Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Agradecemos a la Sra. Pia Stier por su excelente asistencia técnica. M. von Lilienfeld-Toal cuenta con el apoyo del Centro de Control y Cuidado de la Sepsis (Ministerio Federal Alemán de Educación y Salud, BMBF, FKZ 01E01002) y el Campus de Investigación Desinfecciosa (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang cuenta con el apoyo de la Escuela de Comunicación Microbiana de Jena (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)

Este protocolo incluye el uso de abrigos de buffy humanos obtenidos del Instituto de Medicina Transfusional, Hospital Universitario de Jena y sangre venosa fresca extraída de los pacientes, tanto después del consentimiento informado por escrito de los donantes de acuerdo con la aprobación 4357-03/15 del comité de ética.
1. Preparación de Aspergillus fumigatus Conidia
<ol><li>Cultivar A. fumigatus en platos de agar de malta Petri al 1,5% durante 5 días a 37 oC sin CO<...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

Este protocolo presenta un método citométrico de flujo rápido para medir la interacción de A. fumigatus conidia con un gran número de leucocitos humanos primarios que no es posible en los protocolos microscópicos comunes. Las células de imagen con un microscopio y el recuento manual de conidias internalizadas son engorrosas y se pueden hacer de forma realista solo para unos pocos cientos de células. La citometría de flujo supera este problema midiendo miles de células en cuestión de minutos. Un obstá...

La aspergilosis pulmonar invasiva es una gran amenaza para los pacientes inmunocomprometidos, ya que las opciones de tratamiento son limitadas y solo tienen éxito tras el diagnóstico precoz, lo que conduce a altas tasas de mortalidad1. Los agentes infecciosos son conidia (esporas) del moho Aspergillus fumigatus que son omnipresentes en la mayoría de los hábitats2. Conidia se inhala, pasa a través de las vías respiratorias y finalmente puede entrar en los alvéolos pulmonares. En los seres humanos inmunocompetentes, estas conidias son borradas por células inmunitarias innatas como monocitos o macrófagos y granulocitos neutrófilos, que toman (fagocitosa) y digieren los patógenos3. La fagocitosis es importante para los microbiólogos e inmunólogos también cuando están interesados en interacciones huésped-patógeno. Los ensayos de confrontación, como la coincubación de leucocitos y conidia, a menudo incluyen el etiquetado de las esporas por fluoresceína o su derivado fluoresceína isotiocianato (FITC). Usando un microscopio, es sencillo identificar la conidia fluorescente internalizada y determinar la conidia adjunta/adherente, aunque este enfoque es engorroso y realistamente restringido a unos cientos de células4. Sin embargo, en la citometría de flujo que permite fácilmente el análisis de cientos de miles de células en cuestión de minutos, la tinción diferencial de la conidia fagocitosed y adherente es vital. Por lo tanto, muchos protocolos dependen de Trypan Blue para saciar la fluorescencia FITC de la conidia5adherente,6,7,8. Otro enfoque es explotar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de bromuro de etidio y FITC para emitir rojo en lugar de fluorescencia verde de conidiaadherente 9,10,11. Si se dispone de anticuerpos específicos, como es el caso de algunas bacterias, las partículas enlazadas a las células se pueden teñir directamente12,13.
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar rápida y cuantitativamente la fagocitosis de A. fumigatus conidia con la etiqueta FITC por leucocitos humanos junto con la unión de esporas a las células y la falta de interacción mediante el empleo de un anticuerpo anti-FITC acoplado con aloficocianina (APC). El método también permite el análisis citométrico de flujo simultáneo de otros marcadores celulares que se pueden emplear para el análisis separado de la fagocitosis por monocitos y neutrófilos de la misma muestra.
El protocolo se puede aplicar para la caracterización de cepas fúngicas (por ejemplo, varias especies de Aspergillus y otros mohos del género Mucorales presentados aquí) y sus mutantes14 e investigación inmunológica sobre fagocitos, como leucocitos de individuos inmunocomprometidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

La infección pulmonar invasiva por el moho Aspergillus fumigatus representa una gran amenaza para los pacientes inmunocomprometidos. La conidia fúngica inhalada (esporas) se elimina de los alvéolos pulmonares humanos al ser fagocitos innatados por monocitos innatos y/o neutrófilos. Este protocolo ofrece una medición rápida y fiable de la fagocitosis mediante citometría de flujo utilizando conidia etiquetada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) para la coincubación con leucocitos humanos y posterior contramancha con un anticuerpo anti-FITC para permitir la discriminación de la conidia internaizada y celular. Las principales ventajas de este protocolo son su rapidez, la posibilidad de combinar el ensayo con el análisis citométrico de otros marcadores celulares de interés, el análisis simultáneo de monocitos y neutrófilos a partir de una sola muestra y su aplicabilidad a otros hongos o bacterias portadoras de paredes celulares. La determinación de porcentajes de leucocitos fagocitos proporciona un medio a los microbiólogos para evaluar la virulencia de un patógeno o para comparar los tipos silvestres patógenos y mutantes, así como a los inmunólogos para investigar las capacidades de leucocitos humanos para combatir patógenos.

