Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Vi takker fru Pia stier for utmerket teknisk assistanse. M. von Lilienfeld-toal er støttet av Center for sepsis kontroll og omsorg (det tyske føderale departementet for utdanning og helse, BMBF, FKZ 01E01002) og InfectoGnostics Research campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc mai Hoang er støttet av Jena School of mikrobiell Communication (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)

Denne protokollen inkluderer bruk av menneskelige Buffy strøk innhentet fra Institutt for overføring medisin, Jena universitetssykehus og fersk venøs blod trukket fra pasienter, både etter skriftlig informert samtykke fra givere i henhold til etikk komiteen godkjenning 4357-03/15.
1. utarbeidelse av Aspergillus fumigatus Conidia
<ol><li>Grow A. fumigatus på 1,5% malt agar Petri retter i 5 dager ved 37 ° c uten co2. Forsiktig: a. fumi...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

Denne protokollen presenterer en rask flyt analytiske metode for å måle interaksjon av a. fumigatus conidia med et stort antall primære menneskelige leukocytter som ikke er mulig i vanlige mikroskopiske protokoller. Imaging celler med et mikroskop og manuelt telling internalisert conidia er tungvint og realistisk kan gjøres for et par hundre celler bare. Flow flowcytometri overvinner dette problemet ved å måle tusenvis av celler i løpet av minutter. Et hinder felles for begge tilnærminger er skillet mell...

Invasiv lunge aspergillose er en stor trussel mot immunsupprimerte pasienter som behandlingstilbud er begrenset og bare vellykket ved tidlig diagnose, noe som fører til høy dødelighet1. Smittsomme midler er conidia (sporer) av mold Aspergillus fumigatus som er allestedsnærværende til de fleste habitater2. Conidia er inhalert, passerer gjennom luftveiene og kan endelig gå inn i lunge alveoler. I immunkompetente mennesker, disse conidia er ryddet av medfødte immunceller som monocytter eller makrofager og nøytrofile granulocytter, som tar opp (fagocyttere) og fordøye patogener3. Fagocytose er viktig for mikrobiologer og immunologer likeså når interessert i Host-patogen interaksjoner. Konfrontasjon analyser, slik som co-inkubasjons av leukocytter og conidia, ofte inkluderer merking av sporer av fluorescein eller dets avledede fluorescein isothiocyanate (FITC). Ved hjelp av et mikroskop, er det enkelt å identifisere internalisert fluorescerende conidia og å bestemme vedlagt/tilhenger conidia, selv om denne tilnærmingen er tungvint og realistisk begrenset til noen få hundre celler4. Men i Flow flowcytometri som lett tillater analyse av hundretusener av celler i løpet av minutter, differensial farging av phagocytosed og tilhenger conidia er avgjørende. Derfor er mange protokoller stole på Trypan blå å slukke FITC-fluorescens fra tilhenger conidia5,6,7,8. En annen tilnærming er å utnytte fluorescens resonans energi overføring av etidiumbromid bromide og FITC å avgi rød i stedet for grønne fluorescens fra tilhenger conidia9,10,11. Hvis spesifikke antistoffer er tilgjengelige, slik tilfellet er for enkelte bakterier, kan celle bundne partikler være direkte beiset12,13.
Her presenterer vi en protokoll for å raskt og kvantitativt vurdere fagocytose av FITC-merket a. fumigatus conidia av menneskelige leukocytter sammen med vedlegg av sporer til celler og mangel på interaksjon ved å ansette en ALLOFYKOCYANIN (APC)-kombinert anti-FITC antistoff. Metoden gir også mulighet for samtidig flyt analytiske analyse av ytterligere celle markører som kan benyttes for egen analyse av fagocytose av monocytter og nøytrofile fra samme prøve.
Protokollen kan anvendes for karakterisering av sopp stammer (f. eks, flere arter av Aspergillus og andre former fra slekten Mucorales presentert her) og deres mutanter14 og immunologiske forskning på phagocytes, slik som leukocytter fra immunsupprimerte individer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

Invasiv lungeinfeksjon av mold Aspergillus fumigatus utgjør en stor trussel mot immunsupprimerte pasienter. Inhalert fungal conidia (sporer) er ryddet fra den menneskelige lunge alveoler ved å være phagocytosed av medfødte monocytter og/eller nøytrofile. Denne protokollen gir en rask og pålitelig måling av fagocytose ved å flyte flowcytometri ved hjelp av fluorescein isothiocyanate (FITC)-merket conidia for co-inkubasjons med menneskelige leukocytter og påfølgende counterstaining med et anti-FITC antistoff for å tillate diskriminering av internalisert og celle-tilhenger conidia. Store fordeler av denne protokollen er dens rapidness, muligheten til å kombinere analysen med analytiske analyse av andre celle markører av interesse, samtidig analyse av monocytter og nøytrofile fra en enkelt prøve og dens anvendelighet til andre cellevegg-bærende sopp eller bakterier. Fastsettelse av prosenter av phagocytosing leukocytter gir et middel til å mikrobiologer for å evaluere virulens av en patogen eller for å sammenligne patogen wildtypes og mutanter samt å immunologer for å undersøke menneskelig leukocytter evner å bekjempe patogener.

