Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

אנו מודים לגברת פיה שטיר על סיוע טכני מעולה. מ. פון לילינפלד-Toal הוא נתמך על ידי המרכז לבקרת אלח דם וטיפול (משרד הפדרלי הגרמני של החינוך והבריאות, BMBF, FKZ 01E01002) והנגועים בקמפוס המחקר הגנוסטים (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai ואנג נתמך על ידי בית הספר היינה של תקשורת מיקרוביאלית (דויטשה פורשונגסביסםגיסמייססבאחאי, FKZ 214/2)

פרוטוקול זה כולל את השימוש של מעילים באפי האדם שהתקבלו מן המכון לרפואה עירוי, אוניברסיטת יינה בית החולים ובדם ורידי טרי שנמשך מחולים, הן לאחר בכתב הסכמה מושכלת של התורמים על פי אישור ועדת האתיקה 4357-03/15.
1. הכנת אספיוס מחטאים
<ol><li>. תגדל בירה. ב1.5% מאלט מנות פטרי במשך 5 ?...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

פרוטוקול זה מציג שיטת הזרמה מהירה של הסייטוטומטל למדוד אינטראקציה של המחט. בעלת מספר רב של לוקיציטים אנושיים מרכזיות שאינן אפשריות בפרוטוקולים מיקרוסקופים משותפים. הדמיה תאים עם מיקרוסקופ באופן ידני לספור הפניהמחט היא מסורבלת יכול להיעשות בצורה מציאותית עבור כמה מאות תאים בלבד. הא?...

הריאות פולשנית הריאתי הוא איום גדול לחולים חיסוני כמו אפשרויות הטיפול מוגבלות ורק מוצלח על אבחנה מוקדמת, אשר מוביל שיעורי תמותה גבוה1. החומרים הזיהומיות הם עצי מחט (נבגים) של העובש אספרגייוס , שנמצאים בכל מקום לבתי הגידולהשניים. המחט משאפים, עוברים דרך דרכי הנשימה והוא יכול לבסוף להיכנס לריאות מכתשי. בבני אדם החיסונית, המחט האלה מנוקה על ידי תאים חיסוניים מולדים כגון מונוציטים או מקרופאגים ו נויטרופילים גרנולוציטים, אשר לקחת (phagocytose) ולעכל את פתוגנים3. Phagocyציטוזה חשוב עבור מיקרו ביולוגים ואימונוולוגים גם כאשר מעוניינים אינטראקציה המארחים-הפתוגן. העימות אומר, כגון דגירה שיתוף של לוקיציטים ו מחט, לעתים קרובות כוללים תיוג של הנבגים על ידי fluorescein או הנגזרת הנגזרות שלה isothiocyanate (FITC). באמצעות מיקרוסקופ, זה פשוט לזהות את המחט פלורסנט הפנפנידיה כדי לקבוע המחט מצורף/חסיד, למרות גישה זו היא מסורבלת מוגבלת מציאותית לכמה מאות תאים4. עם זאת, בזרימה cy, אשר בקלות מאפשר ניתוח של מאות אלפי תאים בתוך דקות, מכתים ההפרש של המחט המגולמת וחסיד הוא חיוני. לכן, פרוטוקולים רבים מסתמכים על טריפה כחול כדי להרוות את הקרינה הפלואורסצנטיתמתוך מחט של 5,6,7,8. גישה נוספת היא לנצל את העברת אנרגיה התהודה הפלואורסצנטית של אתידיום ברומיד ו fitc לפלוט אדום במקום זריחה ירוקה מ חסיד מחט9,10,11. אם יש נוגדנים מסוימים זמינים, כמו במקרה של חיידקים מסוימים, חלקיקים מאוגדים תא יכול להיות מוכתם באופן ישיר12,13.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול במהירות ובקוונטי להעריך phagocyציטוזה של התווית FITC מתויג על ידי האדם לוקיציטים, יחד עם החזקה של נבגים לתאים וחוסר אינטראקציה על ידי העסקת allophycocyanin (APC)-ביחד נוגדן ANTI-fitc. השיטה מאפשרת גם ניתוח הציטוטומטט זרימה בו של סמנים תאים נוספים, כי ניתן ליישם ניתוח נפרד של phagocyציטוזה על ידי מונוציטים ו נויטרופילים מאותה דוגמית.
הפרוטוקול יכול להיות מיושם על אפיון של זנים פטרייתיים (למשל, מינים של אספרגינוס וצורות אחרות מסוג mucorales הציג כאן) ואת המוטציות שלהם14 ו מחקר אימונולוגיים על phagocytes, כגון לוקיציטים מאנשים שנפגעו חיסוני.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

