Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
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ピア・スティエ夫人の優れた技術支援に感謝します。M. フォン・リリエンフェルト・トーアルは敗血症管理ケアセンター(ドイツ連邦教育保健省、BMBF、FKZ 01E01002)および感染性Gnostics研究キャンパス(BMBF、FKZ 13GW0096D)によってサポートされています。ティ・ゴック・マイ・ホアンは、イエナ・スクール・オブ・微生物通信(ドイツ・フォルシュチュンゲマイインシャフト、FKZ 214/2)によってサポートされています。

このプロトコルは、輸血医学研究所から得られたヒトバフィーコートの使用、イエナ大学病院および患者から引き出された新鮮な静脈血の使用を含み、いずれも倫理委員会の承認4357-03/15に従ってドナーの書面によるインフォームド・コンセントの後に。
1.アスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの調製
<ol><li>1.5%モルト寒天ペトリ料理でA.フミガトゥス...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

このプロトコルは、一般的な顕微鏡プロトコルでは不可能な多数の一次ヒト白血球とのA.フミガトゥス・コニディアの相互作用を測定する高速フローサイトメトリ法を提示する。顕微鏡で細胞をイメージングし、内部化されたコニディアを手動でカウントすることは面倒で、数百個の細胞に対してのみ現実的に行うことができます。フローサイトメトリーは、数分以内に数千の細胞を?...

侵襲性肺アスペルギルス症は、治療オプションが限られており、早期診断時にのみ成功し、高い死亡率につながる免疫不全患者にとって大きな脅威です。感染剤は、ほとんどの生息地にユビキタスである金型アスペルギルス・フミガトゥスのコニディア(胞子)である2.コニディアは吸入され、気道を通過し、最終的に肺肺胞に入ることができます。免疫能力の高いヒトにおいて、これらのコニディアは、単球またはマクロファージおよび好中球顆粒球などの自然免疫細胞によってクリアされ、これは病原体を取り込み(貪食)および消化する3である。食細胞症は、宿主と病原体の相互作用に興味を持つ微生物学者や免疫学者にとっても重要です。白血球およびコニジアの共インキュベーションのような対立アッセイは、しばしばフルオレセインまたはその誘導体フルオレセインイソチオシアネート(FITC)による胞子の標識を含む。顕微鏡を使用して、内部化された蛍光コニディアを識別し、付着/付着性のコニディアを決定するのは簡単ですが、このアプローチは面倒で現実的に数百個の細胞4に制限されています。しかし、数十万の細胞を数分以内に容易に分析できるフローサイトメトリーでは、食細胞および付着性コニジアの微分染色が不可欠である。したがって、多くのプロトコルは、付着コニディア5、6、7、8からFITC蛍光をクエンチするためにトリパンブルーに依存しています。別のアプローチは、付着コニディア9、10、11から緑色蛍光の代わりに赤色を放出するために臭化エチジウムおよびFITCの蛍光共鳴エネルギー移動を利用する。特定の抗体が利用可能な場合、一部の細菌の場合と同様に、細胞結合粒子は12、13に直接染色することができる。
ここでは、アロフィコシアニン(APC)結合抗FITC抗体を用いて、ヒト白血球によるFITC標識A.フミガトゥスコニジアの貪食を細胞への胞子の付着と相互作用の欠如と共に迅速かつ定量的に評価するプロトコルを提示する。この方法はまた、同じサンプルからの単球および好中球による食細胞症の別々の分析に使用することができるさらなる細胞マーカーの同時フローサイトメトリック分析を可能にする。
このプロトコルは、真菌系株(例えば、ここで提示されるムコラレ属からのいくつかの種のアスペルギルスおよび他の型)および免疫不全個体からの白血球などの食細胞に関する変異体14および免疫学的研究に適用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

カビアスペルギルス・フミガトゥスによる侵襲性肺感染は、免疫不全患者に大きな脅威をもたらす。吸入された真菌コニジア(胞子)は、先天性単球および/または好中球によって貪食されることによってヒト肺肺胞からクリアされる。このプロトコルは、ヒト白血球との共インキュベーションのためのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識コニディアを用いたフローサイトメトリーによるファゴサイトシスの迅速かつ信頼性の高い測定を提供し、その後の抗FITC抗体によるアンチステインを可能にし、内部および細胞付着性コニジアの判別を可能にする。このプロトコルの主な利点は、その急速さ、目的の他の細胞マーカーの細胞測定体分析とアッセイを組み合わせる可能性、単一のサンプルからの単球および好中球の同時分析および他の細胞壁を有する真菌または細菌への適用性である。食細胞の食細胞のパーセンテージの決定は、病原体の毒性を評価するための微生物学者や、病原体の野生型と突然変異体を比較するための手段を提供するだけでなく、病原体と戦うためにヒト白血球能力を調査するための免疫学者に提供する。

