Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

우리는 훌륭한 기술 지원을 위해 부인 피아 Stier에 감사드립니다. M. 폰 Lilienfeld-Toal은 패혈증 제어 및 관리 센터 (독일 연방 교육 보건부, BMBF, FKZ 01E01002) 및 감염성 Gnostics tics 연구 캠퍼스 (BMBF, FKZ 13GW0096D)에 의해 지원됩니다. 티 응옥 마이 호앙은 미생물 통신의 예나 학교에 의해 지원됩니다 (도이치 포르충스게마인샤프트, FKZ 214/2)

이 프로토콜은 수혈 의학 연구소에서 얻은 인간의 버피 코트의 사용을 포함, 예나 대학 병원과 환자에서 가져온 신선한 정맥 혈액, 모두 윤리위원회 승인에 따라 기증자의 서면 동의 후 4357-03/15.
1. 아스퍼질러스 훈증코니디아의 준비
<ol><li>Co2없이 37°C에서 5일간 1.5% 몰트 한천 페트리 접시에 A. 훈증을 키우고 있다. 주의: A. 훈증은 ?...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

이 프로토콜은 일반적인 현미경 프로토콜에서 불가능한 많은 수의 1차 인간 백혈구와 A. fumigatus conidia의 상호작용을 측정하는 빠른 유동 세포 측정 방법을 제시한다. 현미경을 가진 화상 진찰 세포및 수동내재된 conidia를 계수하는 것은 번거롭고 현실적으로 수백 개의 세포에 대해서만 행해질 수 있습니다. 유세포측정은 몇 분 안에 수천 개의 세포를 측정하여 이 문제를 극복합니다. 두 접근?...

침습성 폐 아스퍼질로시스는 치료 옵션이 제한되어 있고 조기 진단시성공으로 면역 손상 환자에게 큰 위협이 되며, 이는 높은 사망률1을이끈다. 감염제는 대부분의 서식지에 유비쿼터스 인 곰팡이 아스퍼질러스 훈증의 코니디아 (포자)입니다2. 코니디아는 흡입되고 기도를 통과하고 마침내 폐 폐포에 들어갈 수 있습니다. 면역 적격 인간에서, 이들 코니디아는 단핵구 또는 대식세포 및 호중구 과립구와 같은 선천적 면역 세포에 의해 제거되며, 이는 병원체를 (식균) 및 소화한다3. 식세포증은 숙주 병원체 상호 작용에 관심이 있을 때 미생물학자와 면역학자에게 도 마찬가지로 중요합니다. 백혈구 및 코니디아의 공동 배양과 같은 대립 성 애세포는 종종 플루오레세인 또는 그 유도체 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)에 의한 포자의 라벨링을 포함합니다. 현미경을 사용하여, 이 접근은 번거롭고 현실적으로 세포의 수백에 제한되더라도, 내면화한 형광 콘idia를 확인하고 부착된/부착된 코니디아를 결정하는 것은 간단합니다4. 그러나, 쉽게 분 이내에 세포의 수십만의 분석을 허용 유세포 분석, 식균 및 부착 코니디아의 차동 염색은 필수적이다. 따라서 많은 프로토콜은 Trypan Blue에 의존하여 부착 코니디아5,6,7,8에서FITC 형광을 담금질합니다. 또 다른 접근법은 에티듐 브로마이드 및 FITC의 형광 공명 에너지 전달을 이발하여 부착코니디아9,10,11에서녹색 형광 대신적을 방출한다. 특정 항체가 이용 가능한 경우, 일부 박테리아의 경우와 마찬가지로, 세포 결합 입자는12,13을직접 염색할 수 있다.
여기에서, 우리는 세포에 포자의 부착및 상호 작용의 부족과 더불어 인간 백혈구에 의한 FITC 표지된 A. fumigatus conidia의 식균증을 신속하고 정량적으로 평가하는 프로토콜을 제시합니다(APC)-결합된 항체. 이 방법은 또한 동일한 샘플에서 단핵구 및 호중구에 의한 식세포증의 개별 분석을 위해 사용될 수 있는 추가 세포 마커의 동시 유동 세포 분석법을 허용한다.
프로토콜은 곰팡이 균주의 특성화 (예를 들어, 여기에 제시 된 무코랄레스 속의 아스퍼질러스 및 기타 곰팡이의 여러 종) 및 그들의 돌연변이체14 및 면역 손상 된 개인의 백혈구와 같은 식세포에 대한 면역 학적 연구에 적용 될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

