Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Wij danken mevrouw Pia stier voor de uitstekende technische bijstand. M. von Lilienfeld-Toal wordt ondersteund door het centrum voor sepsis controle en verzorging (Duits Federaal Ministerie van onderwijs en gezondheid, BMBF, FKZ 01E01002) en InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang wordt gesteund door de school voor microbiële communicatie van Jena (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)

Dit protocol omvat het gebruik van menselijke Buffy jassen verkregen van het Institute for Transfusion Medicine, Jena universitair ziekenhuis en vers veneuze bloed van patiënten, zowel na schriftelijke geïnformeerde toestemming van de donoren in overeenstemming met goedkeuring van de ethische commissie 4357-03/15.
1. bereiding van Aspergillus fumigatus conidia
<ol><li>Grow A. fumigatus op 1,5% Malt agar Petri schaaltjes gedurende 5 dagen bij 37 °C zonder co2.<...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

Dit protocol presenteert een Fast Flow cytometrische methode voor het meten van de interactie van a. fumigatus conidiën met een groot aantal primaire menselijke leukocyten die niet mogelijk is in gemeenschappelijke microscopische protocollen. Beeldvormings cellen met een microscoop en handmatig de geïnternationaliseerde conidiën tellen zijn omslachtig en kunnen realistisch worden gedaan voor een paar honderd cellen. Flow flowcytometrieonderzoeken overkomt dit probleem door het meten van duizenden cellen binne...

Invasieve pulmonale aspergillose is een grote bedreiging voor immuungecompromitteerde patiënten omdat behandelingsopties beperkt zijn en alleen succesvol zijn bij vroege diagnose, wat leidt tot hoge sterftecijfers1. Infectieuze agentia zijn conidiën (sporen) van de schimmel Aspergillus fumigatus die alomtegenwoordig zijn voor de meeste habitats2. Conidia worden geïnhaleerd, passeren de luchtwegen en kunnen eindelijk de Long alveoli binnengaan. Bij immunocompetente mensen worden deze conidiën geklaard door aangeboren immuuncellen zoals monocyten of macrofagen en Neutrofiele granulocyt, die nemen (fagocytose) en de pathogenen verteren3. Fagocytose is ook belangrijk voor microbiologen en immunologen wanneer ze geïnteresseerd zijn in interacties tussen gastheer en pathogeen. Confrontatie testen, zoals coincubatie van leukocyten en conidia, omvatten vaak het labelen van de sporen door fluoresceïne of zijn afgeleide fluoresceïne isothiocyanaat (FITC). Met behulp van een microscoop is het eenvoudig om geïnternationaliseerde fluorescentie-conidiën te identificeren en om de bijgevoegde/aanhandige conidiën te bepalen, hoewel deze aanpak omslachtig is en realistisch beperkt tot enkele honderden cellen4. Echter, in flow cytometrie waardoor de analyse van honderdduizenden cellen binnen enkele minuten gemakkelijk is, is differentiële kleuring van phagocytosed en aanhandige conidiën van vitaal belang. Daarom zijn veel protocollen gebaseerd op trypan Blue om FITC-fluorescentie te blusen van de aanhandige conidiën5,6,7,8. Een andere aanpak is het benutten van fluorescentie resonantie energie overdracht van ethidiumbromide bromide en FITC om rood uit te stoten in plaats van groene fluorescentie van aanhanger conidiën9,10,11. Als er specifieke antilichamen beschikbaar zijn, zoals bij sommige bacteriën, kunnen cel-gebonden deeltjes direct worden gekleurd12,13.
Hier presenteren we een protocol voor het snel en kwantitatief beoordelen van fagocytose van FITC-gelabelde a. fumigatus conidiën door menselijke leukocyten samen met een bevestiging van sporen aan cellen en een gebrek aan interactie door gebruik te maken van een allophycocyanin (APC)-gekoppeld anti-FITC-antilichaam. De methode maakt het ook mogelijk voor de gelijktijdige Flow cytometrische analyse van verdere celmarkeringen die kunnen worden gebruikt voor een afzonderlijke analyse van fagocytose door monocyten en neutrofielen uit hetzelfde monster.
Het protocol kan worden toegepast voor de karakterisering van schimmel stammen (bijv. verschillende soorten Aspergillus en andere mallen van het geslacht Mucorales hier gepresenteerd) en hun mutanten14 en immunologische onderzoek op fagocyten, zoals leukocyten van immuungecompromitteerde individuen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

Invasieve pulmonale infectie door de schimmel Aspergillus fumigatus vormt een grote bedreiging voor immuungecompromitteerde patiënten. Geïnhaleerde schimmel conidiën (sporen) worden uit de menselijke Long longblaasjes geklaard door fagocytosed te zijn door aangeboren monocyten en/of neutrofielen. Dit protocol biedt een snelle en betrouwbare meting van de fagocytose door Flowcytometrie met behulp van fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-gelabelde conidiën voor coincubatie met menselijke leukocyten en daaropvolgende tegen kleuring met een antilichaam tegen FITC om discriminatie van geïnternationaliseerde en cel-aanhangende conidiën mogelijk te maken. Belangrijke voordelen van dit protocol zijn de snelheid, de mogelijkheid om de test te combineren met cytometrische analyse van andere celmarkeringen van belang, de gelijktijdige analyse van monocyten en neutrofielen uit een enkel monster en de toepasbaarheid ervan op andere celwanddragende schimmels of bacteriën. Bepaling van de percentages van phagocytosing leukocyten biedt een middel aan microbiologen voor de beoordeling van de virulentie van een pathogeen of voor het vergelijken van ziekteverwekkers en mutanten, alsook aan immunologen voor het onderzoeken van menselijke leukocyten capaciteiten om pathogenen te bestrijden.