Al medir la fagocitosis de A. fumigatus conidia por las células fagocíticas humanas, la discriminación entre la internalización genuina y la mera vinculación de la conidia a las células es un obstáculo, especialmente cuando se trata de métodos de alto rendimiento como la citometría de flujo. Para superar este obstáculo, presentamos un protocolo rápido y fiable basado en la tinción de conidia con el tinte fluorescente FITC antes de la coincubación de células y conidia, seguido de un contramanchado c...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Este protocolo proporciona un método rápido y fiable para medir cuantitativamente la fagocitosis de Aspergillus fumigatus conidia por los fagocitos primarios humanos utilizando citometría de flujo y para discriminar la fagocitosis de la conidia de la mera adhesión a los leucocitos.

Medición de la fagocitosis de Aspergillus fumigatus Conidia por leucocitos humanos utilizando citometría de flujo

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Este protocolo es significativo porque mide cuantitativamente la fagocitosis de los fumigatedores de Aspergillus conidia etiquetados por leucocitos humanos, junto con la unión de Conidia a las células, y la falta de interacción por citometría de flujo. La principal ventaja de este método es que facilita el análisis rápido de un gran número de células. Además, el etiquetado de los marcadores celulares permite separar la evaluación de neutrófilos y monocitos dentro de la misma muestra.En cualquier esta técnica se puede utilizar para analizar otros hongos clínicamente relevantes como Mucorales. En su lugar, los glóbulos rojos se pueden utilizar como fagocitos. Para comenzar este procedimiento, moje una toalla de papel con desinfectante y colóquela en un gabinete de seguridad biológica.Coloque un plato de Aspergillus fumigatus cultivado encima de la toalla de papel para evitar la distribución excesiva de Conidia volátil. Añadir 10 mililitros de PBS que contengan 0.01% de detergente en la parte superior del hongo, y usar una espátula Drigalski para esparcir el líquido sobre la placa, y frotar el conidia de color oscuro. Transfiera la suspensión de Conidia a un 50 mililitros a través de un colador de 30 micrómetros, que eliminará cualquier micelio residual.Añadir otros 10 mililitros de PBS con detergente a la placa, extenderlo con una espátula y transferirlo al mismo tubo a través del colador. A continuación, preparar una solución estéril de 0,1 molar de carbonato sódico, disuelto en PBS. Y preparar una solución de 0,1 milimolar de polvo FITC, en esta solución de carbonato de sodio.Re-suspenda 100 millones o menos de Conidia, en cinco mililitros de esta solución FITC, en un tubo de 15 mililitros. Incubar en un rotador a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Para hincharse a Conidia, resuspendir el FITC etiquetado Conidia en cinco mililitros de medio RPMI, complementado con 10%FCS.E incubar en un rotador a 37 grados centígrados durante el tiempo deseado. En un gabinete de seguridad biológica, coloque cinco mililitros de capa de buffy en un tubo de 50 mililitros. Llene el tubo con el buffer EL e invierta tres veces.Incubar horizontalmente durante cinco a ocho minutos, hasta que la apariencia lechosa de la mezcla se vuelva clara. Luego, centrifugar a 300 veces G, y a temperatura ambiente durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en un mililitros de tamal EL por pipeteo.Agregue otros 24 mililitros de tampón EL e invierta el tubo varias veces. Centrifugar a 300 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en un mililitros de medios RPMI, complementado con 10%FCS.Para empezar, transfiera dos millones de leucocitos y cuatro millones de Conidia con etiqueta FITC en 1,5 mililitros de RPMI complementados con 10%FCS, a una placa de cultivo de 12 pozos. Incluya un control de celdas solo sin Conidia y un control de celdas con Conidia sin etiquetar. Incubar la placa en una incubadora de dióxido de carbono humidificada, a 37 grados centígrados durante el tiempo deseado.Una vez completada la incubación, utilice un rascador celular para cosechar las células y transfieralas a un tubo de 15 mililitros. En primer lugar, coloque 100 microlitros de cada muestra y controles en un pozo de una placa inferior en V de 96 pozos. Añadir 150 microlitros de PBS que contengan dos mililitros de EDTA para el lavado.Para la compensación de color, coloque un millón de celdas sin Conidia para cada color, en otros pozos de la placa. Incluya un pozo de celdas que quedarán sin restricciones. Añadir 150 microlitros de PBS que contengan dos mililitros de EDTA a cada pozo para el lavado.A continuación, cubra la placa con una lámina adhesiva y centrifugar a 300 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, retire la lámina y deseche el sobrenadante invirtiendo rápida y contundentemente la placa una sola vez sobre el fregadero o una toalla de papel