I måling fagocytose av A. fumigatus conidia av menneskelige phagocytic celler, diskriminering mellom ekte internalisering og bare vedlegg av conidia til cellene er en hindring, spesielt når det gjelder høy gjennomstrømming metoder som flyt flowcytometri. For å overkomme dette hinderet, presenterer vi en rask og pålitelig protokoll basert på farging av conidia med fluorescerende fargestoff FITC før co-inkubasjons av celler og conidia, etterfulgt av en counterstaining med et APC-merket anti-FITC antistoff ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Denne protokollen gir en rask og pålitelig metode for å kvantitativt måle fagocytose av Aspergillus fumigatus conidia av menneskelig primære phagocytes bruker flyt flowcytometri og å diskriminere fagocytose av conidia fra bare vedheft til leukocytter.

Måle fagocytose av Aspergillus fumigatus Conidia av menneskelige leukocytter bruker Flow flowcytometri

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Denne protokollen er betydelig fordi den kvantitativt måler fagocytose av merkede Aspergillus fumigateurs Conidia av menneskelige leukocytter, sammen med vedlegg av Conidia til celler, og mangel på interaksjon ved strømningscytometri. Den største fordelen med denne metoden er at den letter den raske analysen av et stort antall celler. I tillegg gjør merking av cellemarkørene det mulig å skille vurdering av nøytrofiler og monocytter i samme prøve.I enhver denne teknikken kan brukes til å analysere andre kliniske relevante sopp som Mucorales. I stedet røde blodlegemer kan brukes som fagocytter. For å begynne denne prosedyren, våt et papirhåndkle med desinfeksjonsmiddel, og legg det i et bio sikkerhetsskap.Plasser en tallerken med dyrket Aspergillus fumigatus på toppen av papirhåndkleet for å forhindre overfordeling av flyktige Conidia. Tilsett 10 milliliter PBS som inneholder 0,01% vaskemiddel på toppen av soppen, og bruk en Drigalski-slikkepott til å spre væsken over platen, og gni av den mørke fargede Conidia. Overfør Conidia-suspensjonen til en 50 milliliter gjennom en 30 mikrometersil, som vil fjerne eventuelle gjenværende mycelia.Tilsett ytterligere 10 milliliter PBS med vaskemiddel til platen, spre den med en slikkepott, og overfør den til samme rør gjennom silen. Deretter forbereder du en steril løsning på 0,1 molarnatriumkarbonat, oppløst i PBS. Og lag en 0,1 millimolar løsning av FITC pulver, i denne natriumkarbonatløsningen.Re-suspendere 100 millioner eller mindre Conidia, i fem milliliter av denne FITC-løsningen, i et 15 milliliter rør. Inkuber i en rotator ved 37 grader Celsius i 20 minutter. For å hovne opp til Conidia, gjenbruker FITC merket Conidia i fem milliliter RPMI medium, supplert med 10% FCS.Og inkuber i en rotator ved 37 grader Celsius for ønsket tid. I et bio sikkerhetsskap, plasser fem milliliter buffy pels i en 50 milliliter tube. Fyll opp røret med EL-buffer, og inverter tre ganger.Inkuber horisontalt i fem til åtte minutter, til det melkeaktige utseendet på blandingen blir klart. Deretter sentrifuge ved 300 ganger G, og ved romtemperatur i 10 minutter. Kast den overnaturlige og resuspend pellet i en milliliter EL buffer ved pipettering.Tilsett ytterligere 24 milliliter EL-buffer, og inverter røret flere ganger. Sentrifuge ved 300 ganger G og ved romtemperatur i fem minutter. Kast de overnaturante og gjenoppuss cellene i ett milliliter RPMI-medier, supplert med 10% FCS.Til å begynne med, overføre to millioner leukocytter og fire millioner FITC-merkede Conidia i 1,5 milliliter RPMI supplert med 10% FCS, til en 12-brønns kulturplate. Inkluder en kontroll av celler bare uten Conidia, og en kontroll av celler med umerket Conidia. Inkuber platen i en fuktet karbondioksidinkubator, ved 37 grader Celsius i ønsket tidsperiode.Når inkubasjonen er fullført, bruk en celleskraper til å høste cellene, og overfør dem til et 15 milliliter rør. Legg først 100 mikroliter av hver prøve og kontroller i en brønn av en 96-brønns V-bunnplate. Tilsett 150 mikroliter PBS som inneholder to millimolar EDTA for vasking.For fargekompensasjon, plasser en million celler uten Conidia for hver farge, i andre brønner av platen. Inkluder en brønn av celler som vil bli stående utrent. Tilsett 150 mikroliter PBS som inneholder to millimolar EDTA til hver brønn for vasking.Deretter dekker platen med en klebende folie, og sentrifuge ved 300 ganger G og ved romtemperatur i fem minutter. Fjern deretter folien og kast supernatanten ved raskt og kraftig å invertere platen bare én gang over vasken eller et engangspapirhåndkle. Resuspend cellene i 100 mikroliter