곰팡이 아스퍼질러스 훈증에 의한 침습성 폐 감염은 면역 손상 환자에게 큰 위협이 된다. 흡입한 곰팡이 코니디아 (포자)는 선천적 단핵구 및 / 또는 호중구에 의해 식세포가 함유되어 인간의 폐 폐포에서 제거됩니다. 이 프로토콜은 인간 백혈구와 공동 인큐베이션및 내부화 및 세포 부착 코리디아의 차별을 허용하기 위해 항 FITC 항체와 후속 카운터 염색을 위해 플루오레세인 이소티오차네이트 (FITC)를 사용하여 유세포증에 의한 식세포증의 빠르고 신뢰할 수있는 측정을 제공합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 그것의 급속성, 관심있는 다른 세포 마커의 세포 분석과 분석, 단일 샘플에서 단핵구 및 호중구의 동시 분석 및 다른 세포 벽 베어링 곰팡이 또는 박테리아에 대한 적용 가능성과 분석을 결합 할 수있는 가능성입니다. 식균 백혈구의 백분율의 결정은 병원체의 독성을 평가하거나 병원체 야생 유형 및 돌연변이를 비교하기위한 미생물학자뿐만 아니라 병원균에 대처하기 위한 인간 백혈구 능력을 조사하기위한 면역 학자에게 수단을 제공합니다.

인간의 식세포에 의한 A. fumigatus conidia의 식균을 측정할 때, 순정 내재화와 세포에 코니디아를 부착하는 것 사이의 차별은 특히 유세포 분석과 같은 처리량이 높은 방법에 관한 장애물입니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 세포와 코니디아의 공동 인큐베이션 전에 형광 염료 FITC와 코니디아의 염색에 기초하여 빠르고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제시하고, 배양 후 APC 표지 된 ANTI-FI...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

이 프로토콜은 유세포측정법을 사용하여 인간 1차 식세포에 의한 아스퍼질러스 훈증의 식세포증을 정량적으로 측정하고 단순한 유착에서 백혈구로의 식세포증을 구별하는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

