Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
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हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए श्रीमती पिया Stier शुक्रिया अदा करते हैं । एम वॉन लिलिएनफेल्ड-टॉल को केंद्र द्वारा सेप्सिस कंट्रोल एंड केयर (जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री ऑफ एजुकेशन एंड हेल्थ, बीएमबीएफ, एफकेजेड 01E01002) और इंफेनोग्नोस्टिक्स रिसर्च कैंपस (बीएमबीएफ, एफकेजेड 13GW0096D) द्वारा समर्थित किया जाता है। थी Ngoc माई होआंग माइक्रोबियल कम्युनिकेशन के जेना स्कूल द्वारा समर्थित है (ड्यूश Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)

इस प्रोटोकॉल में ट्रांसफ्यूजन मेडिसिन, जेना विश्वविद्यालय अस्पताल के लिए संस्थान से प्राप्त मानव बफी कोट और रोगियों से तैयार ताजा शिरारक्त का उपयोग शामिल है, दोनों नैतिकता समिति की मंजूरी 4357-03/15 के अनु?...

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	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल बड़ी संख्या में प्राथमिक मानव ल्यूकोसाइट्स के साथ ए फ्यूमिगाटस कोनिडिया की बातचीत को मापने के लिए एक तेज प्रवाह साइटोमेट्रिक विधि प्रस्तुत करता है जो आम सूक्ष्म प्रोटोकॉल में संभव न?...

इनवेसिव पल्मोनरी एस्परगिलोसिस इम्यूनोमोडिएग किए गए रोगियों के लिए एक बड़ा खतरा है क्योंकि उपचार विकल्प सीमित हैं और केवल प्रारंभिक निदान पर सफल होते हैं, जिससे उच्च मृत्यु दर1हो जाती है। संक्रामक एजेंट मोल्ड एस्परगिलस फ्यूमिगाटस के कोनिडिया (बीजाणु) हैं जो अधिकांश आवासों के लिए सर्वव्यापीहैं। कोनिडिया साँस ले रहे हैं, वायुमार्ग के माध्यम से गुजरती हैं और अंत में फेफड़ों के अल्वेली में प्रवेश कर सकती हैं। इम्यूनोसक्षम मनुष्यों में, इन कोनिडिया को जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे मोनोसाइट्स या मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल ग्रैनुलोसाइट्स द्वारा साफ किया जाता है, जो (फागोसाइटोज) लेते हैं और रोगजनकोंको पचातेहैं 3। मेजबान-रोगजनक बातचीत में रुचि होने पर माइक्रोबायोलॉजिस्ट और इम्यूनोलॉजिस्ट के लिए Phagocytosis महत्वपूर्ण है। टकराव के परख, जैसे ल्यूकोसाइट्स और कोनिडिया का सह-ऊष्मायन, अक्सर फ्लोरोसेइन या इसके डेरिवेटिव फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइनेट (एफईसी) द्वारा बीजाणुओं की लेबलिंग शामिल है। माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, आंतरिक फ्लोरोसेंट कोनिडिया की पहचान करना और संलग्न/अनुयायी कोनिडिया निर्धारित करना सीधा है, हालांकि यह दृष्टिकोण बोझिल है और वास्तविक रूप से कुछ सैकड़ों कोशिकाओं तक सीमित है4। हालांकि, प्रवाह साइटोमेट्री में जो आसानी से मिनटों के भीतर सैकड़ों हजारों कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है, फागोसाइटोस और अनुयायी कोनिडिया का अंतर बहुत महत्वपूर्ण है। इसलिए, कई प्रोटोकॉल ट्राइपैन ब्लू पर भरोसा करते हैं ताकि वह पालन करनेवाले5, 6,7,8से फिटेक-फ्लोरेसेंस को बुझा सके। एक अन्य दृष्टिकोण एहिडियम ब्रोमाइड और फिटेक के फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण का शोषण कर रहा है ताकि वे अनुयायी कोनिडिया9,10,11से हरे रंग के फ्लोरेसेंस के बजाय लाल रंग का उत्सर्जन कर सके । यदि विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, जैसा कि कुछ बैक्टीरिया के लिए मामला है, तो सेल-बाउंड कणों को सीधे12,13दाग दिया जा सकता है।
यहां, हम एक एंटी-फिटिक एंटीबॉडी के साथ-साथ कोशिकाओं को बीजाणुओं के लगाव और बातचीत की कमी के साथ मानव ल्यूकोसाइट्स द्वारा एफईसी-लेबल ए फ्यूमिगेटस कोनिडिया के फागोसाइटोसिस का जल्दी और मात्रात्मक आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। विधि आगे के सेल मार्कर के एक साथ प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए भी अनुमति देती है जिसे एक ही नमूने से मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल द्वारा फागोसाइटोसिस के अलग विश्लेषण के लिए नियोजित किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल कवक उपभेदों के लक्षण वर्णन के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, यहां प्रस्तुत जीनस मुकोरल्स से एस्परगिलस की कई प्रजातियां और अन्य मोल्ड) और उनके म्यूटेंट14 और फागोसाइट्स पर इम्यूनोलॉजिकल रिसर्च, जैसे इम्यूनोसमझौता व्यक्तियों से ल्यूकोसाइट्स।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

