Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Мы благодарим г-жу Пиа Стьера за отличную техническую помощь. М. фон Лилиенфельд-Тоал поддерживается Центром контроля и ухода за сепсисом (Федеральное министерство образования и здравоохранения Германии, BMBF, ФКЗ 01E01002) и исследовательским кампусом InfectoGnostics (BMBF, ФКЗ 13GW0096D). Тхи Нгок Май Хоанг поддерживается Школой микробной коммуникации Джены (Deutsche Forschungsgemeinschaft, ФКЗ 214/2)

Этот протокол включает в себя использование человеческих шуб, полученных из Института трансфузионной медицины, больницы Университета Джены и свежей венозной крови, взятой у пациентов, как после письменного информированного согласия доноров в соответствии с утверждением комитета по ?...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

Этот протокол представляет собой метод быстрого потока цитометрического измерения взаимодействия A. fumigatus conidia с большим количеством первичных человеческих лейкоцитов, что невозможно в общих микроскопических протоколах. Воображение клеток с микроскопом и вручную подсчета интер?...

Инвазивный аспергиллез легких представляет большую угрозу для пациентов с ослабленным иммунитетом, так как варианты лечения ограничены и успешны только при ранней диагностике, что приводит к высокой смертности1. Инфекционные агенты conidia (споры) формы Aspergillus fumigatus, которые повсеместно в большинстве мест обитания2. Conidia вдыхаются, проходят через дыхательные пути и может, наконец, войти в легких альвеолы. У иммунокомпетентных людей, эти конидии очищаются врожденными иммунными клетками, такими как моноциты или макрофаги и нейтрофильные гранулоциты, которые занимают (фагоциты) и переваривают патогены3. Фагоцитоз имеет важное значение для микробиологов и иммунологов также, когда заинтересованы в принимающей патогенвзаимодействия взаимодействия. Конфронтационные анализы, такие как совместное инкубацию лейкоцитов и конидии, часто включают маркировку спор флуоресценгом или его производным флуоресцеем изотиоциана (FITC). Используя микроскоп, это просто определить интернализированные флуоресцентные конидии и определить прилагается / приверженец conidia, хотя этот подход является громоздким и реально ограничивается несколько сотен клеток4. Однако, в потоке цитометрии, которая легко позволяет анализ сотен тысяч клеток в течение нескольких минут, дифференциальное окрашивание фагоцитозных и приверженцев conidia имеет жизненно важное значение. Таким образом, многие протоколы полагаются на Trypan Blue, чтобы утолить FITC-флуоресценцию от адепта conidia5,6,7,8. Другой подход является использование флуоресценции резонанса передачи энергии бромида этидия и FITC излучать красный вместо зеленого флуоресценции от приверженца conidia9,10,11. Если конкретные антитела доступны, как и в случае с некоторыми бактериями, клеточные частицы могут быть непосредственно окрашенных12,13.
Здесь мы представляем протокол для быстрой и количественной оценки фагоцитоза FITC-маркировки A. fumigatus conidia человеческими лейкоцитами наряду с прикреплением спор к клеткам и отсутствием взаимодействия, используя аллофикоцианин (APC)-связанные антитела FITC. Метод также позволяет одновременно цитометрический анализ потока дальнейших маркеров клеток, которые могут быть использованы для отдельного анализа фагоцитоза моноцитами и нейтрофиловизмом из того же образца.
Протокол может быть применен для характеристики грибковых штаммов (например, несколько видов Аспергилл и других форм из рода Mucorales представлены здесь) и их мутантов14 и иммунологических исследований на фагоциты, такие как лейкоциты от иммунокомпромиссных лиц.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

Инвазивная легочная инфекция плесенью Aspergillus fumigatus представляет большую угрозу для пациентов с ослабленным иммунитетом. Вдыхаемые грибковые конидии (споры) очищаются от альвеолов легких человека путем фагоцита врожденными моноцитами и/или нейтрофилов. Этот протокол предлагает быстрое и надежное измерение фагоцитоза цитометрией потока с использованием флуоресцеина изотиоцианата (FITC) с маркировкой кониии для совместной инкубации с человеческими лейкоцитами и последующего противопоразрезания с анти-FITC антитела, чтобы позволить дискриминации интернализированной и клеточной приверженности conidia. Основными преимуществами этого протокола являются его быстрота, возможность совмещения анализа с цитометрическим анализом других клеточных маркеров, представляющих интерес, одновременный анализ моноцитов и нейтрофилов из одного образца и его применимость к другим клеточным настенным грибам или бактериям. Определение процентных долей фагоцитов лейкоцитов предоставляет микробиологам средства для оценки вирулентности патогена или для сравнения патогенных диких типов и мутантов, а также иммунологов для исследования возможностей лейкоцитов человека по борьбе с патогенными микроорганизмами.