דלקת בריאות פולשנית על ידי העובש אספרגייוס , מהווה איום גדול לחולים בסיכון חיסוני. שאפה פטרייתי פטריות (נבגים) נמחקים מן הריאה האנושית מכתשי על ידי להיות phagocytosed על ידי מונוציטים מולדת ו/או נויטרופילים. פרוטוקול זה מציע מדידה מהירה ואמינה של phagocyציטוזה על ידי זרימה cy, באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-מחט המסומנת לשיתוף הדגירה עם לוקיציטים האדם ולאחר הצביעת נגד נוגדנים נגד FITC כדי לאפשר אפליה של הפנפינט ותאי-חסיד המחט. היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם מהירות, האפשרות לשלב את הטיפול עם ניתוח ציטומטרי של סמני תאים אחרים של עניין, הניתוח הסימולטני של מונוציטים ונויטרופילים ממדגם אחד את הישימות שלה כדי הקיר אחר הנושאת הפטריות או חיידקים. קביעת אחוזים של לוקיציטים מספקת אמצעי למיקרו-ביולוגים להערכת התקפה אלימה של פתוגן או להשוואת סוגי הפתוגן והמוטציות, כמו גם למחלות אימונולוגים לחקירת יכולות לוקמיה אנושיים כדי להילחם בפתוגנים.

ב מדידת phagocyציטוזה של א. חיטוי המחט על ידי התאים האנושיים phagocytosis, האפליה בין הפנמה אמיתי מצורף גרידא של מחט לתאים הוא מכשול, במיוחד כשמדובר בשיטות תפוקה גבוהה כגון הזרימה cy, לנסות. על מנת להתגבר על משוכה זו, אנו מציגים פרוטוקול מהיר ואמין מבוסס על כתמים של עצי מחט עם צבען פלורסנט FITC לפני ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ואמינה כדי לכמת את phagocyציטוזה של אספגינוס באמצעות הפגוציטים הגוף האנושי באמצעות הזרימה cy, try ולהפלות את הפגוציטוזה של המחט מתוך הדבקה ללוקוציטים בלבד.