मोल्ड एस्परगिलस फ्यूमिगाटस द्वारा इनवेसिव पल्मोनरी संक्रमण इम्यूनोसमझौता रोगियों के लिए एक बड़ा खतरा बन गया है। साँस कवक कोनिडिया (बीजाणु) मानव फेफड़ों के अल्वेली से सहज मोनोसाइट्स और/या न्यूट्रोफिल द्वारा फैगोसाइटोस किए जाने से साफ हो जाते हैं । यह प्रोटोकॉल फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइट (एफईसी) का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा फागोसाइटोसिस का एक तेज और विश्वसनीय माप प्रदान करता है- मानव ल्यूकोसाइट्स के साथ सह-ऊष्मायन के लिए कोनिडिया लेबल और बाद में एक एंटी-फिटेक एंटीबॉडी के साथ प्रतिधुंधला करने के लिए आंतरिक और सेल-अनुयायी कोनिडिया के भेदभाव की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के प्रमुख फायदे इसकी तेजी, ब्याज के अन्य सेल मार्कर के साइटोमेट्रिक विश्लेषण के साथ परख को संयोजित करने की संभावना, एक ही नमूने से मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल का एक साथ विश्लेषण और अन्य सेल दीवार-असर कवक या बैक्टीरिया के लिए इसकी प्रयोज्यता है। रोगोकोसाइट्स के प्रतिशत का निर्धारण रोगाणु की उग्रता का मूल्यांकन करने या रोगजनक वाइल्डटाइप और म्यूटेंट की तुलना करने के साथ-साथ रोगजनकों का मुकाबला करने के लिए मानव ल्यूकोसाइट क्षमताओं की जांच के लिए इम्यूनोलॉजिस्ट के लिए माइक्रोबायोलॉजिस्ट को एक साधन प्रदान करता है।

मानव फागोसाइटिक कोशिकाओं द्वारा ए फ्यूमिगाटस कोनिडिया के फागोसाइटोसिस को मापने में, वास्तविक आंतरिककरण और कोशिकाओं के लिए कोनिडिया के मात्र लगाव के बीच भेदभाव एक बाधा है, खासकर जब यह प्रवाह साइटो...

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Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

यह प्रोटोकॉल फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके मानव प्राथमिक फैगोसाइट्स द्वारा एस्परगिलस फ्यूमिगेटस कोनिडिया के फागोसाइटोसिस को मात्रात्मक रूप से मापने और केवल आसंजन से ल्यूकोसाइट्स तक कोनिडिया के फागोसाइटोसिस को भेदभाव करने के लिए एक तेज और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है।

फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके मानव ल्यूकोसाइट्स द्वारा एस्परगिलस फ्यूमिगटस कोनिडिया के फागोसाइटोसिस को मापना

