Name: measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Bayan Pia Stier'e mükemmel teknik yardım için teşekkür ederiz. M. von Lilienfeld-Toal, Sepsis Kontrol ve Bakım Merkezi (Almanya Federal Eğitim ve Sağlık Bakanlığı, BMBF, FKZ 01E01002) ve InfectoGnostik Araştırma Kampüsü (BMBF, FKZ 13GW0096D) tarafından desteklenir. Thi Ngoc Mai Hoang Jena Mikrobiyal İletişim Okulu (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2) tarafından desteklenir

Bu protokol, Transfüzyon Tıbbı Enstitüsü' nden, Jena Üniversitesi Hastanesi' nden elde edilen insan buffy paltolarının ve hastaların taze venöz kanlarının, hem bağışçıların etik kurulu onayı 4357-03/15 uyarınca yazılı olarak onayını aldıktan sonra kullanılmasını kapsamaktadır.
1. Aspergillus fumigatus Conidia hazırlanması
<ol><li>Co2olmadan 37 °C'de 5 gün boyunca %1,5 malt agar Petri kaplarında A. fumigatus yetiştirin. <stron...

<ol>
	<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+killers:+human+fungal+infections.">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).</li><li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi.">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li><li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response.">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li><li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+versus+escape:+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages.">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).</li><li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils.">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li><li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils.">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li><li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells.">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li><li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13++leukocytes.">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li><li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New,+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis.">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li><li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li><li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils.">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li><li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis.">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li><li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells.">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li><li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry.">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li><li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry.">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li></ol>

Bu protokol, a. fumigatus conidia'nın çok sayıda birincil insan lökositi ile etkileşimini ölçmek için hızlı bir akış sitometrik yöntemi ni sunar ve bu yöntem ortak mikroskobik protokollerde mümkün değildir. Bir mikroskop ile görüntüleme hücreleri ve elle içselleştirilmiş konidia sayma hantal ve gerçekçi sadece birkaç yüz hücreleri için yapılabilir. Akış sitometrisi bu sorunun üstesinden birkaç dakika içinde binlerce hücreyi ölçerek giderilir. Her iki yaklaşımda da yaygın...

İnvaziv pulmoner aspergillosis, tedavi seçenekleri sınırlı ve sadece erken tanı da başarılı olduğu için immünazatlı hastalar için büyük bir tehdittir, bu da yüksek mortalite oranlarına yol açar1. Enfeksiyöz ajanlar çoğu habitat2 için her yerde olan küf Aspergillus fumigatus konidia(sporlar)vardır. Conidia solunduğunda, solunum yollarından geçer ve sonunda akciğer alveollerine girebilir. İmmün yetersiz insanlarda, bu konidia monositler veya makrofajlar ve nötrofil granülositler gibi doğuştan gelen bağışıklık hücreleri tarafından temizlenir, hangi (fagositoz) almak ve patojenleri sindirmek3. Fagositositaz, konak-patojen etkileşimleri ile ilgili olarak mikrobiyologlar ve immünolojistler için de önemlidir. Lökosit ve konidianın birlikte kuluçkaya yevdirilmesi gibi çatışma denemeleri genellikle floresan veya türevi floresan izotiyoyanat (FITC) ile sporların etiketlemesi içerir. Bir mikroskop kullanarak, bu yaklaşım hantal ve gerçekçi hücrelerin birkaç yüz sınırlı olmasına rağmen, içselleştirilmiş floresan konidia belirlemek ve ekli / yapışık konidibelirlemek için basittir4. Ancak, kolayca dakika içinde hücrelerin yüz binlerce analizini sağlayan akış sitometrisinde, fagositositve yapışık konidianın diferansiyel boyanması hayati önem taşır. Bu nedenle, birçok protokoller adherentconidia5,6,7,8FITC-floresan söndürmek için Trypan Mavi güveniyor. Başka bir yaklaşım yapışık conidia9,10,11yeşil floresan yerine kırmızı yaklamak ethidyum bromür ve FITC floresan rezonans enerji transferi istismar olduğunu . Belirli antikorlar varsa, bazı bakteriler için olduğu gibi, hücrebağlı parçacıklar doğrudan lekeli olabilir12,13.
Burada, insan lökositler tarafından FITC etiketli A. fumigatus conidia fagositozunun hızlı ve nicel olarak değerlendirilmesi için bir protokol sunmaktayız ve sporların hücrelere bağlanması ve allofikocyanin (APC) birleştirilmiş anti-FITC antikorkullanılarak etkileşim eksikliği. Bu yöntem aynı örnekten monositler ve nötrofiller tarafından fagositözayrı analizi için istihdam edilebilir diğer hücre belirteçleri eşzamanlı akış sitometrik analizi için izin verir.
Protokol, mantar suşlarının (örneğin, burada mucorales cinsinden çeşitli Aspergillus türleri ve diğer kalıpların) ve mutantların14 ve fagositler üzerinde immünolojik araştırmaları, örneğin immünazatlı bireylerden lökositler gibi karakterizasyonu için uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive foil</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD14 V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561391</td>
			<td>clone M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 BUV395</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563792</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562254</td>
			<td>clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FITC APC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17-7691-82</td>
			<td>clone NAWESLEE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Bioswisstech</td>
			<td>800020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td>SmartStrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Tween 20, 0.01% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drigalski spatula</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PC59.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ED3SS-500g</td>
			<td>2 mM in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>10% in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3651-100MG</td>
			<td>0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyd</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>PO87.3</td>
			<td>Histofix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt agar (1.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 &#176;C for 35 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8563.1</td>
			<td>0.1 M in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>633180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>189012-014</td>
			<td>without Calcium, without Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube, 7.5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for data acquisition and analysis</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>FACSDiva 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate, 96 well</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781601</td>
			<td>untreated surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagocytosis of aspergillus fumigatus conidia by human leukocytes using flow cytometry

