Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
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Wir danken Frau Pia Stier für die ausgezeichnete technische Unterstützung. M. von Lilienfeld-Toal wird vom Zentrum für Sepsis-Kontrolle und Pflege (Bundesministerium für Bildung und Gesundheit, BMBF, FKZ 01E01002) und dem InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D) unterstützt. Thi Ngoc Mai Hoang wird von der Jenaer Schule für Mikrobielle Kommunikation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2) unterstützt

Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von menschlichen Buffy-Mänteln, die vom Institut für Transfusionsmedizin, Universitätsklinikum Jena, und frischem venösem Blut von Patienten nach schriftlicher Zustimmung der Spender gemäß der Genehmigung der Ethikkommission 4357-03/15 erhalten wurden.
1. Zubereitung von Aspergillus fumigatus Conidia
<ol><li>A. fumigatus auf 1,5% Malz-Agar-Petri-Schalen 5 Tage lang bei 37 °C ohne CO2anbauen. VORSICHT</s...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

Dieses Protokoll stellt eine zytometrische Schnelle-Flow-Methode zur Messung der Wechselwirkung von A. fumigatus conidia mit einer großen Anzahl primärer menschlicher Leukozyten dar, was in gängigen mikroskopischen Protokollen nicht möglich ist. Die Bildgebung von Zellen mit einem Mikroskop und das manuelle Zählen von internalisierter Konidie ist umständlich und kann realistischerweise nur für ein paar hundert Zellen durchgeführt werden. Durchflusszytometrie überwindet dieses Problem, indem Tausende von...

Invasive lungenaspergillose ist eine große Bedrohung für immungeschwächte Patienten, da die Behandlungsmöglichkeiten begrenzt sind und erst bei einer frühen Diagnose erfolgreich sind, was zu hohen Sterblichkeitsraten führt1. Infektionserreger sind Conidia (Sporen) der Form Aspergillus fumigatus, die in den meisten Lebensräumen allgegenwärtig sind2. Conidia werden eingeatmet, passieren die Atemwege und können schließlich in die Lungenalveolen gelangen. Bei immunkompetenten Menschen werden diese Conidien durch angeborene Immunzellen wie Monozyten oder Makrophagen und neutrophile Granulozyten, die die Erreger aufnehmen (Phagozytose) aufnehmen und verdauen, gelöscht3. Phagozytose ist wichtig für Mikrobiologen und Immunologen, auch wenn sie an Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen interessiert ist. Konfrontationstests, wie die Ko-Inkubation von Leukozyten und Conidie, umfassen häufig die Kennzeichnung der Sporen durch Fluorescein oder deren Derivat Fluoresceinisothiocyanat (FITC). Mit Hilfe eines Mikroskops ist es einfach, verinnerlichte fluoreszierende Konidien zu identifizieren und angehängte/haftende Konidien zu bestimmen, obwohl dieser Ansatz umständlich und realistischerweise auf ein paar hundert Zellen beschränkt ist4. In der Durchflusszytometrie, die die Analyse von Hunderttausenden von Zellen innerhalb von Minuten leicht ermöglicht, ist jedoch eine differenzielle Färbung von phagozytosierter und anhaftender Konidie von entscheidender Bedeutung. Daher verlassen sich viele Protokolle auf Trypan Blue, um fitC-Fluoreszenz aus der anhaftenden Conidia5,6,7,8zu löschen. Ein anderer Ansatz ist die Nutzung der Fluoreszenzresonanzenergieübertragung von Ethidiumbromid und FITC, um rote statt grüne Fluoreszenz aus der anhaftenden Konidie9,10,11auszusenden. Wenn spezifische Antikörper verfügbar sind, wie dies bei einigen Bakterien der Fall ist, können zellgebundene Partikel direkt gebeizt werden12,13.
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen und quantitativen Bewertung der Phagozytose von FITC-markierter A. fumigatus conidia durch menschliche Leukozyten zusammen mit der Anhaftung von Sporen an Zellen und mangelnder Wechselwirkung durch den Einsatz eines Mitwirkungsmittels (APC)-gekoppelten Anti-FITC-Antikörpers. Die Methode ermöglicht auch die gleichzeitige zytometrische Analyse weiterer Zellmarker, die für die separate Analyse der Phagozytose durch Monozyten und Neutrophilen aus derselben Probe eingesetzt werden können.
Das Protokoll kann für die Charakterisierung von Pilzstämmen (z. B. mehrere Arten von Aspergillus und anderen Schimmelpilzen aus der Gattung Mucorales, die hier vorgestellt werden) und deren Mutanten14 und immunologische Forschung an Phagozyten, wie Leukozyten von immungeschwächten Individuen, angewendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

