløb metoder såsom flow cytometry. For at overvinde denne forhindring, præsenterer vi en hurtig og pålidelig protokol baseret på farvning af conidia med fluorescerende farvestof FITC før Co-inkubation af celler og conidia, efterfulgt af en kontra farvning med et APC-mærket anti-FITC...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Denne protokol giver en hurtig og pålidelig metode til kvantitativt at måle fagocytose af Aspergillus fumigatus conidia af humane primære fagocytter ved hjælp af flow cytometri og at diskriminere fagocytose af conidia fra simpel vedhæftning til leukocytter.

Måling af fagocytose af Aspergillus fumigatus Conidia af humane leukocytter ved hjælp af strømnings cytometri

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Denne protokol er signifikant, fordi den kvantitativt måler fagocytose af mærket Aspergillus fumigateurs Conidia af humane leukocytter, sammen med fastgørelse af Conidia til celler, og manglende interaktion ved flow cytometri. Den største fordel ved denne metode er, at det letter den hurtige analyse af et stort antal celler. Desuden gør mærkning af cellemarkørerne det muligt at adskille vurderingen af neutrofiler og monocytter i samme prøve.I enhver denne teknik kan bruges til at analysere andre kliniske relevante svampe som Mucorales. I stedet røde blodlegemer kan anvendes som fagocytter. For at starte denne procedure, våd en køkkenrulle med desinfektionsmiddel, og læg det i en bio sikkerhed kabinet.Placer en plade af dyrket Aspergillus fumigatus oven på køkkenrulle for at forhindre overdistribution af flygtige Conidia. Tilsæt 10 milliliter PBS indeholdende 0,01% vaskemiddel på toppen af svampen, og brug en Drigalski spatel til at sprede væsken over pladen, og gnid den mørke farvede Conidia. Overfør Conidia suspensionen til en 50 milliliter gennem en 30 mikrometer si, som vil fjerne eventuelle resterende mycelia.Tilsæt yderligere 10 milliliter PBS med vaskemiddel til pladen, spred den med en spatel, og overfør den til det samme rør gennem s sien. Dernæst forberede en steril opløsning af 0,1 molar natriumcarbonat, opløst i PBS. Og forbered en 0,1 millimolar opløsning af FITC pulver, i denne natriumcarbonat opløsning.Re-suspendere 100 millioner eller mindre Conidia, i fem milliliter af denne FITC opløsning, i en 15 milliliter rør. Inkuberes i en rotator ved 37 grader Celsius i 20 minutter. For at svulme op til Conidia, resuspend den FITC mærket Conidia i fem milliliter RPMI medium, suppleret med 10% FCS.Og inkubere i en rotator ved 37 grader Celsius for den ønskede tid. I et bio sikkerhedsskab anbringes fem milliliter buffycoat i et 50 milliliterrør. Fyld røret med EL buffer, og invertere tre gange.Inkuber vandret i fem til otte minutter, indtil blandingens mælkeagtige udseende bliver klart. Derefter centrifuge ved 300 gange G, og ved stuetemperatur i 10 minutter. Supernatanten kasseres, og pelletpensuseres i en milliliter EL-buffer ved pipettering.Tilføj yderligere 24 milliliter EL buffer, og invertere røret flere gange. Centrifuge ved 300 gange G og ved stuetemperatur i fem minutter. Kassér supernatanten og resuspend cellerne i en milliliter RPMI medier, suppleret med 10% FCS.Til at begynde, overføre to millioner leukocytter og fire millioner FITC-mærket Conidia i 1,5 milliliter RPMI suppleret med 10% FCS, til en 12-brønd kultur plade. Medtag kun en kontrol af celler uden Conidia og en kontrol af celler med ikke-mærket Conidia. Inkuber pladen i en befugtet kuldioxid inkubator, ved 37 grader Celsius i den ønskede mængde tid.Når inkubationen er færdig, skal du bruge en celleskraber til at høste cellerne og overføre dem til et 15 milliliterrør. Først sættes 100 mikroliter af hver prøve og styrer i en brønd af en 96-brønd V-bund plade. Der tilsættes 150 mikroliter PBS indeholdende to millimolar EDTA til vask.For farvekompensation skal du placere en million celler uden Conidia for hver farve i andre brønde af pladen. Medtag en brønd af celler, der vil blive efterladt utrænet. Der tilsættes 150 mikroliter PBS, der indeholder to millimolar EDTA, til hver brønd til vask.Dernæst dække pladen med en klæbende folie, og centrifuge ved 300 gange G og ved stuetemperatur i fem minutter. Fjern derefter folien og kassér supernatanten ved hurtigt og kraftigt at vende pladen kun én gang over enten vasken eller en engangsrullerulle. Resuspend cellerne i 100 mikroliter af antistof mix, og bland godt ved pipettering.Ved farvekompensationer