Küf Aspergillus fumigatus tarafından invaziv pulmoner enfeksiyon bağışıklık hastaiçin büyük bir tehdit oluşturmaktadır. İnhale mantar konidia (sporlar) doğuştan gelen monositler ve/veya nötrofiller tarafından fagositosed olarak insan akciğer alveollerinden temizlenir. Bu protokol, insan lökositleri ile birlikte kuluçka için floresan izotiyoyanat (FITC) etiketli konidia ve daha sonra içselleştirilmiş ve hücre-yapışık konidia ayrımcılığına izin vermek için bir anti-FITC antikor ile sonraki karşı boyama kullanarak akış sitometri tarafından fagositoz hızlı ve güvenilir bir ölçüm sunuyor. Bu protokolün en önemli avantajları, hızlılığı, tahlilleri diğer şüpheli hücre belirteçlerinin sitometrik analizi ile birleştirme olasılığı, tek bir örnekteki monosit ve nötrofillerin eşzamanlı analizi ve diğer hücre duvar taşıyan mantar veya bakterilere uygulanabilirliğidir. Fagositasyon lökosityüzdelerinin belirlenmesi, bir patojenin virülansını değerlendirmek veya patojen yabani tipleri ve mutantları karşılaştırmak için mikrobiyologlara ve patojenlerle mücadele de insan lökosit yeteneklerini araştırmak için immünolojistlere bir araç sağlar.

A. fumigatus conidia'nın fagosittozunun insan fagositik hücreleri tarafından ölçülmesinde, gerçek içselleştirme ile konidianın hücrelere sadece bağlanması arasındaki ayrımcılık, özellikle akış sitometrisi gibi yüksek iş verme yöntemleri söz konusu olduğunda bir engeldir. Bu engeli aşmak için, hücre ve konidianın birlikte kuluçkaya yatması öncesinde floresan boya FITC ile konidianın boyanmasını temel alan hızlı ve güvenilir bir protokol sunmaktayız ve ardından kuluçka sonr...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Bu protokol, aspergillus fumigatus conidia'nın fagositozunu akış sitometrisi kullanarak insan primer fagositler tarafından nicel olarak ölçmek ve konidianın fagositozunu sadece aparatlardan lökositlere ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem sunmaktadır.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İnsan Lökositler tarafından Aspergillus fumigatus Conidia Fagositozunun ölçülmesi