Invasive Lungeninfektion durch den Schimmel Aspergillus fumigatus stellt eine große Bedrohung für immungeschwächte Patienten dar. Inhalierte Pilzkonidien (Sporen) werden von den menschlichen Lungenalveolen durch angeborene Monozyten und/oder Neutrophile phagozytoisiert. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Messung der Phagozytose durch Durchflusszytometrie mit Fluorescein isothiocyanat (FITC)-markierten Conidie nativ für die Ko-Inkubation mit menschlichen Leukozyten und anschließende Gegenfärbung mit einem Anti-FITC-Antikörper, um eine Diskriminierung von internalisiertem und zellhaftem Konidien zu ermöglichen. Wesentliche Vorteile dieses Protokolls sind seine Schnelligkeit, die Möglichkeit, den Assay mit der zytometrischen Analyse anderer Zellmarker von Interesse zu kombinieren, die gleichzeitige Analyse von Monozyten und Neutrophilen aus einer einzigen Probe und seine Anwendbarkeit auf andere zellwandtragende Pilze oder Bakterien. Die Bestimmung der Prozentsätze von Phagozytosing-Leukozyten bietet Mikrobiologen ein Mittel zur Beurteilung der Virulenz eines Erregers oder zum Vergleich von Pathogenwildarten und Mutanten sowie Immunologen zur Untersuchung der Fähigkeiten menschlicher Leukozyten zur Bekämpfung von Krankheitserregern.

Bei der Messung der Phagozytose von A. fumigatus conidia durch menschliche phagozytische Zellen ist die Diskriminierung zwischen echter Internalisierung und bloßer Bindung von Conidia an die Zellen ein Hindernis, insbesondere wenn es um Hochdurchsatzmethoden wie Durchflusszytometrie geht. Um diese Hürde zu überwinden, präsentieren wir ein schnelles und zuverlässiges Protokoll, das auf der Färbung von Conidia mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC vor der Koinkubation von Zellen und Konidien basiert, gefolgt von...

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Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Methode zur quantitativen Messung der Phagozytose der Aspergillus fumigatus conidia durch menschliche primäre Phagozyten mittels Durchflusszytometrie und zur Unterscheidung der Phagozytose der Conidia von der bloßen Adhäsion zu Leukozyten.

