Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
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Nous remercions Mme Pia Stier pour son excellente assistance technique. M. von Lilienfeld-Toal est soutenu par le Center for Sepsis Control and Care (Ministère fédéral allemand de l'éducation et de la santé, BMBF, FKZ 01E01002) et InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang est soutenu par l'École de communication microbienne de Jena (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)

Ce protocole comprend l'utilisation de manteaux bouffi humains obtenus auprès de l'Institut de médecine transfusionnelle, l'hôpital universitaire d'Iéna et de sang veineux frais prélevé sur des patients, tous deux après le consentement éclairé écrit des donneurs conformément à l'approbation du comité d'éthique 4357-03/15.
1. Préparation d'Aspergillus fumigatus Conidia
<ol><li>Cultivez A. fumigatus sur 1,5% malt agar Petri plats pendant 5 jours à 37 oC sans C...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

Ce protocole présente une méthode cytométrique à débit rapide pour mesurer l'interaction de A. fumigatus conidia avec un grand nombre de leucocytes humains primaires qui n'est pas possible dans les protocoles microscopiques communs. L'imagerie des cellules avec un microscope et le comptage manuel des conidies intériorisées est lourd et peut être fait de façon réaliste pour quelques centaines de cellules seulement. La cytométrie de flux surmonte ce problème en mesurant des milliers de cellules en quel...

L'aspergillose pulmonaire invasive est une grande menace pour les patients immunocompromis car les options de traitement sont limitées et seulement réussies sur le diagnostic tôt, qui mène aux taux élevés de mortalité1. Les agents infectieux sont des conidies (spores) de la moisissure Aspergillus fumigatus qui sont omniprésentes dans la plupart des habitats2. Les conidies sont inhalées, passent à travers les voies respiratoires et peuvent enfin entrer dans les alvéoles pulmonaires. Chez les humains immunocompétents, ces conidies sont éliminées par des cellules immunitaires innées telles que les monocytes ou les macrophages et les granulocytes neutrophiles, qui prennent (phagocytose) et digèrent les pathogènes3. La phagocytose est également importante pour les microbiologistes et les immunologistes lorsqu'elles s'intéressent aux interactions hôte-pathogène. Les essais de confrontation, tels que la co-incubation des leucocytes et des conidies, incluent souvent l'étiquetage des spores par fluorescein ou son isothiocyanate dérivé de fluorescein (FITC). À l'aide d'un microscope, il est simple d'identifier les conidies fluorescentes intériorisées et de déterminer les conidies attachées/adhérentes, bien que cette approche soit lourde et réalistement limitée à quelques centaines de cellules4. Cependant, dans la cytométrie de flux qui permet facilement l'analyse de centaines de milliers de cellules en quelques minutes, la coloration différentielle des conidies phagocytosed et adhérentes est essentielle. Par conséquent, de nombreux protocoles s'appuient sur Trypan Blue pour éteindre FITC-fluorescence de conidia adhérents5,6,7,8. Une autre approche consiste à exploiter le transfert d'énergie par résonance de fluorescence du bromure d'éhidium et du FITC pour émettre du rouge au lieu de la fluorescence verte des conidies adhérentes9,10,11. Si des anticorps spécifiques sont disponibles, comme c'est le cas pour certaines bactéries, les particules cellulaires peuvent être directement tachées12,13.
Ici, nous présentons un protocole pour évaluer rapidement et quantitativement la phagocytose des conidies A. fumigatus labeled DE FITC par les leucocytes humains avec l'attachement des spores aux cellules et le manque d'interaction en employant un anticorps anti-FITC allophycocyanin (APC) couplé. La méthode permet également l'analyse cytométrique simultanée d'autres marqueurs cellulaires qui peuvent être utilisés pour l'analyse séparée de la phagocytose par les monocytes et les neutrophiles du même échantillon.
Le protocole peut être appliqué pour la caractérisation des souches fongiques (par exemple, plusieurs espèces d'Aspergillus et d'autres moisissures du genre Mucorales présentés ici) et leurs mutants14 et la recherche immunologique sur les phagocytes, tels que les leucocytes des individus immunocompromis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

L'infection pulmonaire invasive par le moule Aspergillus fumigatus pose une grande menace pour les patients immunocompromis. Les concarnes fongiques inhalées (spores) sont éliminées des alvéoles pulmonaires humaines en étant phagocytosed par des monocytes innés et/ou des neutrophiles. Ce protocole offre une mesure rapide et fiable de la phagocytose par cytométrie de flux utilisant des conidies étiquetées par isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pour la co-incubation avec les leucocytes humains et la contre-cellule subséquente avec un anticorps anti-FITC pour permettre la discrimination des conidies intériorisées et cellulaires. Les principaux avantages de ce protocole sont sa rapidité, la possibilité de combiner l'analyse avec l'analyse cytométrique d'autres marqueurs cellulaires d'intérêt, l'analyse simultanée des monocytes et des neutrophiles à partir d'un seul échantillon et son applicabilité à d'autres champignons ou bactéries muraux cellulaires. La détermination des pourcentages de phagocytosing leucocytes fournit un moyen aux microbiologistes pour évaluer la virulence d'un agent pathogène ou pour comparer les espèces pathogènes wildtypes et mutants ainsi qu'aux immunologistes pour étudier les capacités humaines de leucocyte pour combattre des agents pathogènes.

