Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Ringraziamo la signora Pia Stier per l'eccellente assistenza tecnica. M. von Lilienfeld-Toal è supportato dal Center for Sepsis Control and Care (Ministero federale tedesco dell'istruzione e della salute, BMBF, FK, FK, 01E01002) e dal campo di ricerca InfectoGnostics (BMBF, FK-13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang è supportato dalla Jena School of Microbial Communication (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FK 214/2)

Questo protocollo include l'uso di camici buffy umani ottenuti dall'Institute for Transfusion Medicine, jena University Hospital e sangue venoso fresco prelevato dai pazienti, sia dopo il consenso informato scritto dei donatori in conformità con l'approvazione del comitato etico 4357-03/15.
1. Preparazione di Aspergillus fumigatus Conidia
<ol><li>Coltivare A. fumigatus su 1,5% di malto agar Petri piatti per 5 giorni a 37 gradi centigradi senza CO2. A....

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

Questo protocollo presenta un metodo citometrico a flusso rapido per misurare l'interazione di A. fumigatus conidia con un gran numero di leucociti umani primari che non è possibile nei protocolli microscopici comuni. L'imaging delle cellule con un microscopio e il conteggio manuale delle conidie interiorizzate sono ingombranti e possono realisticamente essere eseguite solo per alcune centinaia di cellule. La citometria di flusso supera questo problema misurando migliaia di cellule in pochi minuti. Un ostacolo ...

L'aspergillosi polmonare invasiva è una grande minaccia per i pazienti immunocompromessi in quanto le opzioni di trattamento sono limitate e hanno successo solo dopo la diagnosi precoce, il che porta ad alti tassi di mortalità1. Gli agenti infettivi sono conidia (spore) dello stampo Aspergillus fumigatus che sono onnipresenti per la maggior parte degli habitat2. I Conidia vengono inalati, passano attraverso le vie aeree e possono finalmente entrare negli alveoli polmonari. Negli esseri umani immunocompetenti, queste conidie vengono eliminate da cellule immunitarie innate come monociti o macrofagi e granulociti neutrofili, che assumono (fagocitosi) e digeriscono gli agenti patogeni3. La fagocitosi è importante per i microbiologi e gli immunologi allo stesso modo quando sono interessati alle interazioni ospite-patogeno. I saggi di confronto, come la co-incubazione di leucociti e conidi, spesso includono l'etichettatura delle spore da fluoresceina o dalla sua fluoresceina derivata isothiocyanate (FITC). Utilizzando un microscopio, è semplice identificare conidia fluorescente interiorizzata e determinare la conidia collegata / aderente, anche se questo approccio è ingombrante e realisticamente limitato a poche centinaia di cellule4. Tuttavia, nella citometria di flusso che consente facilmente l'analisi di centinaia di migliaia di cellule in pochi minuti, la colorazione differenziale di conidia fagocitosa e aderente è vitale. Pertanto, molti protocolli si basano su Trypan Blue per dissetare FITC-fluorescenza da aderente conidia5,6,7,8. Un altro approccio è lo sfruttamento del trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza di bromuro di etidio e FITC per emettere rosso invece di fluorescenza verde da aderente conidia9,10,11. Se sono disponibili anticorpi specifici, come nel caso di alcuni batteri, le particelle legate alle cellule possono essere macchiate direttamente12,13.
Qui, presentiamo un protocollo per valutare rapidamente e quantitativamente la fagocitosi di A. fumigatus conidia con ileuciti umani insieme all'attaccamento delle spore alle cellule e alla mancanza di interazione utilizzando un anticorpo anti-FITC accoppiato all'allocazione (APC). Il metodo consente anche l'analisi citometrica a flusso simultaneo di ulteriori marcatori cellulari che possono essere impiegati per l'analisi separata della fagocitosi da monociti e neutrofili dello stesso campione.
Il protocollo può essere applicato per la caratterizzazione dei ceppi fungini (ad esempio, diverse specie di Aspergillus e altri stampi del genere Mucorales qui presentati) e dei loro mutanti14 e ricerca immunologica sui fagociti, come i leucociti da individui immunocompromessi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

L'infezione polmonare invasiva da parte dello stampo Aspergillus fumigatus rappresenta una grande minaccia per i pazienti immunocompromessi. Le conidia fungine inalate (spore) vengono eliminate dagli alveoli polmonari umani per essere fagocitosed da monociti innati e/o neutrofili. Questo protocollo offre una misurazione rapida e affidabile della fagocitosi mediante citometria di flusso utilizzando conidia con etichettatura fitC (isotonionnate) con etichettatura fitC (FITC) per la co-incubazione con leucociti umani e la successiva controtendenza con un anticorpo anti-FITC per consentire la discriminazione dei conerentidi internalizzati e addicenti delle cellule. I principali vantaggi di questo protocollo sono la sua rapidità, la possibilità di combinare l'analisi con l'analisi citometrica di altri marcatori cellulari di interesse, l'analisi simultanea di monociti e neutrofili da un singolo campione e la sua applicabilità ad altri funghi o batteri che portano la parete cellulare. La determinazione delle percentuali di fagocitosi sui leucociti fornisce un mezzo ai microbiologi per valutare la virulenza di un agente patogeno o per confrontare patogeni tipi selvatici e mutanti, nonché con gli immunologi per studiare le capacità di leucociti umani per combattere gli agenti patogeni.