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es quantitativ phagozytose von markierten Aspergillus Fumigateurs Conidia durch menschliche Leukozyten, zusammen mit der Bindung von Conidia an Zellen, und Mangel an Interaktion durch Durchflusszytometrie misst. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass sie die schnelle Analyse einer großen Anzahl von Zellen erleichtert. Darüber hinaus ermöglicht die Etikettierung der Zellmarker eine getrennte Bewertung von Neutrophilen und Monozyten innerhalb derselben Probe.In jeder dieser Technik kann verwendet werden, um andere klinisch relevante Pilze wie Mucorales zu analysieren. Stattdessen könnten rote Blutkörperchen als Phagozyten verwendet werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, befeuchten Sie ein Papiertuch mit Desinfektionsmittel und legen Sie es in einen Bio-Sicherheitsschrank.Legen Sie eine Platte mit gewachsenem Aspergillus fumigatus auf das Papiertuch, um eine Überverteilung von flüchtigen Conidia zu verhindern. Fügen Sie 10 Milliliter PBS mit 0,01% Waschmittel auf den Pilz, und verwenden Sie einen Drigalski Spachtel, um die Flüssigkeit über die Platte zu verteilen, und reiben Sie die dunkel gefärbte Conidia. Übertragen Sie die Conidia-Suspension mit einem 30-Mikrometer-Sieb auf 50 Milliliter, wodurch restliche Mycelia entfernt werden.Fügen Sie weitere 10 Milliliter PBS mit Reinigungsmittel auf die Platte, verteilen Sie es mit einem Spachtel und übertragen Sie es in das gleiche Rohr durch das Sieb. Als nächstes bereiten Sie eine sterile Lösung von 0,1 molaren Natriumcarbonat, in PBS gelöst. Und bereiten Sie eine 0,1 Millimolar Lösung von FITC Pulver, in dieser Natriumcarbonat-Lösung.100 Millionen oder weniger Conidia in fünf Millilitern dieser FITC-Lösung in einem 15 Milliliter-Rohr wieder aussetzen. Inkubieren Sie in einem Rotator bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Um conidia anzuschwellen, setzen Sie das FITC mit der Bezeichnung Conidia in fünf Milliliter RPMI-Medium, ergänzt mit 10%FCS, wieder auf.Und in einem Rotator bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Zeit inkubieren. In einem Bio-Sicherheitsschrank fünf Milliliter Buffy-Mantel in ein 50-Milliliter-Rohr geben. Füllen Sie das Rohr mit EL-Puffer, und invertieren Sie dreimal.Horizontal für fünf bis acht Minuten inkubieren, bis das milchige Aussehen der Mischung klar wird. Dann Zentrifuge bei 300 mal G, und bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter EL-Puffer durch Pipettieren wieder auf.Fügen Sie weitere 24 Milliliter EL-Puffer hinzu und invertieren Sie das Rohr mehrmals. Zentrifuge bei 300 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in einem Milliliter RPMI-Medien wieder aus, ergänzt durch 10%FCS.Zunächst werden zwei Millionen Leukozyten und vier Millionen FITC-gekennzeichnete Conidia in 1,5 Milliliter RPMI, ergänzt mit 10%FCS, auf eine 12-Well-Kulturplatte übertragen. Schließen Sie eine Steuerung von Zellen nur ohne Conidia und eine Steuerung von Zellen mit nicht beschrifteter Conidia ein. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator, bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Zeit.Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu ernten, und übertragen Sie sie in ein 15 Milliliter-Rohr. Legen Sie zunächst 100 Mikroliter jeder Probe und Kontrollen in einen Brunnen einer 96-Well-V-Bodenplatte. Fügen Sie 150 Mikroliter PBS mit zwei Millimolaren EDTA zum Waschen hinzu.Zur Farbkompensation eine Million Zellen ohne Conidia für jede Farbe, in anderen Brunnen der Platte platzieren. Schließen Sie einen Brunnen von Zellen ein, die nicht trainiert werden. Fügen Sie 150 Mikroliter PBS mit zwei Millimolaren EDTA zu jedem Brunnen zum Waschen hinzu.Als nächstes bedecken Sie die Platte mit einer Klebefolie und Zentrifuge bei 300 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entfernen Sie dann die Folie und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell und gewaltsam nur einmal über dem Waschbecken oder einem Einweg-Papiertuch umkehren. Setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter Antikörper-Mix, und mischen Sie gut durch Pipettieren.Für Farbkompensationen die jeweiligen Zellen in 100 Mikroliter PBS, die zwei Millimolar EDTA enthalten, wieder