ヒト貪食細胞によるA.フミガトゥス・コニディアの貪食を測定する際には、特にフローサイトメトリーなどのハイスループット法に関しては、本物の内在化と単なるコニディアの細胞への付着との間の判別が障害となる。このハードルを克服するために、細胞とコニディアの共インキュベーションの前に蛍光色素FITCによるコニディアの染色に基づく高速で信頼性の高いプロトコルを提?...

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Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いたヒト一次食細胞によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの貪食を定量的に測定し、単なる接着から白血球へのコニジアの貪食を判別するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供する。

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

このプロトコルは、ヒト白血球による標識アスペルギルス・フミガトゥール・コニディアの貪食作用、および細胞へのコニディアの付着性、およびフローサイトメトリーによる相互作用の欠如を定量的に測定するため、重要である。この方法の主な利点は、多数の細胞の高速分析を容易にすることです。さらに、細胞マーカーの標識は、同じサンプル内の好中球および単球の評価を分離することを可能にする。この技術では、ムコレスのような他の臨床関連菌を分析するために使用することができます。代わりに赤血球は食細胞として使用される可能性があります。.この手順を開始するには、ペーパータオルに消毒剤を入れ、バイオセーフティキャビネットに入れてください。揮発性コニディアの過剰流通を防ぐために、ペーパータオルの上に成長したアスペルギルスフミガトゥスのプレートを置きます。真菌の上に0.01%の洗剤を含むPBSの10ミリリットルを加え、ドリガルスキースパチュラを使用してプレートの上に液体を広げ、暗い色のコニディアをこすり落とします。コニディア懸濁液を30マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルに移し、残ったミセリアを取り除きます。洗剤付きのPBSを10ミリリットル追加し、ヘラで広げ、ストレーナーを通して同じチューブに移します。次に、0.1モル炭酸ナトリウムの無菌溶液を調製し、PBSに溶解する。この炭酸ナトリウム溶液中にFITC粉末の0.1ミリモル溶液を調製する。このFITC溶液の5ミリリットルで、1億個以下のコニディアを15ミリリットルのチューブに再懸濁させる。摂氏37度で20分間インキュベートします。コニディアに膨らむには、10%FCSを補った5ミリリットルのRPMI培地で、適合標識されたConidiaを再中断する。そして、所望の時間のために摂氏37度で回転器でインキュベート。バイオセーフティキャビネットでは、5ミリリットルのバフィーコートを50ミリリットルのチューブに入れる。ELバッファーでチューブを満たし、3回反転します。混合物の乳白色の外観が明らかになるまで、5〜8分間水平にインキュベートします。その後、遠心分離機をGの300倍、室温で10分間行う。上清を捨て、ピペット処理により1ミリリットルのELバッファーにペレットを再懸濁します。ELバッファーの別の 24 ミリリットルを追加し、チューブを数回反転します。遠心分離機はGの300倍、室温で5分間。上清を捨て、1ミリリットルのRPMI培地で細胞を再懸濁し、10%FCSを補う。まず、10%FCSを補充したRPMIの1.5ミリリットルで200万個の白血球と400万個のFITC標識コニディアを12ウェル培養プレートに移します。コニディアのないセルのコントロールと、ラベルのない Conidia を持つセルのコントロールを含めます。所望の時間のために摂氏37度で、加湿二酸化炭素インキュベーターでプレートをインキュベートします。インキュベーションが完了したら、細胞スクレーパーを使用して細胞を収穫し、15ミリリットルのチューブに移します。まず、各サンプルの100マイクロリットルを入れ、96ウェルVボトムプレートの1つのウェルに制御します。洗浄用のEDTAの2ミリモルを含むPBSの150マイクロリットルを加えます。色補償のために、各色のためのコニディアなし100万個の細胞をプレートの他の井戸に置きます。訓練を受けていないままになる細胞の井戸を含めます。洗浄用の各ウェルに、EDTAの2ミリモルを含むPBSの150マイクロリットルを加えます。次に、粘着ホイルでプレートを覆い、遠心分離機をGの300倍、室温で5分間覆います。その後、ホイルを取り除き、シンクまたは使い捨てのペーパータオルの上に一度だけ素早く強引にプレートを反転させることで上清を捨てます。