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Bu protokol, insan lökositleri tarafından aspergillus fumigateurs Conidia etiketli fagositozisi, Conidia'nın hücrelere bağlanması ve akış sitometrisi ile etkileşim eksikliğini nicel olarak ölçteğin denli ölçülüdür. Bu yöntemin en büyük avantajı, çok sayıda hücrenin hızlı analizini kolaylaştırıyor olmasıdır. Buna ek olarak, hücre belirteçlerinin etiketlanması aynı örnek içinde nötrofiller ve monositlerin ayrı değerlendirilmesi sağlar.Herhangi bir teknik Mucorales gibi diğer klinik ilgili mantarlar analiz etmek için kullanılabilir. Bunun yerine kırmızı kan hücreleri fagosit olarak kullanılabilir. Bu prosedüre başlamak için, dezenfektan ile bir kağıt havlu ıslak ve bir biyo güvenlik kabine yerleştirin.Uçucu Conidia aşırı dağılımını önlemek için kağıt havlu üstüne yetiştirilen Aspergillus fumigatus bir tabak yerleştirin. Mantar Üstüne% 0.01 deterjan içeren PBS 10 mililitre ekleyin ve plaka üzerinde sıvı yaymak için bir Drigalski spatula kullanın ve koyu renkli Conidia ovmak. Conidia süspansiyonuna 30 mikrometrelik bir süzgeç le 50 mililitreye aktarın, bu da kalan miseli.Plakaya deterjan ile pbs başka bir 10 mililitre ekleyin, bir spatula ile yayıldı, ve süzgeç aracılığıyla aynı tüpe aktarın. Daha sonra PBS'de çözünmüş 0,1 molar sodyum karbonatiçeren steril bir çözelti hazırlayın. Ve bu sodyum karbonat çözeltisinde FITC tozundan 0.1 milimolar çözelti hazırlayın.15 mililitrelik bir tüpte, bu FITC çözeltisinin beş mililitresinde 100 milyon veya daha az Conidia'yı yeniden askıya alın. 37 derecede 20 dakika boyunca bir rotatörde kuluçkaya yat. Conidia'ya kadar şişmek için, %10 FCS ile desteklenen beş mililitre RPMI orta sında Conidia etiketli FITC'yi yeniden askıya alın.Ve istenilen süre boyunca 37 santigrat derecede bir rotatörde kuluçkaya yat. Bir biyo güvenlik kabininde, 50 mililitrelik bir tüp içine beş mililitre buffy ceket yerleştirin. Tüpü EL tamponuyla doldurun ve üç kez ters çevirin.Karışımın sütlü görünümü netleşene kadar, beş ila sekiz dakika boyunca yatay olarak kuluçkaya yatırın. Sonra, 300 kez G santrifüj ve 10 dakika oda sıcaklığında. Supernatant atın ve pipetting tarafından EL tampon bir mililitre pelet resuspend.24 mililitre daha EL tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin. Santrifüj 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika. Supernatant atın ve RPMI medya bir mililitre hücreleri resuspend, ile birlikte 10%FCS.Başlamak için, 1.5 mililitre RPMI içinde iki milyon lökosit ve dört milyon FITC etiketli Conidia transferi 10% FCS ile takviye, bir 12-iyi kültür plakası. Yalnızca Conidia içermeyen hücrelerin denetimini ve etiketlenmemiş Conidia'ya sahip hücrelerin denetimini ekleyin. Plakayı istenilen süre boyunca 37 derecede nemlendirilmiş karbondioksit kuvözde kuluçkaya yatırın.Kuluçka tamamlandığında, hücreleri hasat etmek için bir hücre kazıyıcı kullanın ve 15 mililitrelik bir tüp e aktarın. İlk olarak, her numunenin 100 mikrolitresini koyun ve kontrolleri 96 kuyulu V-alt plakanın bir kuyusu içine yerleştirin. Yıkama için iki milimolar EDTA içeren 150 mikrolitre PBS ekleyin.Renk telafisi için, her renk için Conidia olmadan bir milyon hücre yerleştirin, plaka diğer kuyularda. Eğitimsiz bırakılacak hücrelerin bir kuyu ekleyin. Yıkama için her kuyuya iki milimolar EDTA içeren 150 mikrolitre PBS ekleyin.Daha sonra, bir yapışkan folyo ile plaka kapağı ve santrifüj 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika. Sonra, folyo çıkarın ve hızlı ve zorla ya lavabo, ya da tek kullanımlık kağıt havlu üzerinde sadece bir kez ters plaka tarafından supernatant atın. Antikor karışımı 100 mikrolitre hücreleri resuspend ve pipetleme ile iyice karıştırın.Renk telafileri için, EDTA iki milimolar içeren PBS 100 mikrolitre ilgili hücreleri yeniden askıya, ve her kuyuiçin tek bir antikor türü ekleyin, antikor karışımı kullanılan aynı miktarda. Bir yapışkan folyo ile kaplayın ve 20 dakika boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçka. Bundan