Bij het meten van fagocytose van A. fumigatus conidiën door menselijke fagocytische cellen, is discriminatie tussen echte internalisering en loutere gehechtheid van conidiën aan de cellen een obstakel, vooral als het gaat om methoden met een hoge doorvoer zoals Flowcytometrie. Om deze hindernis te overwinnen, presenteren we een snel en betrouwbaar protocol op basis van de kleuring van conidiën met de fluorescerende kleurstof FITC voorafgaand aan de co-incubatie van cellen en conidiën, gevolgd door een tegen ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Dit protocol biedt een snelle en betrouwbare methode voor het kwantificeren van de fagocytose van Aspergillus fumigatus conidiën door humane primaire fagocyten met behulp van Flowcytometrie en om de fagocytose van conidiën te onderscheiden van de loutere hechting op leukocyten.

Meten van fagocytose van Aspergillus fumigatus conidia door menselijke leukocyten met behulp van Flowcytometrie

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Dit protocol is belangrijk omdat het kwantitatief phagocytose van gelabelde Aspergillus fumigateurs Conidia door menselijke leukocyten, samen met de gehechtheid van Conidia aan cellen, en gebrek aan interactie door stroom cytometrie meet. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het de snelle analyse van een groot aantal cellen vergemakkelijkt. Bovendien maakt het etiketteren van de celmarkers het mogelijk om de beoordeling van neutrofielen en monocyten binnen hetzelfde monster te scheiden.In elke techniek kan worden gebruikt om andere klinische relevante schimmels zoals Mucorales te analyseren. In plaats daarvan rode bloedcellen kunnen worden gebruikt als fagocyten. Om deze procedure te beginnen, nat een papieren handdoek met ontsmettingsmiddel, en plaats het in een bio-veiligheidskast.Plaats een plaat van volwassen Aspergillus fumigatus op de top van de papieren handdoek om oververdeling van vluchtige Conidia te voorkomen. Voeg 10 milliliter PBS met 0,01% wasmiddel op de top van de schimmel, en gebruik een Drigalski spatel om de vloeistof te verspreiden over de plaat, en wrijf de donkergekleurde Conidia. Breng de Conidia-ophanging over op een 50 milliliter via een zeef van 30 micrometer, die eventuele resterende mycelia zal verwijderen.Voeg nog eens 10 milliliter PBS met wasmiddel aan de plaat, verdeel het met een spatel, en breng het naar dezelfde buis door de zeef. Bereid vervolgens een steriele oplossing van 0,1 molaire natriumcarbonaat, opgelost in PBS. En bereid een 0,1 millimolar oplossing van FITC poeder, in deze natriumcarbonaat oplossing.Schors 100 miljoen of minder Conidia, in vijf milliliter van deze FITC-oplossing, in een buis van 15 milliliter. Incubeer in een rotator bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Om te zwellen naar Conidia, resuspend de FITC gelabeld Conidia in vijf milliliter rpmi medium, aangevuld met 10%FCS.En incubeer in een rotator bij 37 graden Celsius voor de gewenste tijd. In een bio veiligheidskast, plaats vijf milliliter buffy jas in een 50 milliliter buis. Vul de buis met EL buffer, en omkeren drie keer.Vijf tot acht minuten horizontaal uitbroeden, totdat het melkachtige uiterlijk van het mengsel helder wordt. Dan, centrifugeren op 300 keer G, en bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in één milliliter EL-buffer door pipetteren.Voeg nog eens 24 milliliter EL-buffer toe en keer de buis meerdere keren om. Centrifuge op 300 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en stel de cellen opnieuw op in één milliliter RPMI-media, aangevuld met 10%FCS.Om te beginnen, overdracht twee miljoen leukocyten en vier miljoen FITC-label Conidia in 1,5 milliliter RPMI aangevuld met 10% FCS, naar een 12-well cultuur plaat. Neem een controle van cellen alleen zonder Conidia, en een controle van cellen met niet-gelabelde Conidia. Incubeer de plaat in een bevochtigde koolstofdioxide incubator, op 37 graden Celsius voor de gewenste hoeveelheid tijd.Wanneer de incubatie is voltooid, gebruik dan een cel schraper om de cellen te oogsten, en breng ze naar een 15 milliliter buis. Ten eerste, zet 100 microliter van elk monster en controles in een put van een 96-well V-bodem plaat. Voeg 150 microliter PBS toe met twee millimolar EDTA voor het wassen.Voor kleurcompensatie, plaats een miljoen cellen zonder Conidia voor elke kleur, in andere putten van de plaat. Neem een put van cellen die ongetraind zal worden gelaten. Voeg 150 microliter PBS met twee millimolar EDTA toe aan elke put om te wassen.Bedek vervolgens de plaat met een kleeffolie en verkroom op 300 keer G en vijf minuten op kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de folie en gooi de supernatant door de plaat