유세포 측정을 사용하여 인간 백혈구에 의한 아스퍼질러스 훈증 코니디아의 식세포증 측정

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

이 프로토콜은 인간 백혈구에 의해 표지된 아스퍼길러스 fumigateurs Conidia의 phagocytosis를 정량적으로 측정하기 때문에 중요합니다, 세포에 Conidia의 부착과 더불어, 및 유동 세포측정에 의한 상호 작용의 부족. 이 방법의 주요 장점은 많은 수의 세포의 빠른 분석을 용이하게한다는 것입니다. 또한, 세포 마커의 라벨링은 동일한 샘플 내에서 호중구 및 단핵구의 분리 평가를 허용한다.어떤 이 기술에서 Mucorales 같은 다른 임상 관련 곰 팡이 분석 하는 데 사용할 수 있습니다. 대신 적혈구는 phagocytes로 사용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 소독제로 종이 타월을 적시고 바이오 안전 캐비닛에 넣습니다.휘발성 코니디아의 과잉 분포를 방지하기 위해 종이 타월 위에 재배 된 아스퍼 질러스 훈가투스 접시를 놓습니다. 곰팡이 위에 0.01 %의 세제가 들어있는 PBS 10 밀리리터를 추가하고 드리갈스키 주걱을 사용하여 접시 위에 액체를 퍼 뜨리고 어두운 색의 코니디아를 문지릅니다. 30 마이크로미터 스트레이너를 통해 Conidia 서스펜션을 50 밀리리터로 전송하여 잔류 균을 제거합니다.접시에 세제가 있는 PBS 10밀리리터를 추가하여 주걱으로 퍼뜨리고 여과기를 통해 동일한 튜브로 옮습니다. 다음으로, PBS에 용해된 0.1 어금강 탄산나트륨의 멸균 용액을 준비한다. 그리고 이 탄산 나트륨 용액에서 FITC 분말의 0.1 밀리머용액을 준비합니다.1억 밀리리터 튜브에서 이 FITC 용액의 5밀리리터에서 1억 이하의 코니디아를 다시 중단합니다. 섭씨 37도에서 20분간 회전기에서 배양하세요. 코니디아로 팽창하기 위해 FITC라벨이 있는 코니디아를 RPMI 배지 5밀리리터로 10%FCS로 보충합니다.그리고 원하는 시간 동안 섭씨 37도에서 회전에 배양. 바이오 안전 캐비닛에 5밀리리터의 버피 코트를 50밀리리터 튜브에 넣습니다. EL 버퍼로 튜브를 채우고 세 번 반전합니다.혼합물의 유백색 모양이 명확해질 때까지 5~8분 동안 수평으로 배양합니다. 그런 다음 원심 분리기는 300 배 G, 실온에서 10 분 동안. 상체를 버리고 파이펫팅을 통해 EL 버퍼의 1밀리리터로 펠릿을 다시 놓습니다.EL 버퍼의 또 다른 24 밀리리터를 추가하고 튜브를 여러 번 반전시면 됩니다. 원심분리기는 300배 G, 실온에서 5분간. 10%의 FCS로 보충된 RPMI 미디어의 1밀리리터에서 상체를 폐기하고 세포를 다시 중단합니다.우선, 200만 개의 백혈구와 400만 FITC 라벨이 부착된 코니디아를 10%FCS로 보충한 1.5밀리리터의 12웰 컬쳐 플레이트로 이송합니다. 코니디아가 없는 세포의 제어와 표지가 없는 코니디아를 가진 세포의 제어를 포함합니다. 가습 된 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 원하는 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.잠복이 완료되면 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확하고 15 밀리리터 튜브로 옮습니다. 먼저 각 샘플의 100 마이크로리터를 넣고 96웰 V-바닥 플레이트의 한 웰에 컨트롤을 넣습니다. 세척을 위해 EDTA의 2 밀리머를 포함하는 PBS의 150 마이크로 리터를 추가합니다.색상 보정을 위해 각 색상마다 Conidia없이 100 만 개의 셀을 플레이트의 다른 우물에 놓습니다. 훈련받지 않은 상태로 남겨질 세포의 우물을 포함합니다. 세탁을 위해 각 웰에 EDTA 의 2 밀리몰라를 포함하는 PBS의 150 마이크로 리터를 추가합니다.다음으로, 접착제 호일로 접시를 덮고 원심분리기는 300배 G, 실온에서 5분간 덮습니다. 그런 다음 호일을 제거하고 싱크대 또는 일회용 종이 타월을 통해 한 번만 접시를 신속하고 강제로 반전시켜 상체를 폐기하십시오. 항체 믹스의 100 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고, 파이펫팅에 의해 잘 혼합.색상 보정을 위해, EDTA의 2밀리머를 포함하는 PBS의 100 마이크로리터에서 각각의 세포를 재보중단하고, 항체 믹스에 사용되는 것과 동일한 양으로 각각의 웰에 단일 항체 유형을 추가한다. 접착제 호일로 덮고 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. 그 후 호일을 제거하고 세척을 위해 각 웰에 EDTA 2 밀리머를 포함하는 PBS의 150 마이크로리터를 추가합니다.접시를 접착제 호일로 다시 덮습니다. 