Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Agradecemos à Sra. Pia Stier por excelente assistência técnica. M. von Lilienfeld-Toal é apoiado pelo Center for Sepsis Control and Care (Ministério Federal Alemão de Educação e Saúde, BMBF, FKZ 01E01002) e InfectoGnóstics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang é apoiado pela Jena School of Microbial Communication (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)

Este protocolo inclui o uso de casacos de buffy humanos obtidos do Instituto de Medicina Transfusional, Hospital Universitário de Jena e sangue venoso fresco retirado dos pacientes, ambos após o consentimento informado por escrito dos doadores de acordo com a aprovação do comitê de ética 4357-03/15.
1. Preparação de Aspergillus fumigatus Conidia
<ol><li>Crescer A. fumigatus em 1,5% de malte agar placas de Petri por 5 dias a 37 ° C sem CO2. CUI...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

Este protocolo apresenta um método citométrico de fluxo rápido para medir a interação de A. fumigatus conidia com um grande número de leukócitos humanos primários que não são possíveis em protocolos microscópicos comuns. As células de imagem com um microscópio e conidia internalizada de contagem manual é complicada e podem ser feitas de forma realista apenas para algumas centenas de células. A citometria do fluxo supera este problema medindo milhares de pilhas dentro dos minutos. Um obstáculo co...

A aspergillose pulmonar invasiva é uma grande ameaça aos pacientes imunocomprometidos, pois as opções de tratamento são limitadas e só são bem-sucedidas após o diagnóstico precoce, o que leva a altas taxas de mortalidade1. Agentes infecciosos são conidia (esporos) do molde Aspergillus fumigatus que são onipresentes para a maioria dos habitats2. Conidia são inaladas, passam pelas vias aéreas e podem finalmente entrar no pulmão amasso. Em seres humanos imunocompetentes, estes conidia são limpos por células imunes inatas, como monócitos ou macrófagos e grânulos neutrófilos, que ocupam (fagocitose) e digerem os patógenos3. A fagocitose é importante para microbiologistas e imunologistas da mesma forma quando interessado em interações hospedóias-patógenos. Ensaios de confronto, como a co-incubação de leukócitos e conidia, muitas vezes incluem rotulagem dos esporos por fluoresceina ou sua fluoresceina derivada isotiaciana (FITC). Usando um microscópio, é simples identificar conidia fluorescente internalizada e determinar conidia anexada/aderente, embora essa abordagem seja complicada e realisticamente restrita a algumas centenas de células4. No entanto, na citometria de fluxo que facilmente permite a análise de centenas de milhares de células em poucos minutos, a coloração diferencial de conidia fagocitosada e aderente é vital. Portanto, muitos protocolos dependem trypan azul para saciar FITC-fluorescência de conidia adepto5,6,7,8. Outra abordagem é explorar a transferência de energia de ressonância fluorescência de brometo de etídio e FITC para emitir vermelho em vez de fluorescência verde da conidia aderente9,10,11. Se os anticorpos específicos estão disponíveis, como é o caso de algumas bactérias, partículas ligadas à célula podem ser diretamente manchadas12,13.
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar rápida e quantitativamente a fagocitose de FitC-rotulado A. fumigatus conidia por leukócitos humanos, juntamente com o apego de esporos às células e falta de interação, empregando uma alocecianina (APC) acoplado anticorpo anti-FITC. O método também permite a análise citométrica de fluxo simultâneo de marcadores celulares adicionais que podem ser empregados para análise separada da fagocitose por monócitos e neutrófilos da mesma amostra.
O protocolo pode ser aplicado para caracterização de cepas fúngicas (por exemplo, várias espécies de Aspergillus e outros moldes do gênero Mucorales apresentados aqui) e seus mutantes14 e pesquisa imunológica sobre fagócitos, como leukócitos de indivíduos imunocomprometidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

A infecção pulmonar invasora pelo molde Aspergillus fumigatus representa uma grande ameaça para os pacientes imunocomprometidos. Conidia fúngica inalada (esporos) são desmatadas dos avestélios pulmonares humanos por serem fagócitos por monócitos inatos e/ou neutrófilos. Este protocolo oferece uma medida rápida e confiável de fagocitose por citometria de fluxo usando conidia siciana tolice de fluoresceina (FITC) para co-incubação com leukócitos humanos e subsequente contramanchas com anticorpo antiFITC para permitir a discriminação de conidia internada e aderente celular. As principais vantagens deste protocolo são a sua rapidez, a possibilidade de combinar o ensaio com a análise citométrica de outros marcadores celulares de interesse, a análise simultânea de monócitos e neutrófilos de uma única amostra e sua aplicabilidade a outros fungos ou bactérias portadores de parede celular. A determinação de porcentagens de leukócitos de fagocitos fornece um meio aos microbiologistas para avaliar a virulência de um patógeno ou para comparar os wildtypes e os mutantes do micróbio patogénico assim como aos imunologistas para investigar capacidades humanas do leukocyte combater micróbios patogénicos.