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מודד כמותית phagocytosis של שכותרתו Aspergillus fumigateurs Conidia על ידי לויקוציטים אנושיים, יחד עם ההחזקה של Conidia לתאים, וחוסר אינטראקציה על ידי ציטומטריית זרימה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מקלה על ניתוח מהיר של מספר רב של תאים. בנוסף, תיוג של סמני התא מאפשר להפריד הערכה של נויטרופילים ומונוציטים בתוך אותה מדגם.בכל טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לנתח פטריות רלוונטיות קליניות אחרות כמו Mucorales. במקום זאת תאי דם אדומים עשויים לשמש phagocytes. כדי להתחיל בהליך זה, הרטיב מגבת נייר עם חומר חיטוי, והכנס אותה לארון בטיחות ביולוגי.מניחים צלחת של אספרגילוס פומיגטוס גדל על גבי מגבת נייר כדי למנוע הפצת יתר של Conidia נדיף. מוסיפים 10 מיליליטר של PBS המכילים 0.01% חומר ניקוי על גבי הפטרייה, ולהשתמש מרית Drigalski להפיץ את הנוזל על הצלחת, ולשפשף את Conidia בצבע כהה. העבר את ההשעיה Conidia ל 50 מיליליטר דרך מסננת 30 מיקרומטר, אשר יסיר כל מיסליה שיורית.מוסיפים עוד 10 מיליליטר של PBS עם חומר ניקוי לצלחת, להפיץ אותו עם מרית, ולהעביר אותו לאותו צינור דרך מסננת. לאחר מכן, להכין פתרון סטרילי של 0.1 נתרן פחמתי טוחן, מומס PBS. ולהכין פתרון 0.1 מילימולרי של אבקת FITC, בתתבה זו נתרן קרבונט.להשעות מחדש 100 מיליון או פחות Conidia, בחמישה מיליליטר של פתרון FITC זה, בצינור 15 מיליליטר. דגירה במסובב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. כדי להתנפח לקונדיה, יש להשתמש מחדש ב-FITC שכותרתו Conidia בחמישה מיליליטר של מדיום RPMI, בתוספת 10%FCS.ותדוגר בסובב ב-37 מעלות צלזיוס לזמן הרצוי. בארון בטיחות ביולוגי, מניחים חמישה מיליליטר של מעיל באפי לתוך צינור 50 מיליליטר. מלא את הצינור עם חיץ EL, והתהפך שלוש פעמים.דגירה אופקית במשך חמש עד שמונה דקות, עד המראה החלבי של התערובת הופך ברור. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 300 פעמים G, ו בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. השלך את העל-טבעי והתקן מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של חיץ EL על-ידי צינורות.הוסף עוד 24 מיליליטר של חיץ EL, ולהפוך את הצינור מספר פעמים. צנטריפוגה ב 300 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים במיליליטר אחד של מדיית RPMI, בתוספת 10%FCS.כדי להתחיל, להעביר שני מיליון לויקוציטים וארבעה מיליון CONIDIA FITC שכותרתו 1.5 מיליליטר של RPMI בתוספת 10% FCS, לצלחת תרבות 12 היטב. כלול פקד של תאים ללא קונידיה בלבד ושליטה בתאים עם Conidia ללא תריס. אין לארוב את הצלחת באינקובטור פחמן דו חמצני לח, ב 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי.כאשר הדגירה הושלמה, להשתמש מגרד תאים כדי לקצור את התאים, ולהעביר אותם צינור 15 מיליליטר. ראשית, לשים 100 microliters של כל מדגם שולט לתוך באר אחת של צלחת V-התחתון 96-well. הוסף 150 microliters של PBS המכיל שני מילימולר של EDTA לכביסה.לפיצוי צבע, מקם מיליון תאים ללא Conidia עבור כל צבע, בארות אחרות של הצלחת. כלול באר של תאים שישארו ללא מעצורים. הוסף 150 microliters של PBS המכיל שני מילימולר של EDTA לכל באר לכביסה.לאחר מכן, מכסים את הצלחת בנייר דבק, ואת הצנטריפוגה ב 300 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את נייר הכסף ולהשליך את העל טבעי על ידי היפוך מהיר וכוחי של הצלחת רק פעם אחת מעל הכיור, או מגבת נייר חד פעמית. תערבב את התאים ב-100 מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים, ותערבב היטב על ידי צינורות.