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह मात्रात्मक रूप से मानव ल्यूकोसाइट्स द्वारा लेबल वाले एस्परगिलस फ्यूमिगेटर्स कोनिडिया के फागोसिटोसिस को मापता है, साथ ही कोशिकाओं के लिए कोनिडिया के लगाव के साथ, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा बातचीत की कमी। इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि यह बड़ी संख्या में कोशिकाओं के तेजी से विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, सेल मार्कर की लेबलिंग एक ही नमूने के भीतर न्यूट्रोफिल और मोनोसाइट्स के मूल्यांकन को अलग करने की अनुमति देती है।किसी भी तकनीक में मुकोरल्स जैसे अन्य नैदानिक प्रासंगिक कवक का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसके बजाय लाल रक्त कोशिकाओं को phagocytes के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, कीटाणुनाशक के साथ एक कागज तौलिया गीला, और यह एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में जगह है ।अस्थिर कोनिडिया के अधिक वितरण को रोकने के लिए कागज तौलिया के शीर्ष पर उगाए गए एस्परगिलस फ्यूमिगटस की एक प्लेट रखें। कवक के शीर्ष पर 0.01% डिटर्जेंट वाले पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें, और प्लेट पर तरल फैलाने के लिए एक ड्रिगलस्की स्पैटुला का उपयोग करें, और गहरे रंग के कोनिडिया को रगड़ें। कोनिडिया निलंबन को 30 माइक्रोमीटर छलनी के माध्यम से 50 मिलीलीटर में स्थानांतरित करें, जो किसी भी अवशिष्ट मायसेलिया को हटा देगा।प्लेट में डिटर्जेंट के साथ पीबीएस के एक और 10 मिलीलीटर जोड़ें, इसे एक स्पैटुला के साथ फैलाएं, और इसे छलनी के माध्यम से एक ही ट्यूब में स्थानांतरित करें। इसके बाद, पीबीएस में भंग 0.1 मोलर सोडियम कार्बोनेट का बाँझ समाधान तैयार करें। और इस सोडियम कार्बोनेट समाधान में फिटसी पाउडर का 0.1 मिलीमोलर समाधान तैयार करें।15 मिलीलीटर ट्यूब में, इस फिटसी समाधान के पांच मिलीलीटर में 100 मिलियन या उससे कम कोनिडिया को फिर से निलंबित करें। 20 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर में इनक्यूबेट । कोनिडिया को प्रफुल्लित करने के लिए, 10% एफसीएस के साथ पूरक, आरपीएमआई माध्यम के पांच मिलीलीटर में फिटसी लेबल कोनिडिया को फिर से खर्च करें।और वांछित समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर में इनक्यूबेट। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, बफी कोट के पांच मिलीलीटर को 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। ईएल बफर के साथ ट्यूब भरें, और तीन बार उलटा।पांच से आठ मिनट के लिए क्षैतिज रूप से इनक्यूबेट करें, जब तक कि मिश्रण की दूधिया उपस्थिति स्पष्ट न हो जाए। फिर, 300 गुना जी पर अपकेंद्रित्र, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर। सुपरनेट को त्यागें और गोली को पिपटिंग करके एल बफर के एक मिलीलीटर में फिर से खर्च करें।ईएल बफर के एक और 24 मिलीलीटर जोड़ें, और ट्यूब को कई बार उलटा करें। ३०० बार जी पर और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र । सुपरनैट को त्यागें और कोशिकाओं को आरपीएमआई मीडिया के एक मिलीलीटर में फिर से खर्च करें, 10% एफसीएस के साथ पूरक हों।शुरू करने के लिए, 12-अच्छी संस्कृति प्लेट में 10% एफसीएस के साथ पूरक आरपीएमआई के 1.5 मिलीलीटर में दो मिलियन ल्यूकोसाइट्स और चार मिलियन फिटसी-लेबल कोनिडिया को स्थानांतरित करें। केवल बिना कोनिडिया के साथ कोशिकाओं का नियंत्रण शामिल करें, और अवेलेबल कोनिडिया वाली कोशिकाओं का नियंत्रण शामिल करें। एक आर्द्र कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में थाली इनक्यूबेट, समय की वांछित राशि के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।जब इनक्यूबेशन पूरा हो जाता है, तो कोशिकाओं को फसल करने के लिए एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें, और उन्हें 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। सबसे पहले, प्रत्येक नमूने के 100 माइक्रोलीटर रखें और 96-वेल वी-बॉटम प्लेट के एक कुएं में नियंत्रित करते हैं। धुलाई के लिए ईडीटीए के दो मिलीमोलर वाले पीबीएस के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें।रंग क्षतिपूर्ति के लिए, प्लेट के अन्य कुओं में प्रत्येक रंग के लिए कोनिडिया के बिना दस लाख कोशिकाओं को रखें। कोशिकाओं का एक कुआं शामिल करें जो अप्रशिक्षित छोड़ दिया जाएगा। धोने के लिए प्रत्येक कुएं में ईडीटीए के दो मिलीमोलर युक्त पीबीएस के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें।इसके बाद, एक चिपकने वाली पन्नी के साथ थाली को कवर करें, और 300 बार जी पर और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र करें। फिर, पन्नी को हटा दें और जल्दी से और जबरदस्ती प्लेट को सिंक, या डिस्पोजेबल पेपर तौलिया पर एक बार उलटा करके सुपरनटेंट को त्याग दें। एंटीबॉडी मिक्स के 100 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।