100マイクロリットルの抗体ミックスで細胞を再懸濁し、ピペット処理でよく混ぜます。色補償のために、EDTAの2ミリモルを含むPBSの100マイクロリットルのそれぞれの細胞を再懸濁し、抗体ミックスで使用される同じ量で各ウェルに単一の抗体タイプを加える。粘着ホイルで覆い、暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。この後、ホイルを取り除き、洗浄のために各ウェルにEDTAの2ミリモルを含むPBSの150マイクロリットルを加えます。もう一度粘着ホイルでプレートを覆います。遠心分離機はGの300倍、室温で5分間。その後、ホイルを取り出し、シンクまたは使い捨てのペーパータオルの上にプレートを素早く強引に反転させることで上清を捨てます。2ミリモルEDTAを含むPBSの200マイクロリットルの細胞を再懸濁し、各ウェルから細胞懸濁液を別々の丸底管に移す。フローサイトメーターを開始し、ウォームアップさせます。取得ソフトウェアで、新しい実験を作成し、新しいサンプルを設定してラベル付けします。テキスト プロトコルで説明されているように、適切な蛍光器のパラメータと検出器を設定します。このソフトウェアでは、テキストプロトコルで概説されているように、適切なドットプロットを表示します。サンプルのみを使用して、いくつかの細胞を取得し、白血球の周りにゲートを設定します。白血球ゲートに基づいて、CD45陽性細胞用のゲートは、SSC CD45プロット中のコニディアから分離する。ドットプロットにおいて、CD14、CD66b、ゲート好中球および単球は別々に。この後、細胞のみをサンプルから、ラベルなしのConidiaに変更する。ドットプロットでは、アンチFITC、APC FITCは、アンチFITC、およびFITC信号の設定象限に好中球を表示します。統計ビューを開き、四分の一の四分の一を調整して、クアドラントのセルの最大 1%を使用できるようにします。単球ゲートに対してこのプロセスを繰り返します。白血球ゲートでは、少なくとも20,000のイベントですべてのサンプルを記録します。ヒト好中球によるFITC標識コニディアの貪食細胞症は、統計図から読み取ることができる。本研究では、高速フローサイトメトリック法を用いて、多数の原発性ヒト白血球とのアスペルギルス・フミガトゥール・コニディアの相互作用を測定する。ここに示す適切な抗体および格子戦略を用いて、FSCおよびSSC特性によるヒト白血球の一般的な格子化は、遊離コニディアにおける白血球の分離に続き、パン白血球マーカー、CD45によって行う。Conidiaは、フローサイトメトリーの時点で、特に腫れたコニディアを使用する場合、または長いインキュベーション時間を使用すると、ほぼ細胞サイズに達することができ、したがって、私たちの分析を購入することができます。ヒトの一次単球と好中球は異なる方法でConidiaを取るので、このプロトコルは、確立された細胞系統マーカー、単球のCD14、好中球のためのCD66bで染色することに基づいて、これらの細胞集団の別々の分析を可能にする。コニディアを内在化するヒト原発食細胞の割合は、献血者の間で非常に変動する可能性があるが、また、インキュベーション時間およびコニディアの腫脹状態などの実験的要因に依存する。胞子の内在化は、共培養の0.5時間後に検出することができ、時間とともに増加する。腫脹前のコニディアは、短い孵化時でさえ、胞子を休ませるよりも簡単に取り上げられる。コニディアがホルムアルデヒドで固定されている場合、食道はネイティブコニディアと比較して減少する。この手順に従って、共インキュベート免疫細胞とConidiaの上清を収集し、その相互作用が免疫細胞によるサイトカイン放出を引き起こすかどうかを確認するために、Elizaによって分析することができる。人間の血液は感染症を伝染させる可能性があります。この作業では、B型肝炎全体のワクチン接種、バイオセーフティキャビネットの使用、ラボコートでの手袋の着用が必要です。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによって、A549細胞におけるインフルエンザAウイルスの添付ファイルと内在化を測定

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング<em&gt; A。フミガーツス</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

HIV標的の抗体依存性細胞性性性過小細胞症アッセイにおけるヒト母乳からの白球細胞の単離

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

フローサイトメトリーを用いた赤血球補体受容体1の測定

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...