Nella misurazione della fagocitosi di A. fumigatus conidia da cellule fagocitiche umane, la discriminazione tra l'autentica internalizzazione e il semplice attaccamento di conidia alle cellule è un ostacolo, soprattutto quando si tratta di metodi ad alto throughput come la citometria di flusso. Al fine di superare questo ostacolo, presentiamo un protocollo veloce e affidabile basato sulla colorazione della conidia con la tintura fluorescente FITC prima della co-incubazione di cellule e conidia, seguita da una c...

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Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Questo protocollo fornisce un metodo veloce e affidabile per misurare quantitativamente la fagocitosi di Aspergillus fumigatus conidia da fagociti primari umani utilizzando la citometria di flusso e per discriminare la fagocitosi di conidia dalla mera adesione ai leucociti.

Misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte dei Leucociti Umani utilizzando Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Questo protocollo è significativo perché misura quantitativamente la fagocitosi dei fumigatori aspergillus etichettati Conidia dai leucociti umani, insieme all'attaccamento di Conidia alle cellule e alla mancanza di interazione per citometria del flusso. Il vantaggio principale di questo metodo è che facilita l'analisi rapida di un gran numero di cellule. Inoltre, l'etichettatura dei marcatori cellulari consente di separare la valutazione di neutrofili e monociti all'interno dello stesso campione.In qualsiasi questa tecnica può essere utilizzato per analizzare altri funghi clinici rilevanti come Mucorales. Invece i globuli rossi potrebbero essere usati come fagociti. Per iniziare questa procedura, bagnare un tovagliolo di carta con disinfettante e posizionarlo in un armadietto di sicurezza bio.Posizionare un piatto di Aspergillus fumigatus coltivato sopra l'assorbente di carta per evitare un'iperdistribuzione della Conidia volatile. Aggiungere 10 millilitri di PBS contenenti lo 0,01% di detersivo sopra il fungo e utilizzare una spatola Drigalski per stendere il liquido sul piatto e strofinare la Conidia di colore scuro. Trasferire la sospensione Conidia su un colino da 50 millilitri attraverso un colino da 30 micrometri, che rimuoverà eventuali mielie residue.Aggiungere altri 10 millilitri di PBS con detersivo alla piastra, stenderlo con una spatola e trasferirlo nello stesso tubo attraverso il colino. Successivamente, preparare una soluzione sterile di carbonato di sodio molare 0,1, sciolto in PBS. E preparare una soluzione millimolare da 0,1 millimolare di polvere FITC, in questa soluzione di carbonato di sodio.Sospendere di nuovo 100 milioni o meno di Conidia, in cinque millilitri di questa soluzione FITC, in un tubo da 15 millilitri. Incubare in un rotatore a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Per gonfiarsi a Conidia, resuspend il FITC etichettato Conidia in cinque millilitri di mezzo RPMI, integrato con 10%FCS.E incubare in un rotatore a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato. In un armadietto di sicurezza bio, posizionare cinque millilitri di buffy coat in un tubo da 50 millilitri. Riempire il tubo con il buffer EL e invertire tre volte.Incubare orizzontalmente per cinque o otto minuti, fino a quando l'aspetto lattiero della miscela diventa chiaro. Quindi, centrifugare a 300 volte G e a temperatura ambiente per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitri di el buffer mediante pipettazione.Aggiungere altri 24 millilitri di tampone EL e invertire il tubo più volte. Centrifuga a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitri di supporti RPMI, integrati con il 10%FCS.Per iniziare, trasferisci due milioni di leucociti e quattro milioni di Conidia con etichetta FITC in 1,5 millilitri di RPMI integrati con FCS al 10%, su una piastra di coltura da 12 pozzi. Includere un controllo delle celle solo senza Conidia e un controllo delle celle con Conidia senza etichetta. Incubare la piastra in un incubatore di anidride carbonica umidificato, a 37 gradi Celsius per la quantità di tempo desiderata.Quando l'incubazione è completa, utilizzare un raschietto cellulare per raccogliere le cellule e trasferirle in un tubo da 15 millilitri. In primo luogo, mettere 100 microlitri di ogni campione e controlli in un unico pozzo di una piastra inferiore a V da 96 po '. Aggiungere 150 microlitri di PBS contenenti due millimolari di EDTA per il lavaggio.Per la compensazione del colore, posizionare un milione di celle senza Conidia per ogni colore, in altri pozzi della piastra. Includere un pozzo di celle che verranno lasciate senza tensione. Aggiungere 150 microlitri di PBS contenenti due millimolari di EDTA ad ogni pozzo per il lavaggio.Quindi, coprire la piastra con un foglio adesivo e centrifugare a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, rimuovere il foglio e scartare il supernatante invertendo rapidamente e con forza la piastra solo una volta