Ao medir a fagocitose de A. fumigatus conidia por células fagocíticas humanas, a discriminação entre internalização genuína e mera fixação de conidia às células é um obstáculo, especialmente quando se trata de métodos de alta audácia, como citometria de fluxo. A fim de superar esse obstáculo, apresentamos um protocolo rápido e confiável com base na coloração de conidia com a corante fluorescente FITC antes da co-incubação de células e conidia, seguido por uma contra-mancha com um anticorpo...

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Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Este protocolo fornece um método rápido e confiável para medir quantitativamente a fagocitose de Aspergillus fumigatus conidia por phagocitos primários humanos usando citometria de fluxo e para discriminar a fagocitose da conidia de mera adesão a leukócitos.

Medição de phagocitose de Aspergillus fumigatus Conidia por Leukocytes Humanos usando citometria flow

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Este protocolo é significativo porque mede quantitativamente a fagocitose do rótulo Aspergillus fumigateurs Conidia por leucócitos humanos, juntamente com a fixação de Conidia às células, e a falta de interação por citometria de fluxo. A principal vantagem deste método é que ele facilita a análise rápida de um grande número de células. Além disso, a rotulagem dos marcadores celulares permite separar a avaliação de neutrófilos e monócitos dentro da mesma amostra.Em qualquer técnica, essa técnica pode ser usada para analisar outros fungos clínicos relevantes, como mucorales. Em vez disso, glóbulos vermelhos podem ser usados como fagocitos. Para começar este procedimento, molhe uma toalha de papel com desinfetante e coloque-a em um armário de bio segurança.Coloque um prato de Aspergillus fumigatus crescido em cima da toalha de papel para evitar a super distribuição da Conidia volátil. Adicione 10 mililitros de PBS contendo 0,01% de detergente em cima do fungo, e use uma espátula Drigalski para espalhar o líquido sobre a placa, e esfregue a Conidia de cor escura. Transfira a suspensão conidia para um 50 mililitro através de um coador de 30 micrômetros, que removerá qualquer micélia residual.Adicione mais 10 mililitros de PBS com detergente à placa, espalhe-o com uma espátula e transfira-o para o mesmo tubo através do coador. Em seguida, prepare uma solução estéril de carbonato de sódio molar 0.1, dissolvido em PBS. E prepare uma solução de 0,1 milimiliar de pó FITC, nesta solução de carbonato de sódio.Suspenda 100 milhões ou menos de Conidia, em cinco mililitros desta solução FITC, em um tubo de 15 mililitros. Incubar em uma rotadora a 37 graus Celsius por 20 minutos. Para inchar até Conidia, resuspenque o FITC rotulado conidia em cinco mililitros de meio RPMI, complementado com 10% de FCS.E incubar em uma rotadora a 37 graus Celsius pelo tempo desejado. Em um armário de bio segurança, coloque cinco mililitros de casaco buffy em um tubo de 50 mililitros. Encha o tubo com tampão EL e inverta três vezes.Incubar horizontalmente por cinco a oito minutos, até que a aparência leitosa da mistura fique clara. Em seguida, centrífuga a 300 vezes G, e à temperatura ambiente por 10 minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em um mililitro de tampão EL por pipetação.Adicione mais 24 mililitros de tampão EL e inverta o tubo várias vezes. Centrifugar a 300 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos. Descarte o supernasce e resuspenque as células em um mililitro de mídia RPMI, complementada com 10% de FCS.Para começar, transfira dois milhões de leucócitos e quatro milhões de Conidia com a etiqueta FITC em 1,5 mililitros de RPMI complementados com 10% de FCS, para uma placa de cultura de 12 poços. Inclua um controle de células apenas sem Conidia, e um controle de células com Conidia não rotulada. Incubar a placa em uma incubadora de dióxido de carbono umidificada, a 37 graus Celsius pelo tempo desejado.Quando a incubação estiver completa, use um raspador de células para colher as células e transfira-as para um tubo de 15 mililitros. Primeiro, coloque 100 microliters de cada amostra e controle em um poço de uma placa de fundo V de 96 poços. Adicione 150 microliters de PBS contendo dois milimões de EDTA para lavagem.Para compensação de cores, coloque um milhão de células sem Conidia para cada cor, em outros poços da placa. Inclua um poço de células que serão deixadas sem treinamento. Adicione 150 microliters de PBS contendo dois milimões de EDTA em cada poço para lavagem.Em seguida, cubra a placa com uma folha adesiva, e centrífuga a 300 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, remova