snel en krachtig om te keren slechts één keer over de gootsteen of een wegwerppapierhanddoek. Resuspend de cellen in 100 microliters van antilichaam mix, en meng goed door pipetting.Voor kleurcompensaties, resuspend de respectieve cellen in 100 microliter pbs met twee millimolar EDTA, en voeg een enkel antilichaamtype aan elke put, op dezelfde hoeveelheid die wordt gebruikt in de antilichaam mix. Dek af met een kleeffolie en broed 20 minuten in het donker op kamertemperatuur. Verwijder hierna de folie en voeg 150 microliter PBS met twee millimolar EDTA toe aan elke put om te wassen.Bedek de plaat opnieuw met kleeffolie. Centrifuge op 300 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens de folie en gooi de supernatant weg door de plaat snel en krachtig om te keren over een gootsteen of wegwerppapierhanddoek.Resuspend de cellen in 200 microliter van PBS met 2 millimolar EDTA, en breng de cel suspensie van elke put, in een aparte ronde bodembuis. Start de stroom cytometer, en laat het opwarmen. Maak in de acquisitiesoftware een nieuw experiment en stel de nieuwe voorbeelden in en label deze.Stel de parameters en de detectoren in voor de juiste fluoroforen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Geef in deze software de juiste puntplospunten weer zoals beschreven in het tekstprotocol. Met behulp van de cellen alleen monster, verwerven van een aantal cellen en zet de poort rond leukocyten.Gebaseerd op de leukocyte poort, poort voor CD45 positieve cellen, te scheiden van Conidia in de SSC CD45 plot. In een stip plot, CD14, CD66b, gate neutrophils en monocyten afzonderlijk. Verander hierna van het alleenmonster van de cellen naar niet-gelabelde Conidia.In een stip plot, anti-FITC, APC FITC, display neutrophils in set kwadranten voor anti-FITC, en FITC signalen. Open de statistiekenweergave en pas de kwadranten aan, zodat maximaal 1% van de cellen in de kwadranten Q1, Q2 en Q4 mogelijk is. Herhaal dit proces voor de monocyten poort. In de leukocyte poort, record alle monsters met ten minste 20.000 gebeurtenissen.Phagocytose van FITC-gelabelde Conidia door menselijke neutrofielen kan worden gelezen uit de statistieken standpunten. In deze studie wordt een snelle stroomcytometrische methode gebruikt om de interactie van Aspergillus fumigateurs Conidia te meten met een groot aantal primaire menselijke leukocyten. Met behulp van de juiste antilichamen en de hier getoonde gatingstrategie wordt een algemene gating van menselijke leukocyten door FSC- en SSC-kenmerken gevolgd door een scheiding van leukocyten in de vrije Conidia, door de pan leukocyte marker, CD45.Conidia kan bijna celgrootte bereiken op het moment van stroomcytometrie, vooral bij het gebruik van gezwollen Conidia, en of lange incubatietijden, en dus kan kopen ons analyse. Aangezien menselijke primaire monocyten en neutrofielen Conidia anders opnemen, maakt dit protocol de afzonderlijke analyse van deze celbevolking mogelijk, op basis van kleuring met de gevestigde cellijnmarkeringen, CD14 voor monocyten en CD66b voor neutrofielen. Het percentage menselijke primaire fagocyten dat Conidia internaliseert kan zeer variabel zijn bij bloeddonoren, maar hangt ook af van experimentele factoren, zoals incubatietijd en zwellingstoestand van Conidia.Spore internalisatie kan worden gedetecteerd na 0,5 uur co-incubatie, en neemt toe met de tijd. Pre-gezwollen Conidia worden gemakkelijker opgenomen dan rustsporen, zelfs bij korte incubatietijden. Als Conidia zijn vastgesteld met formaldehyde, is fagocytose verminderd in vergelijking met native Conidia.Na deze procedure kunnen supernatants van co-geïncubeerde immuuncellen en Conidia door Eliza worden verzameld en geanalyseerd om te controleren of de interactie een cytokine vrijlaat door de immuuncellen. Houd er rekening mee dat menselijk bloed mogelijk infectieziekten kan overbrengen. Dit werk vereist vaccinatie in hepatitis B, het gebruik van een bio-veiligheidskast, evenals het dragen van handschoenen op een lab jas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Meten Attachment en internalisering van influenza A-virus in A549 cellen door flowcytometrie

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Het meten van granulocyten en monocyten fagocytose en oxidatieve Burst activiteit in menselijk bloed

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live-Imaging van antischimmelactiviteit door Human Primary neutrofielen en monocyten in reactie op<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van HIV-doelwitten

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Het meten van Erythroocyte Complement Receptor 1 met behulp van Flow Cytometrie

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...