לפיצוי צבע, יש להשתמש מחדש בתאים המתאימים ב-100 מיקרוליטרים של PBS המכילים שני מילימולרים של EDTA, ולהוסיף סוג נוגדן יחיד לכל באר, באותה כמות המשמשת בתמהיל הנוגדנים. מכסים בנייר דבק, ו דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 20 דקות. לאחר מכן, להסיר את נייר הכסף ולהוסיף 150 microliters של PBS המכיל שני מילימולר של EDTA לכל באר לכביסה.מכסים את הצלחת בנייר דבק שוב. צנטריפוגה ב 300 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן להסיר את נייר הכסף, ולהשליך את העל טבעי על ידי היפוך מהיר וכוחני של הצלחת מעל כיור או מגבת נייר חד פעמית.תן שימוש חוזר בתאים ב-200 מיקרוליטרים של PBS המכילים 2 מילימולרים EDTA, והעבר את מתלי התא מכל באר, לצינור תחתון עגול נפרד. התחל את ציטומטר הזרימה, ותן לו להתחמם. בתוכנת הרכישה, צור ניסוי חדש והגדר ותייג את הדגימות החדשות.הגדר את הפרמטרים ואת הגלאים עבור הפלואורופורים המתאימים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בתוכנה זו, הצג את התוויות הנקודות המתאימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. באמצעות התאים רק לדגום, לרכוש תאים מסוימים ולהגדיר את השער סביב לויוציטים.מבוסס על שער לויוציט, שער לתאים חיוביים CD45, להיפרד Conidia בעלילה SSC CD45. בעלילה נקודה, CD14, CD66b, נויטרופילים שער מונוציטים בנפרד. לאחר מכן, עבור מהתאים רק מדגם, לקונידיה ללא תריס.בעליית נקודה, אנטי-FITC, APC FITC, הצג נויטרופילים ברבעים מוגדרים לאותות אנטי-FITC ו-FITC. פתח את תצוגת הסטטיסטיקה והתאם את הרבעים, ואפשר עד 1% מהתאים ברבעים Q1, Q2 ו- Q4. חזור על תהליך זה עבור שער המונוציטים. בשער לויוצ'יט, רשום את כל הדגימות עם לפחות 20,000 אירועים.Phagocytosis של FITC שכותרתו Conidia על ידי נויטרופילים אנושיים ניתן לקרוא מן ההשקפות הסטטיסטיקה. במחקר זה, שיטה ציטומטרית זרימה מהירה משמשת למדידת האינטראקציה של אספרגילוס fumigateurs Conidia עם מספר רב של לויקוציטים אנושיים ראשוניים. באמצעות הנוגדנים המתאימים ואת האסטרטגיה gating המוצגים כאן, gating כללי של לויוציטים אנושיים על ידי מאפייני FSC ו- SSC, ואחריו הפרדה של לויוציטים בקונידיה חינם, על ידי סמן פאן לויוציטים, CD45.Conidia יכול להגיע כמעט גודל התא בזמן ציטומטריה זרימה, במיוחד בעת שימוש Conidia נפוח, או זמני דגירה ארוכים, ולכן יכול לקנות לנו ניתוח. מאז מונוציטים ראשוניים אנושיים נויטרופילים לקחת Conidia באופן שונה, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח נפרד של אוכלוסיית תאים אלה מבוסס, על כתמים עם סמני שושלת התא הוקמה היטב, CD14 עבור מונוציטים, ו CD66b עבור נויטרופילים. אחוז phagocytes העיקרי האנושי הפנמת Conidia יכול להיות משתנה מאוד בקרב תורמי הדם, אבל גם תלוי בגורמים ניסיוניים, כגון זמן הדגירה מצב נפיחות של Conidia.הפנמת נבגים ניתן לזהות לאחר 0.5 שעות של דגירה שותף, ועליות עם הזמן. Conidia טרום נפוח נלקחים קל יותר מאשר נבגים נחים, אפילו בזמני דגירה קצרים. אם Conidia קבועים עם פורמלדהיד, phagocytosis מצטמצם בהשוואה קונידיה הילידים.בעקבות הליך זה, על-טבעיים של תאים חיסוניים דוגרים במשותף ו Conidia ניתן לאסוף ולנתח על ידי אלייזה כדי לבדוק אם האינטראקציה מעוררת שחרור ציטוקינים על ידי התאים החיסוניים. אנא זכור, דם אנושי יכול להעביר מחלות זיהומיות. עבודה זו דורשת חיסון ברחבי הפטיטיס B, שימוש בארון בטיחות ביו, כמו גם ללבוש כפפות במעיל מעבדה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

בידוד של לוקיולוציטים מחלב השד האנושי לשימוש בנוגדן-מותנה תאית הסלולר שיטת מטרות HIV

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

מדידת קולטן אריתרופוציט 1 באמצעות שימוש בשיטת זרימה

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...