При измерении фагоцитоза A. fumigatus conidia человеческими фагоцитными клетками, дискриминация между подлинной интернализацией и простой привязанностью конидии к клеткам является препятствием, особенно когда речь идет о методах высокой пропускной связи, таких как цитометрия потока. Дл?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Этот протокол обеспечивает быстрый и надежный метод количественного измерения фагоцитоза Aspergillus fumigatus conidia человеческими первичными фагоцитами с использованием цитометрии потока и дискриминировать фагоцитоз конидии от простого прилипения к лейкоцитам.

Измерение фагоцитоза Aspergillus fumigatus Conidia человеческими лейкоцитами с помощью цитометрии потока

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он количественно измеряет фагоцитоз помечены Aspergillus фумигатуры Conidia человека лейкоцитов, наряду с присоединением Conidia к клеткам, и отсутствие взаимодействия поток цитометрии. Основным преимуществом этого метода является то, что он облегчает быстрый анализ большого количества ячеек. Кроме того, маркировка клеточных маркеров позволяет отделить оценку нейтрофилов и моноцитов в пределах одного образца.В любом этом методе может быть использован для анализа других клинических соответствующих грибов, как Mucorales. Вместо этого красные кровяные тельца могут быть использованы в качестве фагоцитов. Для начала этой процедуры промокнете бумажное полотенце дезинфицирующим средством и поместите его в био-кабинет безопасности.Поместите тарелку выращенного Aspergillus fumigatus поверх бумажного полотенца, чтобы предотвратить чрезмерное распределение летучих Conidia. Добавить 10 миллилитров PBS, содержащих 0,01%detergent на вершине гриба, и использовать шпатель Drigalski для распространения жидкости по пластине, и стереть темного цвета Conidia. Перенесите подвеску Conidia на 50 миллилитров через 30-метровый ситечко, которое снимет остаточную мицелию.Добавьте еще 10 миллилитров PBS с моющим средством к пластине, распределите его шпателем и перенесите в ту же трубку через ситечко. Затем приготовьте стерильный раствор 0,1 молярного карбоната натрия, растворенного в PBS. И приготовьте 0,1 миллимолярдный раствор порошка FITC в этом карбонатом натрия.Повторно приостанавливать 100 миллионов или менее Conidia, в пяти миллилитров этого раствора FITC, в 15 миллилитров трубки. Инкубировать в ротаторе при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Чтобы набухать до Конидии, повторно подать FITC помечены Conidia в пяти миллилитров RPMI среды, дополненный 10%FCS.И инкубировать в ротаторе при 37 градусах по Цельсию в течение нужного времени. В шкаф биобезопасности поместите пять миллилитров буйного пальто в трубку 50 миллилитров. Заполните трубку буфером EL, и инвертировать три раза.Инкубировать горизонтально в течение пяти-восьми минут, пока молочный вид смеси становится ясным. Затем центрифуга при температуре 300 Г, а при комнатной температуре в течение 10 минут. Отбросьте супернатант и повторно посовелите гранулы в один миллилитр буфера EL путем трубопроводов.Добавьте еще 24 миллилитров буфера EL и несколько раз инвертировать трубку. Центрифуга при температуре 300 Г и при комнатной температуре в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте клетки в одном миллилитров RPMI media, дополненном 10%FCS.Для начала, передача двух миллионов лейкоцитов и четыре миллиона FITC помечены Conidia в 1,5 миллилитров RPMI дополнен 10%FCS, на 12-ну культуры пластины. Включите контроль над клетками только без Конидии и контроль над клетками с необляблой Конидией. Инкубировать пластину в инкубаторе увлажненной двуокиси углерода, при 37 градусах по Цельсию в течение желаемого количества времени.Когда инкубация завершена, используйте сотовый скребок для сбора клеток, и передать их в трубку 15 миллилитров. Во-первых, положить 100 микролитров каждого образца и элементы управления в один колодец из 96-хорошо V-нижней пластины. Добавьте 150 микролитров PBS, содержащих два миллимолара EDTA для стирки.Для компенсации цвета, поместите один миллион клеток без Conidia для каждого цвета, в других колодцах пластины. Включите колодец клеток, которые будут оставлены неудержимыми. Добавьте 150 микролитров PBS, содержащих два миллимолара ЭДТА, к каждому колодец для мытья.Затем накройте тарелку клейкой фольгой и центрифугой при температуре 300 Г и при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем снимите фольгу и отбросьте супернатант, быстро и силой инвертировать пластину только один раз над раковиной, или одноразовым бумажным полотенцем. Повторное использование клеток в 100 микролитров смеси антител, и хорошо перемешать с помощью пипетки.