a folha e descarte o supernaspetivo invertendo rapidamente e com força a placa apenas uma vez sobre a pia, ou uma toalha de papel descartável. Resuspend as células em 100 microliters de mistura de anticorpos, e misture bem por pipetação.Para compensações de cores, resuspenja as respectivas células em 100 microliters de PBS contendo dois milimões de EDTA, e adicione um único tipo de anticorpo a cada poço, na mesma quantidade utilizada na mistura de anticorpos. Cubra com uma folha adesiva e incubar à temperatura ambiente no escuro por 20 minutos. Depois disso, remova a folha e adicione 150 microliters de PBS contendo dois milimões de EDTA em cada poço para lavagem.Cubra a placa com papel alumínio adesivo novamente. Centrifugar a 300 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, remova a folha e descarte o supernaspetivo invertendo rapidamente e com força a placa sobre uma pia ou uma toalha de papel descartável.Resuspend as células em 200 microliters de PBS contendo 2 milimolalares EDTA, e transfira a suspensão celular de cada poço, em um tubo de fundo redondo separado. Inicie o citómetro de fluxo e deixe aquecer. No software de aquisição, crie um novo experimento e configure e rotule as novas amostras.Configure os parâmetros e os detectores para os fluoroforos apropriados, conforme descrito no protocolo de texto. Neste software, exiba os gráficos de ponto apropriados conforme descrito no protocolo de texto. Usando apenas as células amostra, adquira algumas células e coloque o portão em torno de leucócitos.Com base no portão leucócito, portão para células positivas CD45, para separar-se da Conidia na trama SSC CD45. Em um gráfico de pontos, CD14, CD66b, neutrófilos de portão e monócitos separadamente. Depois disso, mude de amostra apenas das células, para Conidia não rotulada.Em um gráfico de pontos, anti-FITC, APC FITC, exibem neutrófilos em quadrantes definidos para sinais anti-FITC e FITC. Abra a visão estatística e ajuste os quadrantes, permitindo um máximo de 1% das células nos quadrantes Q1, Q2 e Q4. Repita este processo para o portão de monócito. No portão de leucócitos, registos com pelo menos 20.000 eventos.A fagocitose da Conidia rotulada pelo FITC por neutrófilos humanos pode ser lida a partir das visões estatísticas. Neste estudo, um método citométrico de fluxo rápido é usado para medir a interação de Aspergillus fumigateurs Conidia com um grande número de leucócitos humanos primários. Utilizando os anticorpos apropriados e a estratégia de gating aqui mostrada, um gating geral de leucócitos humanos pelas características do FSC e do SSC, é seguido por uma separação de leucócitos em Conidia livre, pelo marcador de leucócito pan, CD45.A conidia pode atingir quase o tamanho da célula no momento da citometria de fluxo, especialmente quando se usa Conidia inchada, e ou longos tempos de incubação, e assim pode nos comprar análises. Uma vez que monócitos primários humanos e neutrófilos tomam Conidia de forma diferente, este protocolo permite a análise separada dessas células baseadas, na coloração com os marcadores de linhagem celular bem estabelecidos, CD14 para monócitos e CD66b para neutrófilos. O percentual de fagocitos primários humanos internalizando a Conidia pode ser altamente variável entre os doadores de sangue, mas também depende de fatores experimentais, como tempo de incubação e estado de inchaço da Conidia.A internalização do esporo pode ser detectada após 0,5 horas de co-incubação, e aumenta com o tempo. Conidia pré-inchada são tomadas mais fácil do que esporos de descanso, mesmo em curtos períodos de incubação. Se a Conidia for fixada com formaldeído, a fagocitose é diminuída em comparação com a Conidia nativa.Após este procedimento, supernacantantes de células imunes co-incubadas e Conidia podem ser coletados e analisados por Eliza para verificar se a interação provoca uma liberação de citocina pelas células imunes. Por favor, lembre-se, o sangue humano pode potencialmente transmitir doenças infecciosas. Este trabalho requer a vacinação em toda a Hepatite B, o uso de um armário de bio segurança, bem como o uso de luvas em um jaleco.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Imunologia e Infecção

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Medindo Anexo e Internalização do Vírus da Influenza A em células A549 por citometria de fluxo

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Imagens ao vivo de antifúngicos Atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Medição do receptor complemento eririotcyte 1 usando citometria de fluxo

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...