skal de respektive celler i 100 mikroliter PBS indeholdende to millimolar EDTA og tilsætte en enkelt antistoftype til hver brønd med samme mængde, der anvendes i antistofblandingen. Dæk med en klæbende folie, og inkubere ved stuetemperatur i mørke i 20 minutter. Derefter fjernes folien, og der tilsættes 150 mikroliter PBS, der indeholder 2 millimolar EDTA, til vask.Dæk pladen med selvklæbende folie igen. Centrifuge ved 300 gange G og ved stuetemperatur i fem minutter. Fjern derefter folien, og kassér supernatanten ved hurtigt og kraftigt at vende pladen over enten en vask eller engangsrullerulle.Cellerne opsenders igen i 200 mikroliter PBS indeholdende 2 millimolar EDTA, og overfør cellesuspensionen fra hver brønd til et separat rundt bundrør. Start flow cytometer, og lad det varme op. Opret et nyt eksperiment i anskaffelsessoftwaren, og konfigurer og mærmærker de nye eksempler.Konfigurer parametrene og detektorerne for de relevante fluorofoser som beskrevet i tekstprotokollen. I denne software skal du vise de relevante prikkeområder som beskrevet i tekstprotokollen. Brug cellerne kun prøve, erhverve nogle celler og indstille porten omkring leukocytter.Baseret på leukocyt porten, gate for CD45 positive celler, at adskille fra Conidia i SSC CD45 plot. I en prik plot, CD14, CD66b, gate neutrofiler og monocytter separat. Derefter skiftes fra cellerne kun prøve, til umærket Conidia.I en prik plot, anti-FITC, APC FITC, display neutrofiler i sæt kvadranter til anti-FITC, og FITC signaler. Åbn statistikvisningen, og juster kvadranterne, så der maksimalt kan være 1 % celler i kvadranterne Q1, Q2 og Q4. Gentag denne proces for monocytporten. I leukocytporten registreres alle prøver med mindst 20.000 hændelser.Fagocytose af FITC-mærket Conidia af menneskelige neutrofiler kan læses fra statistikken synspunkter. I denne undersøgelse anvendes en hurtig strøm cytometrisk metode til at måle samspillet mellem Aspergillus desinficeringskondier med et stort antal primære humane leukocytter. Ved hjælp af de relevante antistoffer og gating strategi vist her, en generel gating af menneskelige leukocytter af FSC og SSC egenskaber, efterfølges af en adskillelse af leukocytter i frie Conidia, af pan leukocyt markør, CD45.Conidia kan nå næsten cellestørrelse på tidspunktet for flow cytometri, især når du bruger hævede Conidia, og eller lange inkubation gange, og dermed kan købe os analyse. Da menneskelige primære monocytter og neutrofiler tage op Conidia forskelligt, denne protokol giver mulighed for separat analyse af disse cellepopulation baseret på farvning med veletablerede celle afstamning markører, CD14 for monocytter, og CD66b for neutrofiler. Procentdelen af menneskelige primære fagocytter internalisere Conidia kan være meget varierende blandt bloddonorer, men afhænger også af eksperimentelle faktorer, såsom inkubationstid og hævelse tilstand Conidia.Spore internalisering kan påvises efter 0,5 timers co-inkubation, og stiger med tiden. Pre-hævede Conidia er taget op lettere end hvile sporer, selv ved korte inkubation gange. Hvis Conidia er fastsat med formaldehyd, er fagocytose mindskes i forhold til indfødte Conidia.Efter denne procedure kan supernatanter af co-inkuberede immunceller og Conidia indsamles og analyseres af Eliza for at kontrollere, om interaktionen fremkalder en cytokin frigivelse af immuncellerne. Husk, at humant blod potentielt kan overføre smitsomme sygdomme. Dette arbejde kræver vaccination på tværs af Hepatitis B, brug af en bio sikkerhed kabinet, samt iført handsker på en laboratoriekittel.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Måling Attachment og internalisering af influenza A-virus i A549-celler ved flowcytometri

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Måling granulocyt og monocyt Fagocytose og Oxidativ Burst Aktivitet i humant blod

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live-Imaging af antifungal aktivitet af humane primære neutrofiler og monocytter i Reaktion på<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisering af humane monocyt delmængder af fuldblod Flow flowcytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Isolering af leukocytter fra modermælken til brug i en antistofafhængig cellulær fagocytose analyse af HIV-mål

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Måling Erythrocyt Supplement Receptor 1 Brug Flow cytometri

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...