रंग मुआवजे के लिए, ईडीए के दो मिलीमोलर वाले पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर में संबंधित कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और एंटीबॉडी मिश्रण में उपयोग की जाने वाली एक ही राशि पर प्रत्येक कुएं में एक एंटीबॉडी प्रकार जोड़ें। एक चिपकने वाली पन्नी के साथ कवर करें, और 20 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, पन्नी को हटा दें और धोने के लिए प्रत्येक कुएं में ईडीटीए के दो मिलीमोलर वाले पीबीएस के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें।चिपकने वाली पन्नी के साथ थाली को फिर से कवर करें। ३०० बार जी पर और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र । फिर पन्नी को हटा दें, और जल्दी से और जबरदस्ती प्लेट को सिंक या डिस्पोजेबल पेपर तौलिया पर उलटा करके सुपरनेट को त्याग दें।2 मिलीमोलर ईडीटीए युक्त पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से रीसुस्ट करें, और सेल निलंबन को प्रत्येक कुएं से एक अलग गोल नीचे ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रवाह साइटोमीटर शुरू करें, और इसे गर्म होने दें। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, एक नया प्रयोग बनाएं, और नए नमूनों को सेट और लेबल करें।पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित उपयुक्त फ्लोरोफोरस के लिए मापदंडों और डिटेक्टरों को सेट करें। इस सॉफ्टवेयर में, टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित उपयुक्त डॉट भूखंडों को प्रदर्शित करें। कोशिकाओं का उपयोग केवल नमूना, कुछ कोशिकाओं को प्राप्त करने और ल्यूकोसाइट्स के आसपास गेट सेट।ल्यूकोसाइट गेट के आधार पर, सीडी 45 पॉजिटिव सेल के लिए गेट, एसएससी सीडी45 प्लॉट में कोनिडिया से अलग होना। एक डॉट प्लॉट में, सीडी 14, सीडी66बी, गेट न्यूट्रोफिल और मोनोसाइट्स अलग से। इसके बाद, कोशिकाओं से केवल नमूना बदलें, अवेलेबल कोनिडिया में।डॉट प्लॉट में एंटी-फिटसी, एपीसी फिटसी, एंटी-फिटसी के लिए सेट क्वाड्रंट्स में न्यूट्रोफिल डिस्प्ले करते हैं, और फिटसी सिग्नल । आंकड़े देखें और क्वाड्रंट्स को समायोजित करें, जिससे क्वाड्रंट्स Q1, Q2 और Q4 में अधिकतम 1% कोशिकाएं हो सकती हैं। मोनोसाइट गेट के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। ल्यूकोसाइट गेट में, कम से कम 20, 000 घटनाओं के साथ सभी नमूनों को रिकॉर्ड करें।मानव न्यूट्रोफिल द्वारा फिटसी-लेबल कोनिडिया के फागोसिटोसिस को सांख्यिकी विचारों से पढ़ा जा सकता है। इस अध्ययन में, एक तेज प्रवाह साइटोमेट्रिक विधि का उपयोग बड़ी संख्या में प्राथमिक मानव ल्यूकोसाइट्स के साथ एस्परगिलस फ्यूमिगेटर्स कोनिडिया की बातचीत को मापने के लिए किया जाता है। उपयुक्त एंटीबॉडी और गेटिंग रणनीति का उपयोग करके यहां दिखाया गया है, एफएससी और एसएससी विशेषताओं द्वारा मानव ल्यूकोसाइट्स की एक सामान्य गेटिंग, पैन ल्यूकोसिटे मार्कर, सीडी 45 द्वारा मुफ्त कोनिडिया में ल्यूकोसाइट्स के अलगाव के बाद होती है।कोनिडिया प्रवाह साइटोमेट्री के समय लगभग सेल आकार तक पहुंच सकता है, खासकर जब सूजन कोनिडिया का उपयोग कर, और या लंबे समय इनक्यूबेशन समय, और इस तरह हमें विश्लेषण खरीद सकते हैं। चूंकि मानव प्राथमिक मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल को कोनिडिया अलग-अलग लेते हैं, इसलिए यह प्रोटोकॉल इन सेल आबादी के अलग विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जो अच्छी तरह से स्थापित सेल वंश मार्कर के साथ धुंधला होने पर, मोनोसाइट्स के लिए सीडी 14 और न्यूट्रोफिल के लिए सीडी 66b है। कोनिडिया को आंतरिक मानव प्राथमिक phagocytes का प्रतिशत रक्तदाताओं के बीच अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकता है, लेकिन यह भी प्रयोगात्मक कारकों पर निर्भर करता है, जैसे इनक्यूबेशन समय और Conidia की सूजन राज्य ।बीजाणु आंतरिककरण का पता सह-इनक्यूबेशन के 0.5 घंटे के बाद लगाया जा सकता है, और समय के साथ बढ़ जाता है। पहले से सूजन कोनिडिया को आराम बीजाणुओं की तुलना में आसानी से लिया जाता है, यहां तक कि कम इनक्यूबेशन समय में भी। यदि कोनिडिया को फॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया जाता है, तो देशी कोनिडिया की तुलना में फागोसिटोसिस कम हो जाता है।इस प्रक्रिया के बाद, सह-इनक्यूबेटेड प्रतिरक्षा कोशिकाओं और कोनिडिया के अधिनाटियों को एलिजा द्वारा एकत्र और विश्लेषण किया जा सकता है ताकि यह जांच की जा सके कि क्या बातचीत प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा साइटोकिन रिलीज को प्राप्त करती है। कृपया याद रखें, मानव रक्त संभावित संक्रामक रोगों को संचारित कर सकता है। इस काम के लिए हेपेटाइटिस बी में टीकाकरण, जैव सुरक्षा कैबिनेट के उपयोग के साथ-साथ प्रयोगशाला कोट पर दस्ताने पहनने की आवश्यकता होती है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