원심분리기는 300배 G, 실온에서 5분간. 그런 다음 호일을 제거하고 싱크대 또는 일회용 종이 타월을 통해 접시를 빠르고 강력하게 반전시켜 상체를 버립니다.2 밀리머 EDTA를 포함하는 PBS의 200 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고, 각각의 우물에서 세포 현탁액을 별도의 둥근 바닥 튜브로 전송한다. 흐름 세포계를 시작하고 따뜻하게 하십시오. 획득 소프트웨어에서 새 실험을 만들고 새 샘플을 설정하고 레이블을 지정합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적절한 형광에 대한 매개 변수 및 검출기를 설정합니다. 이 소프트웨어에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적절한 점 플롯을 표시합니다. 세포만 샘플을 사용하여 일부 세포를 획득하고 백혈구 주위의 게이트를 설정합니다.백혈구 게이트에 기초하여, CD45 양성 셀에 대한 게이트, SSC CD45 플롯에서 코니디아에서 분리. 점 플롯에서 CD14, CD66b, 게이트 호중구 및 단핵구는 별도로 합니다. 그 후, 세포에서 만 샘플, 레이블이 지정되지 않은 Conidia로 변경합니다.도트 플롯에서 안티 FITC, APC FITC는 안티 FITC 및 FITC 신호에 대한 세트 사분면에 호중구를 표시합니다. 통계 보기를 열고 사분면을 조정하여 1분기, 2분기 및 Q4에서 최대 1%의 셀을 허용합니다. 단핵구 게이트에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 백혈구 게이트에서 최소 20, 000 개의 이벤트로 모든 샘플을 기록하십시오.인간 호중구에 의해 FITC 라벨 코니디아의 phagocytosis통계 보기에서 읽을 수 있습니다. 이 연구에서는, 빠른 유동 세포 측정 방법은 많은 수의 1차 인간 백혈구를 가진 아스퍼길러스 fumigateurs Conidia의 상호 작용을 측정하는 데 사용됩니다. 여기에 도시된 적절한 항체 및 게이팅 전략을 사용하여, FSC 및 SSC 특성에 의한 인간 백혈구의 일반적인 게이팅은 자유 코니디아에서 백혈구를 분리하고, 팬 백혈구 마커, CD45에 의해 뒤따릅니다.Conidia는 특히 부어 콘니디아를 사용할 때, 또는 긴 잠복 시간을 사용할 때, 흐름 세포 측정의 시간에 거의 세포 크기에 도달 할 수 있으며, 따라서 우리에게 분석을 구입할 수 있습니다. 인간 1차 단세포와 호중구가 코니디아를 다르게 차지하기 때문에, 이 프로토콜은 잘 확립된 세포 계보 마커를 가진 염색, 단핵구CD14 및 호중구를 위한 CD66b를 기반으로 이러한 세포 집단의 분리된 분석을 허용합니다. Conidia를 내면화하는 인간 1 차 적인 phagocytes의 백분율은 혈액 기증자 중 높게 가변할 수 있습니다, 그러나 또한 Conidia의 잠복기 및 팽윤 상태와 같은 실험적인 요인에 달려 있습니다.포자 내재화는 0.5시간의 공동 배양 후 검출될 수 있으며, 시간이 지남에 따라 증가한다. 미리 부어 오른 코니디아는 짧은 인큐베이션 시간에도 포자를 쉬는 것보다 쉽게 차지합니다. 코니디아가 포름알데히드로 고정되면, phagocytosis는 네이티브 코니디아에 비해 감소된다.이 절차에 따라, 공동 배양 면역 세포와 Conidia의 슈퍼 나티온을 수집하고 면역 세포에 의해 세포 카인 방출을 유도 하는 경우 확인 엘리자에 의해 분석 될 수 있다. 인간의 혈액은 잠재적으로 전염병을 전송할 수 있습니다. 이 작품은 B형 간염에 걸쳐 예방 접종을 필요로, 바이오 안전 캐비닛의 사용뿐만 아니라 실험실 코트에 장갑을 착용.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

연구

면역학 및 감염병학

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의해 A549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

인간의 혈액에서 측정 과립구와 단핵구 식균 작용 및 산화 버스트 활동

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

에 대한 응답으로 인간의 기본 호중구와 단핵구에 의해 항진균 활성의 라이브 영상<em&gt;를했다. 투스</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

HIV 표적의 항체 의존적 세포 식세포 분석에서 사용하기 위해 인간 모유에서 백혈구의 분리

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

유세포 분석을 사용하여 적혈구 보체 1 보체 측정

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...