En mesurant la phagocytose de A. fumigatus conidia par les cellules phagocytiques humaines, la discrimination entre l'intériorisation véritable et le simple attachement des conidies aux cellules est un obstacle, surtout quand il s'agit de méthodes à haut débit telles que la cytométrie du débit. Afin de surmonter cet obstacle, nous présentons un protocole rapide et fiable basé sur la coloration des conidies avec le colorant fluorescent FITC avant la co-incubation des cellules et des conidies, suivi d'une...

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Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Ce protocole fournit une méthode rapide et fiable pour mesurer quantitativement la phagocytose d'Aspergillus fumigatus conidia par les phagocytes primaires humains utilisant la cytométrie de flux et pour discriminer la phagocytose des conidies de la simple adhérence aux leucocytes.

Mesure de la phagocytose d'Aspergillus fumigatus Conidia par des leucocytes humains à l'aide de la cytométrie du flux

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Ce protocole est significatif parce qu’il mesure quantitativement la phagocytose des fumigateurs d’Aspergillus étiquetés Conidia par les leucocytes humains, avec l’attachement de Conidia aux cellules, et le manque d’interaction par cytométrie de flux. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle facilite l’analyse rapide d’un grand nombre de cellules. De plus, l’étiquetage des marqueurs cellulaires permet d’évaluer séparément les neutrophiles et les monocytes dans le même échantillon.Dans n’importe quelle technique peut être utilisé pour analyser d’autres champignons cliniques pertinents comme Mucorales. Au lieu de cela, les globules rouges pourraient être utilisés comme phagocytes. Pour commencer cette procédure, mouiller une serviette en papier avec désinfectant, et le placer dans une armoire de biosécurité.Déposer une assiette d’Aspergillus fumigatus cultivé sur le dessus de l’essuie-tout pour éviter la surdissuration de Conidia volatile. Ajouter 10 millilitres de PBS contenant 0,01% de détergent sur le dessus du champignon, et utiliser une spatule Drigalski pour étendre le liquide sur la plaque, et déteindre sur la conidia de couleur foncée. Transférer la suspension Conidia à 50 millilitres à l’aide d’une passoire de 30 micromètres, ce qui éliminera tout mycélie résiduelle.Ajouter 10 millilitres de PBS avec du détergent à la plaque, l’étendre à l’aide d’une spatule et le transférer dans le même tube à travers la passoire. Ensuite, préparez une solution stérile de carbonate de sodium molaire de 0,1 molaire, dissoute dans PBS. Et préparer une solution de 0,1 millimolaire de poudre FITC, dans cette solution de carbonate de sodium.Suspendre à nouveau 100 millions ou moins de Conidia, en cinq millilitres de cette solution FITC, dans un tube de 15 millilitres. Incuber dans un rotateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour gonfler à Conidia, résuspendez le FITC étiqueté Conidia en cinq millilitres de milieu RPMI, complété par 10% FCS.Et incuber dans un rotateur à 37 degrés Celsius pour le temps désiré. Dans une armoire de biosécurité, placer cinq millilitres de pelage bouffi dans un tube de 50 millilitres. Remplissez le tube avec tampon EL, et inverser trois fois.Incuber horizontalement pendant cinq à huit minutes, jusqu’à ce que l’apparence laiteuse du mélange se dégage. Puis, centrifugeuse à 300 fois G, et à température ambiante pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille en un millilitre de tampon EL par pipetting.Ajouter 24 millilitres de tampon EL et inverser le tube plusieurs fois. Centrifugeuse à 300 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules en un millilitre de rpmi media, complété par 10%FCS.Pour commencer, transférer deux millions de leucocytes et quatre millions de Conidia étiquetés FITC dans 1,5 millilitres de RPMI complétés par 10% FCS, à une plaque de culture de 12 puits. Inclure un contrôle des cellules seulement sans Conidia, et un contrôle des cellules avec Conidia non étiquetés. Incuber la plaque dans un incubateur humidifié de dioxyde de carbone, à 37 degrés Celsius pour la quantité désirée de temps.Lorsque l’incubation est terminée, utilisez un grattoir cellulaire pour récolter les cellules et transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Tout d’abord, mettre 100 microlitres de chaque échantillon et les contrôles dans un puits d’une plaque v-fond de 96 puits. Ajouter 150 microlitres de PBS contenant deux millimolaires d’EDTA pour le lavage.Pour la compensation de couleur, placez un million de cellules sans Conidia pour chaque couleur, dans d’autres puits de la plaque. Inclure un puits de cellules qui ne seront pas tendues. Ajouter 150 microlitres de PBS contenant deux millimolaires d’EDTA à chaque puits pour le lavage.Ensuite, couvrir la plaque d’une feuille d’adhésif et d’une centrifugeuse à 300 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le papier d’aluminium et jetez le surnatant en inversant rapidement et avec force la plaque une seule fois sur l’évier, ou une serviette en papier jetable. Resuspendez les cellules en 100 microlitres de mélange d’anticorps, et mélangez bien par pipetting.Pour les compensations de couleur, résuspendez les cellules respectives dans 100 microlitres de PBS contenant deux millimolaires d’EDTA, et ajoutez un seul type