sopra il lavandino o un tovagliolo di carta usa e getta. Rimospendare le cellule in 100 microlitri di miscela di anticorpi e mescolare bene con la pipettazione.Per le compensazioni di colore, resuspend le rispettive cellule in 100 microlitri di PBS contenenti due millimolari di EDTA, e aggiungere un singolo tipo di anticorpo a ciascun pozzo, alla stessa quantità utilizzata nella miscela di anticorpi. Coprire con un foglio adesivo e incubare a temperatura ambiente al buio per 20 minuti. Successivamente, rimuovere il foglio e aggiungere 150 microlitri di PBS contenenti due millimolari di EDTA ad ogni pozzo per il lavaggio.Coprire di nuovo la piastra con un foglio adesivo. Centrifuga a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi rimuovere il foglio e scartare il supernatante invertendo rapidamente e con forza la piastra su un lavandino o un tovagliolo di carta usa e getta.Rimorsipare le cellule in 200 microlitri di PBS contenenti EDTA millimolare e trasferire la sospensione cellulare da ogni pozzo, in un tubo inferiore rotondo separato. Avviare il citometro di flusso e lasciarlo riscaldare. Nel software di acquisizione, creare un nuovo esperimento e impostare ed etichettare i nuovi campioni.Impostare i parametri e i rilevatori per i fluorofori appropriati, come indicato nel protocollo di testo. In questo software, visualizzare i grafici a punti appropriati come delineato nel protocollo di testo. Usando le cellule solo campione, acquisire alcune cellule e impostare il cancello intorno ai leucociti.Basato sul cancello del leucocita, gate per le cellule positive cd45, da separare da Conidia nella trama cd45 della SSC. In un grafico a punti, CD14, CD66b, neutrofili di gate e monociti separatamente. Successivamente, passare dall'unico campione di celle a Conidia senza etichetta.In un grafico a punti, anti-FITC, APC FITC, visualizzare i neutrofili nei quadranti impostati per i segnali anti-FITC e FITC. Aprire la visualizzazione statistiche e regolare i quadranti, consentendo un massimo dell'1% delle celle nei quadranti Q1, Q2 e Q4. Ripetere questo processo per il cancello monocitare. Nel cancello del leucocita, registrare tutti i campioni con almeno 20.000 eventi.La fagocitosi della Conidia etichettata FITC dai neutrofili umani può essere letta dalle viste statistiche. In questo studio, un metodo citometrico a flusso rapido viene utilizzato per misurare l'interazione dei fumigatori di Aspergillus Conidia con un gran numero di leucociti umani primari. Utilizzando gli anticorpi appropriati e la strategia di gating qui mostrata, una gating generale di leucociti umani per caratteristiche FSC e SSC, è seguita da una separazione dei leucociti in conidia libera, dal marcatore pan leucocitare, CD45.Conidia può raggiungere quasi le dimensioni delle cellule al momento della citometria del flusso, specialmente quando si utilizza Conidia gonfia, e o lunghi tempi di incubazione, e quindi può comprarci l'analisi. Poiché i monociti primari umani e i neutrofili prendono Conidia in modo diverso, questo protocollo consente l'analisi separata di queste popolazioni cellulari in base alla colorazione con i marcatori di lignaggio cellulare ben consolidati, CD14 per i monociti e CD66b per i neutrofili. La percentuale di fagociti primari umani che interiorizzano la Conidia può essere altamente variabile tra i donatori di sangue, ma dipende anche da fattori sperimentali, come il tempo di incubazione e lo stato di gonfiore della Conidia.L'internalizzazione delle spore può essere rilevata dopo 0,5 ore di co-incubazione e aumenta con il tempo. La Conidia pre-gonfia viene assunta più facilmente rispetto alle spore a riposo, anche in brevi tempi di incubazione. Se la Conidia è fissata con formaldeide, la fagocitosi viene diminuita rispetto alla conidia nativa.Seguendo questa procedura, i supernanti delle cellule immunitarie co-incubate e della Conidia possono essere raccolti e analizzati da Eliza per verificare se l'interazione provoca un rilascio di citochine da parte delle cellule immunitarie. Ricorda, il sangue umano può potenzialmente trasmettere malattie infettive. Questo lavoro richiede la vaccinazione attraverso l'epatite B, l'uso di un armadietto di sicurezza bio, oltre a indossare guanti su un camice da laboratorio.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Misurazione dell&#39;attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Immagini dal vivo di antifungini attività da Human neutrofili e monociti primaria in risposta a<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

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Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Isolamento dei leucociti dal latte materno umano per l'uso in un saggio di fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi sui bersagli HIV

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Misurazione del recettore del complemento dell'eritrocite 1 utilizzando la citometria di flusso

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...