Для цветовых компенсаций, повторно использовать соответствующие клетки в 100 микролитров PBS, содержащих два миллимолара ЭДТА, и добавить один тип антител к каждому хорошо, в том же количестве, используемом в смеси антител. Накрыть клейкой фольгой и инкубировать при комнатной температуре в темное время суток в течение 20 минут. После этого снимите фольгу и добавьте 150 микролитров PBS, содержащих два миллимолара ЭДТА, к каждому хорошо для мытья.Снова накройте тарелку клейкой фольгой. Центрифуга при температуре 300 Г и при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем удалите фольгу, и отбросить supernatant быстро и силой инвертирования пластины либо раковина или одноразовое бумажное полотенце.Повторное распределение клеток в 200 микролитров PBS, содержащих 2 миллимолярные ЭДТА, и передача клеточной подвески из каждой хорошо, в отдельную круглую нижнюю трубку. Запустите поток цитометра, и дайте ему прогреться. В программном обеспечении для приобретения создайте новый эксперимент, а также навейте и отмейте новые образцы.Настройка параметров и детекторов для соответствующих фторфоров, как указано в текстовом протоколе. В этом программном обеспечении отображаются соответствующие точечные графики, изложенные в текстовом протоколе. Используя только образец клеток, приобрести некоторые клетки и установить ворота вокруг лейкоцитов.Основываясь на воротах лейкоцитов, ворота для CD45 положительных клеток, чтобы отделиться от Conidia в SSC CD45 участка. В точечном сюжете CD14, CD66b, ворота нейтрофилов и моноцитов отдельно. После этого, изменить из клеток только образец, на неочерпаемый Conidia.В точечном сюжете, анти-FITC, APC FITC, отображение нейтрофилов в установленных квадрантах для анти-FITC, и FITC сигналов. Откройте представление статистики и отрегулируйте квадранты, позволяя максимум 1% ячеек в квадрантах No1, No2 и No4. Повторите этот процесс для ворот моноцитов. В воротах лейкоцитов записывают все образцы не менее чем с 20 000 событий.Фагоцитоз КОНидии, помеченной FITC нейтрофилами человека, можно прочитать из статистических представлений. В этом исследовании используется цитометрический метод быстрого потока для измерения взаимодействия фумигатов Aspergillus Conidia с большим количеством первичных лейкоцитов человека. Использование соответствующих антител и gating стратегии показано здесь, общее gating человека лейкоцитов FSC и SSC характеристики, сопровождается разделением лейкоцитов в свободной Конидии, пан лейкоцитов маркер, CD45.Конидия может достигать почти размера клеток во время цитометрии потока, особенно при использовании опухшие Conidia, и или долго инкубации раз, и, таким образом, может купить нам анализ. Поскольку первичные моноциты и нейтрофили человека по-разному берут Конидию, этот протокол позволяет проводить отдельный анализ популяции этих клеток на основе окрашивания с устоявшимися маркерами клеточной линии, CD14 для моноцитов и CD66b для нейтрофилов. Процент первичных фагоцитов человека, интернализации Conidia может быть весьма переменной среди доноров крови, но также зависит от экспериментальных факторов, таких как инкубационое время и отек состояние Конидии.Интернализация спор может быть обнаружена после 0,5 часов совместной инкубации, и увеличивается со временем. Предварительно опухшие Conidia принимаются легче, чем споры отдыха, даже в короткие инкубационые времена. Если Конидия фиксируются формальдегидом, фагоцитоз уменьшается по сравнению с родной Конидией.После этой процедуры, супернатанты со-инкубированных иммунных клеток и Conidia могут быть собраны и проанализированы Элизой, чтобы проверить, если взаимодействие вызывает высвобождение цитокинов иммунными клетками. Пожалуйста, помните, что человеческая кровь потенциально может передавать инфекционные заболевания. Эта работа требует вакцинации по всему гепатиту В, использования био-безопасности шкаф, а также носить перчатки на лабораторном пальто.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Измерение кальпаин деятельности в фиксированных и живых клеток методом проточной цитометрии

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Измерение Вложений и интернализации вируса гриппа в клетках А549 методом проточной цитометрии

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Измерение гранулоцитов и моноцитов Фагоцитоз и окислительный взрыв активности в крови человека

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Живая съемка противогрибковой активности на человеке первичных нейтрофилов и моноцитах в ответ на<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Характеристика человека Моноцит подмножеств по цельной крови Cytometry анализ потока

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Изоляция лейкоцитов от грудного молока человека для использования в антитела-зависимых клеточного фагоцитоза Ассей ВИЧ Цели

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Измерение эритроцитов дополнение рецептор ато 1 Использование потока цитометрии

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...