sonra, folyo çıkarın ve yıkama için her kuyuya iki milimolar EDTA içeren PBS 150 mikrolitre ekleyin.Plakayı tekrar yapışkan folyo ile kapatın. Santrifüj 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika. Sonra folyo çıkarın ve hızlı ve zorla bir lavabo veya tek kullanımlık kağıt havlu üzerinde plaka ters tarafından supernatant atın.2 milimolar EDTA içeren 200 mikrolitre PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu her kuyudan ayrı bir yuvarlak alt tüpe aktarın. Akış sitometresini çalıştırın ve ısınmasına izin verin. Satın alma yazılımında, yeni bir deneme oluşturun ve yeni örnekleri ayarlayın ve etiketleyin.Metin protokolünde belirtildiği gibi, uygun floroforlar için parametreleri ve dedektörleri ayarlayın. Bu yazılımda, metin protokolünde belirtildiği gibi uygun nokta çizimlerini görüntüleyin. Hücreleri kullanarak sadece örnek, bazı hücreleri elde ve lökositler etrafında kapı ayarlayın.Lökosit kapısına dayanarak, CD45 pozitif hücreler için kapı, SSC CD45 arsa Conidia ayırmak için. Bir nokta arsa, CD14, CD66b, kapı nötrofiller ve monositler ayrı ayrı. Bundan sonra, hücrelerden yalnızca örneklemden etiketlenmemiş Conidia'ya değiştirin.Bir nokta arsa, anti-FITC, APC FITC, anti-FITC için set quadrants görüntü nötrofiller ve FITC sinyalleri. İstatistik görünümünü açın ve q1, Q2 ve Q4 quadrants hücrelerinin maksimum% 1 izin, quadrants ayarlayın. Monosit kapısı için bu işlemi tekrarlayın. Lökosit kapısında, en az 20.000 etkinlikle tüm örnekleri kaydedin.İnsan nötrofiller tarafından FITC etiketli Conidia fagositoz istatistik görüşlerinden okunabilir. Bu çalışmada, aspergillus fumigateurs Conidia'nın çok sayıda birincil insan lökositile etkileşimini ölçmek için hızlı akış sitometrik yöntemi kullanılmıştır. FSC ve SSC özellikleri ile insan lökositlerinin genel bir gating, uygun antikorlar ve burada gösterilen gating stratejisi kullanılarak, pan lökosit marker, CD45 tarafından, serbest Conidia lökositlerin ayrılması takip eder.Conidia akış sitometri sırasında neredeyse hücre büyüklüğüne ulaşabilir, özellikle şişmiş Conidia kullanırken, ve ya da uzun kuluçka süreleri, ve böylece bize analiz satın alabilirsiniz. İnsan birincil monositler ve nötrofiller Conidia'yı farklı bir şekilde ele aldığından, bu protokol bu hücre popülasyonunun, köklü hücre soy işaretleri, monositler için CD14 ve nötrofiller için CD66b ile boyanmasına dayalı ayrı bir analize olanak sağlar. Konidia içselleştiren insan birincil fagosityüzdesi kan bağışçıları arasında son derece değişken olabilir, ama aynı zamanda deneysel faktörlere bağlıdır, kuluçka süresi ve Conidia şişme durumu gibi.Spor içselleştirme kooperatifin 0,5 saat sonra tespit edilebilir ve zamanla artar. Önceden şişmiş Conidia dinlenme sporları daha kolay alınır, kısa kuluçka zamanlarında bile. Conidia formaldehit ile sabit ise, fagositoksis yerli Conidia göre azalır.Bu prosedürü takiben, birlikte kuluçka bağışıklık hücreleri ve Conidia supernatants toplanabilir ve eliza tarafından etkileşim bağışıklık hücreleri tarafından bir sitokin salınımı ortaya çıkarmak olup olmadığını kontrol etmek için analiz. Lütfen unutmayın, insan kanı bulaşıcı hastalıklara bulaştırabilir. Bu çalışma Hepatit B genelinde aşı gerektirir, bir biyo güvenlik kabini kullanımı, yanı sıra bir laboratuvar önlüğü eldiven giyiyor.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Akış Sitometrisi ile A549 Hücreleri Eklenti ve içselleştirilmesi Gribi bir virüs Ölçme

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Cevabı İnsan İlköğretim nötrofiller ve monositler tarafından Antifungal Faaliyet Canlı Görüntüleme<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Hiv Hedeflerinin Antikorbağımlı Hücresel Fagositoz Sataşanında Kullanılmak Üzere İnsan Anne Sütünden Lökositlerin İzolasyon

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Akış Sitometrisinin Kullanılmasında Eritrosit Kompleman Reseptörü 1 Ölçümü

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...