aussetzen und jedem Bohrkörper einen einzigen Antikörpertyp hinzufügen, in der gleichen Menge, die in der Antikörpermischung verwendet wird. Mit einer Klebefolie abdecken und bei Raumtemperatur im Dunkeln 20 Minuten bebrüten. Danach entfernen Sie die Folie und fügen Sie 150 Mikroliter PBS mit zwei Millimolaren EDTA zu jedem Brunnen zum Waschen hinzu.Bedecken Sie die Platte erneut mit Klebefolie. Zentrifuge bei 300 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entfernen Sie dann die Folie, und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell und kraftvoll über ein Waschbecken oder ein Einweg-Papiertuch umkehren.Setzen Sie die Zellen in 200 Mikroliter PBS mit 2 Millimolaren EDTA aus und übertragen Sie die Zellsuspension von jedem Brunnen in ein separates rundes Unterrohr. Starten Sie das Durchflusszytometer, und lassen Sie es aufwärmen. Erstellen Sie in der Erfassungssoftware ein neues Experiment, richten Sie die neuen Beispiele ein und beschriften sie.Richten Sie die Parameter und Detektoren für die entsprechenden Fluorophore ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Zeigen Sie in dieser Software die entsprechenden Punktdiagramme an, wie im Textprotokoll beschrieben. Mit den Zellen nur Probe, erfassen einige Zellen und setzen Sie das Tor um Leukozyten.Basierend auf dem Leukozytentor, Tor für CD45-positive Zellen, um sich von Conidia im SSC CD45-Plot zu trennen. In einem Punktdiagramm, CD14, CD66b, Gate Neutrophilen und Monozyten separat. Danach wechseln Sie von den Zellen nur Probe, zu unbeschrifteten Conidia.In einem Punktdiagramm zeigen Anti-FITC, APC FITC Neutrophile in eingestellten Quadranten für Anti-FITC- und FITC-Signale an. Öffnen Sie die Statistikansicht, und passen Sie die Quadranten an, sodass maximal 1 % der Zellen in den Quadranten Q1, Q2 und Q4 angezeigt werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das Monozytentor. Zeichnen Sie im Leukozytentor alle Proben mit mindestens 20.000 Ereignissen auf.Phagozytose von FITC-markierten Conidia durch menschliche Neutrophile kann aus den Statistiken ansichten gelesen werden. In dieser Studie wird eine zytometrische Schnelle-Flow-Methode verwendet, um die Wechselwirkung von Aspergillus-Fumigateurs Conidia mit einer großen Anzahl primärer menschlicher Leukozyten zu messen. Unter Verwendung der entsprechenden Antikörper und der hier gezeigten Gating-Strategie folgt auf eine allgemeine Vermischung menschlicher Leukozyten durch FSC- und SSC-Eigenschaften eine Trennung von Leukozyten in freier Conidia durch den Pan Leukozytenmarker CD45.Conidia kann zum Zeitpunkt der Durchflusszytometrie fast zellgroße Personen erreichen, insbesondere bei Verwendung von geschwollenem Conidia und oder langen Inkubationszeiten, und kann uns somit eine Analyse kaufen. Da menschliche primäre Monozyten und Neutrophile Conidia unterschiedlich einnehmen, ermöglicht dieses Protokoll die getrennte Analyse dieser Zellpopulation basierend auf der Färbung mit den etablierten Zelllinienmarkern, CD14 für Monozyten und CD66b für Neutrophile. Der Prozentsatz der menschlichen primären Phagozyten, die Conidia verinnerlichen, kann unter den Blutspendern sehr variabel sein, hängt aber auch von experimentellen Faktoren wie Inkubationszeit und Schwellungszustand von Conidia ab.Sporeninternalisierung kann nach 0,5 Stunden Ko-Inkubation erkannt werden, und erhöht sich mit der Zeit. Vorgeschwollene Conidia werden auch bei kurzen Inkubationszeiten leichter aufgenommen als ruhende Sporen. Wenn Conidia mit Formaldehyd fixiert sind, wird Phagozytose im Vergleich zu nativen Conidia vermindert.Nach diesem Verfahren können Überstand von ko-inkubierten Immunzellen und Conidia von Eliza gesammelt und analysiert werden, um zu überprüfen, ob die Wechselwirkung eine Zytokinfreisetzung durch die Immunzellen hervorruft. Bitte denken Sie daran, dass menschliches Blut möglicherweise Infektionskrankheiten übertragen kann. Diese Arbeit erfordert eine Impfung über Hepatitis B, die Verwendung eines Bio-Sicherheitsschranks sowie das Tragen von Handschuhen an einem Labormantel.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Messung des Erythrozytenkomplementrezeptors 1 mit Durchflusszytometrie

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...