फिक्स्ड और जीवित कोशिकाओं में प्रवाह cytometry द्वारा Calpain गतिविधि को मापने

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

मानवीय इन विट्रो में इम्यून असंतुलन का एक प्रारंभिक राज्य की मान्यता के लिए स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में दमन

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

फ्लो द्वारा A549 कोशिकाओं में लगाव और Internalization इन्फ्लूएंजा के एक वायरस को मापने

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

मानव रक्त में मापने कणांकुर और Monocyte phagocytosis और ऑक्सीडेटिव फट गतिविधि

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

के जवाब में मानव प्राथमिक न्यूट्रोफिल और Monocytes द्वारा रोधी गतिविधि का लाइव इमेजिंग<em&gt; एक। fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

अलगाव और इन विट्रो संस्कृति Murine और मानव वायुकोशीय मैक्रोफेज

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

पूरे रक्त प्रवाह Cytometry विश्लेषण द्वारा मानव Monocyte सबसेट का लक्षण वर्णन

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

एचआईवी लक्ष्यों की एक एंटीबॉडी पर निर्भर सेलुलर Phagocytosis परख में उपयोग के लिए मानव स्तन दूध से Leukocytes के अलगाव

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

मापने एरिथ्रोसाइट पूरक रिसेप्टर 1 प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...