antistoff blanding, og bland godt ved pipettering.For fargekompensasjoner, resuspend de respektive cellene i 100 mikroliter pbs som inneholder to millimolar av EDTA, og legge til en enkelt antistofftype til hver brønn, på samme mengde som brukes i antistoffblandingen. Dekk med en klebende folie, og inkuber ved romtemperatur i mørket i 20 minutter. Etter dette fjerner du folien og legger til 150 mikroliter PBS som inneholder to millimolar EDTA til hver brønn for vasking.Dekk platen med klebende folie igjen. Sentrifuge ved 300 ganger G og ved romtemperatur i fem minutter. Fjern deretter folien, og kast supernatanten ved raskt og kraftig å invertere platen over enten en vask eller engangspapirhåndkle.Gjenoppussamler cellene i 200 mikroliter PBS som inneholder 2 millimolar EDTA, og overfør cellefjæringen fra hver brønn, til et separat rundt bunnrør. Start strømningssytometeret, og la det varmes opp. Opprett et nytt eksperiment i anskaffelsesprogramvaren, og konfigurer og merk de nye eksemplene.Sett opp parametrene og detektorene for de riktige fluoroforene, som beskrevet i tekstprotokollen. I denne programvaren viser du de riktige prikkplottene som beskrevet i tekstprotokollen. Ved hjelp av cellene bare prøve, skaffe noen celler og sette porten rundt leukocytter.Basert på leukocyttporten, gate for CD45 positive celler, for å skille seg fra Conidia i SSC CD45-plottet. I en dot plot, CD14, CD66b, gate nøytrofiler og monocytter separat. Etter dette, endre fra cellene bare prøve, til umerkede Conidia.I et punktplott viser anti-FITC, APC FITC nøytrofiler i innstilte kvadranter for anti-FITC- og FITC-signaler. Åpne statistikkvisningen og juster kvadrantene, slik at maksimalt 1 % av cellene i kvadrantene Q1, Q2 og Q4. Gjenta denne prosessen for monocyttporten. I leukocyttporten registrerer du alle prøver med minst 20 000 hendelser.Phagocytosis av FITC-merket Conidia av menneskelige nøytrofiler kan leses fra statistikk synspunkter. I denne studien brukes en rask strømningscytokometrisk metode for å måle samspillet mellom Aspergillus fumigateurs Conidia med et stort antall primære humane leukocytter. Ved hjelp av de riktige antistoffene og gatingstrategien som vises her, etterfølges en generell gating av menneskelige leukocytter av FSC og SSC-egenskaper, av en separasjon av leukocytter i fri Conidia, av panleukocyttermarkøren, CD45.Conidia kan nå nesten cellestørrelse på tidspunktet for strømningscytometri, spesielt når du bruker hovne Conidia, og eller lange inkubasjonstider, og dermed kan kjøpe oss analyse. Siden menneskelige primære monocytter og nøytrofiler tar opp Conidia annerledes, tillater denne protokollen en egen analyse av disse cellepopulasjonen basert på farging med de veletablerte cellelinjemarkørene, CD14 for monocytter og CD66b for nøytrofiler. Prosentandelen av humane primære fagocytter internalisere Conidia kan være svært variabel blant blodgivere, men avhenger også av eksperimentelle faktorer, som inkubasjonstid og hevelse tilstand av Conidia.Spore internalisering kan oppdages etter 0,5 timer med samtidig inkubasjon, og øker med tiden. Pre-hovne Conidia er tatt opp lettere enn hvilesporer, selv ved korte inkubasjonstider. Hvis Conidia er fast med formaldehyd, er fagocytose redusert sammenlignet med innfødte Conidia.Etter denne prosedyren kan supernatanter av samtidig inkuberte immunceller og Conidia samles inn og analyseres av Eliza for å sjekke om interaksjonen fremkaller en cytokinfrigjøring av immuncellene. Husk at menneskelig blod potensielt kan overføre smittsomme sykdommer. Dette arbeidet krever vaksinasjon på tvers av hepatitt B, bruk av et biosikkerhetsskap, samt bruk av hansker på en laboratoriefrakk.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Måling Vedlegg og internalisering av Influensa A virus i A549-celler ved flowcytometri

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Måling granulocytt og Monocyte Fagocytose og Oksidativt Burst Aktiviteten i Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Levende Imaging av Antifungal aktivitet av humane primære nøytrofile granulocytter og monocytter i Response til<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakteristikk av menneskelig Monocyte delsett av hele blod flyte cytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Isolering av leukocytter fra humant morsmelk for bruk i et antistoff-avhengig Cellular fagocytose analysen av HIV mål

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Måle Erytrocytt Komplement reseptor 1 ved hjelp av flow cytometri

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...