desechable. Resuspender las células en 100 microlitros de mezcla de anticuerpos, y mezclar bien por pipeteo.Para las compensaciones de color, resuspender las células respectivas en 100 microlitros de PBS que contienen dos mililitros de EDTA, y añadir un solo tipo de anticuerpo a cada pozo, en la misma cantidad utilizada en la mezcla de anticuerpos. Cubrir con una lámina adhesiva e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 minutos. Después de esto, retire la lámina y agregue 150 microlitros de PBS que contengan dos mililitros de EDTA a cada pozo para el lavado.Cubra la placa con papel de aluminio adhesiva de nuevo. Centrifugar a 300 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, retire la lámina y deseche el sobrenadante invirtiendo rápida y contundentemente la placa sobre un fregadero o una toalla de papel desechable.Resuspender las células en 200 microlitros de PBS que contienen 2 EDTA milimétricas, y transferir la suspensión celular de cada pozo, en un tubo inferior redondo separado. Arranque el citómetro de flujo y déjelo calentar. En el software de adquisición, cree un nuevo experimento y configure y etiquete los nuevos ejemplos.Configure los parámetros y los detectores para los fluoróforos apropiados, como se describe en el protocolo de texto. En este software, muestre las gráficas de puntos adecuadas como se describe en el protocolo de texto. Usando las células sólo muestran, adquirir algunas células y establecer la puerta alrededor de los leucocitos.Basado en la puerta de leucocitos, puerta para células positivas CD45, para separar de Conidia en la gráfica SSC CD45. En una gráfica de puntos, CD14, CD66b, neutrófilos de puerta y monocitos por separado. Después de esto, cambie de la muestra de las celdas solamente, a Conidia sin etiquetar.En una gráfica de puntos, anti-FITC, APC FITC, muestran neutrófilos en cuadrantes establecidos para señales anti-FITC y FITC. Abra la vista de estadísticas y ajuste los cuadrantes, permitiendo un máximo del 1% de las celdas en los cuadrantes Q1, Q2 y Q4. Repita este proceso para la puerta del monocitos. En la puerta del leucocitos, registre todas las muestras con al menos 20.000 eventos.La fagocitosis de la conidia etiquetada por FITC por neutrófilos humanos se puede leer a partir de las opiniones de las estadísticas. En este estudio, se utiliza un método citométrico de flujo rápido para medir la interacción de Aspergillus fumigateurs Conidia con un gran número de leucocitos humanos primarios. Utilizando los anticuerpos apropiados y la estrategia de gating que se muestra aquí, un gating general de leucocitos humanos por características FSC y SSC, es seguido por una separación de leucocitos en conidia libre, por el marcador de leucocitos pan, CD45.Conidia puede alcanzar casi el tamaño de la célula en el momento de la citometría de flujo, especialmente cuando se utiliza Conidia hinchada, y o largos tiempos de incubación, y por lo tanto puede comprarnos análisis. Dado que los monocitos primarios humanos y los neutrófilos toman Conidia de manera diferente, este protocolo permite el análisis separado de estas poblaciones celulares basado, en la tinción con los marcadores de linaje celular bien establecidos, CD14 para monocitos, y CD66b para neutrófilos. El porcentaje de fagocitos primarios humanos que internalizan Conidia puede ser muy variable entre los donantes de sangre, pero también depende de factores experimentales, como el tiempo de incubación y el estado de hinchazón de Conidia.La internalización de la espora se puede detectar después de 0,5 horas de incubación conjunta y aumenta con el tiempo. La Conidia pre-hinchada se toma más fácil que las esporas en reposo, incluso en tiempos cortos de incubación. Si Conidia se fija con formaldehído, la fagocitosis disminuye en comparación con Conidia nativa.Después de este procedimiento, el Cairo puede recolectar y analizar los sobrenadantes de células inmunitarias co-incubadas y Conidia para comprobar si la interacción provoca una liberación de citoquinas por las células inmunitarias. Recuerde que la sangre humana puede transmitir enfermedades infecciosas. Este trabajo requiere la vacunación a través de la Hepatitis B, el uso de un gabinete de seguridad biológica, así como el uso de guantes en una bata de laboratorio.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Medición de apego y Internalización del Virus de la Influenza en células A549 por Citometría de Flujo

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Imágenes en vivo de la actividad antifúngica por los neutrófilos humanos primarios y los monocitos en respuesta a las<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagococitosis celular dependiente de anticuerpos de metas de VIH

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Medición del receptor de complemento de eritrocitos 1 mediante citometría de flujo

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...