d’anticorps à chaque puits, à la même quantité utilisée dans le mélange d’anticorps. Couvrir d’une feuille d’adhésif et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 20 minutes. Après cela, retirer le papier d’aluminium et ajouter 150 microlitres de PBS contenant deux millimolaires d’EDTA à chaque puits pour le lavage.Couvrir à nouveau la plaque de papier adhésif. Centrifugeuse à 300 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Retirez ensuite le papier d’aluminium et jetez le surnatant en inversant rapidement et avec force la plaque sur un évier ou une serviette en papier jetable.Resuspendez les cellules en 200 microlitres de PBS contenant 2 millimolar EDTA, et transférez la suspension cellulaire de chaque puits, dans un tube inférieur rond séparé. Démarrez le cytomètre d’écoulement et laissez-le se réchauffer. Dans le logiciel d’acquisition, créer une nouvelle expérience, et mettre en place et étiqueter les nouveaux échantillons.Configurer les paramètres et les détecteurs pour les fluorophores appropriés, tels que décrits dans le protocole texte. Dans ce logiciel, affichez les tracés de points appropriés tels qu’ils sont décrits dans le protocole texte. En utilisant les cellules seulement échantillon, acquérir certaines cellules et définir la porte autour des leucocytes.Basé sur la porte du leucocyte, porte pour les cellules positives CD45, pour se séparer de Conidia dans la parcelle CD45 SSC. Dans une parcelle à points, CD14, CD66b, neutrophiles de porte et monocytes séparément. Après cela, passer de l’échantillon des cellules seulement, à Conidia non étiqueté.Dans une parcelle à points, anti-FITC, APC FITC, affichez des neutrophiles dans des quadrants définis pour les signaux anti-FITC et FITC. Ouvrez la vue statistique et ajustez les quadrants, permettant un maximum de 1% de cellules dans les quadrants Q1, Q2 et Q4. Répétez ce processus pour la porte monocyte. Dans la porte des leucocytes, enregistrez tous les échantillons avec au moins 20 000 événements.La phagocytose de Conidia étiquetée FITC par les neutrophiles humains peut être lue à partir des points de vue statistiques. Dans cette étude, une méthode cytométrique à débit rapide est utilisée pour mesurer l’interaction d’Aspergillus fumigateurs Conidia avec un grand nombre de leucocytes humains primaires. En utilisant les anticorps appropriés et la stratégie de gating montrée ici, un gating général des leucocytes humains par des caractéristiques de FSC et de SSC, est suivi d’une séparation des leucocytes dans conidia libre, par le marqueur de leukocyte de casserole, CD45.Conidia peut atteindre presque la taille des cellules au moment de la cytométrie du flux, en particulier lors de l’utilisation de Conidia gonflé, et ou de longs temps d’incubation, et peut donc nous acheter l’analyse. Puisque les monocytes primaires et les neutrophiles humains prennent Conidia différemment, ce protocole permet l’analyse séparée de ces populations cellulaires basée, sur la coloration avec les marqueurs de lignée cellulaire bien établis, CD14 pour les monocytes, et CD66b pour les neutrophiles. Le pourcentage de phagocytes primaires humains intériorisant Conidia peut être très variable chez les donneurs de sang, mais dépend également de facteurs expérimentaux, tels que le temps d’incubation et l’état de gonflement de Conidia.L’internalisation des spores peut être détectée après 0,5 heure de co-incubation, et augmente avec le temps. Les conidies pré-gonflées sont prises plus facilement que les spores au repos, même à de courtes périodes d’incubation. Si conidia sont fixés avec du formaldéhyde, la phagocytose est diminuée par rapport à conidia indigène.Suite à cette procédure, les supernatants des cellules immunitaires co-incubées et conidia peuvent être recueillis et analysés par Eliza pour vérifier si l’interaction provoque une libération de cytokine par les cellules immunitaires. N’oubliez pas que le sang humain peut potentiellement transmettre des maladies infectieuses. Ce travail exige la vaccination contre l’hépatite B, l’utilisation d’un cabinet de biosécurité, ainsi que le port de gants à un manteau de laboratoire.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

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Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Recherche

Immunologie et infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

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Homme In Vitro</emRépression> comme outil de dépistage pour la reconnaissance d&#39;un Etat précoce de déséquilibre immunitaire

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Mesurer l&#39;attachement et l&#39;internalisation du virus grippal A dans les cellules A549 par cytométrie en flux

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative Activité Burst dans le sang humain

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

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Imagerie en direct de l&#39;activité par Human Antifongique primaire neutrophiles et des monocytes en réponse à<em&gt; A. fumigatus</em

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Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de VIH

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Mesurer le récepteur de complément d’érythrocyte 1 à l’aide de la cytométrie des débits

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...