Name: oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

ويدعم هذا المركز وزاره الاستخبارات والابتكار واليقع والمؤسسة المناصرة للمؤسسة الخيرية ، وهو أحد مراكز الامتياز في سيفيرو اوتشوا (سيف-2015-0505). ويدعمنا أيضا الصندوق الأوروبي للتنمية الاقليميه "Una manera de هاجر Europa". وتنوه جامعه كاليفورنيا بالدعم المقدم من الرابطة الايطاليه للبحث عن السرطان ، وجمعيه البحوث الدولية للسرطان (المعروفة الآن باسم بحوث السرطان في جميع انحاء العالم) ، ووزارة الصحة الايطاليه. وتقر تحكيم بان "مؤسسه بيانكا ديل مؤنتي دي لومباردي" لدعمها الجزئي لعمله مع الزمالة الكهروضوئية "Progetetetalita ايفانو Becchi" 2011-2012.

1. اعداد العينات
<ol><li>اليوم الأول البذور هيلا الخلايا في المتوسط الكامل في تركيز من 100000-200000 خليه/مل في الاطباق الزجاجية القاع. البذور 6-8 تكرار الاطباق. ملاحظه: في هذا المثال ، يتم تكمله المتوسطة مع 10 ٪ الحرارة الجنين البقري المنشط مصل (الجندي) ، 1 ملليمتر بيروفات الصوديوم ، 100 U/100 مي...

<ol>
	<li>Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+insights+into+gonadotropin+hormone+receptor+dimerization+and+oligomerization.">Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization.</a> Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).</li><li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited:+functional+and+pharmacological+perspectives.">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).</li><li>Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+receptor+oligomerization.">Muscarinic receptor oligomerization.</a> Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).</li><li>Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+Receptor+Signaling:+Impact+of+Receptor+Oligomerization+on+Receptor+Function.">Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).</li><li>Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+oligomerization:+functional+considerations.">Chemokine receptor oligomerization: functional considerations.</a> Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).</li><li>Van Craenenbroeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+oligomerization:+contribution+to+receptor+biogenesis.">GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis.</a> Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).</li><li>Wnorowski, A., Jozwiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-+and+hetero-oligomerization+of+beta2-adrenergic+receptor+in+receptor+trafficking,+signaling+pathways+and+receptor+pharmacology.">Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology.</a> Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).</li><li>Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+methods+to+study+membrane+receptor+oligomerization.">Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization.</a> Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).</li><li>Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+complementation+assays:+new+tools+to+study+G+protein-coupled+receptor+oligomerization+and+GPCR-mediated+signaling.">Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).</li><li>Trussell, H. J., et al., Trussell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Academic Press Library in Signal Processing. 4, 3-9 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+dendritic+spines+by+STED+microscopy.">Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).</li><li>Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+accurately+locate+and+count+large+numbers+of+steps+by+photobleaching.">A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).</li><li>Godin, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+protein+oligomerization+and+densities+in+situ+using+spatial+intensity+distribution+analysis.">Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).</li><li>Qian, H., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+molecular+aggregation+by+analysis+of+fluctuation+moments.">Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).</li><li>Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photon+counting+histogram+in+fluorescence+fluctuation+spectroscopy.">The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).</li><li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode.">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).</li><li>Unruh, J. R., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+concentration+and+brightness+from+fluorescence+fluctuation+data+with+an+electron+multiplied+CCD+camera.">Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera.</a> Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).</li><li>Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+chemical+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+review.">Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review.</a> Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).</li><li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy.">Fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li><li>Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+FCS,+a+novel+method+for+three-dimensional+particle+tracking.">Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking.</a> Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).</li><li>Hinde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+dynamics+of+the+oligomeric+transcription+factor+STAT3+by+pair+correlation+of+molecular+brightness.">Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness.</a> Nature Communications. 7, 11047 (2016).</li><li>Waithe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+processing+and+analysis+of+conventional+confocal+microscopy+generated+scanning+FCS+data.">Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data.</a> Methods. 140-141, 62-73 (2018).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Ossato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+path+to+inclusion+formation+of+huntingtin+peptides+revealed+by+number+and+brightness+analysis.">A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).</li><li>Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+resting+and+ligand-bound+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases+in+living+cells+using+number+and+brightness+analysis.">Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).</li><li>Ming, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Distribution+of+Klothobeta+(KLB)+and+fibroblast+growth+factor+receptor-1+(FGFR1)+in+living+cells+reveal+the+fibroblast+growth+factor-21+(FGF21)-induced+receptor+complex.">Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).</li><li>Ross, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+state+of+dynamin+2+in+cell+membranes+using+TIRF+and+number+and+brightness+analysis.">Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).</li><li>Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+brightness+image+analysis+reveals+ATF-induced+dimerization+kinetics+of+uPAR+in+the+cell+membrane.">Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane.</a> FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).</li><li>Zamai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+brightness+analysis+reveals+that+NCAM+and+FGF2+elicit+different+assembly+and+dynamics+of+FGFR1+in+live+cells.">Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells.</a> Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).</li><li>Hassler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+correlation+spectroscopy+(TIR-FCS)+with+low+background+and+high+count-rate+per+molecule.">Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule.</a> Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).</li><li>Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fast+fluorescence+imaging+to+molecular+diffusion+law+on+live+cell+membranes+in+a+commercial+microscope.">From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).</li><li>Beenken, A., Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FGF+family:+biology,+pathophysiology+and+therapy.">The FGF family: biology, pathophysiology and therapy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).</li><li>Joubert, J., Sharma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+digital+imaging.">Light microscopy digital imaging.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2011).</li><li>Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIRF+microscopy+evanescent+field+calibration+using+tilted+fluorescent+microtubules.">TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules.</a> Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).</li><li>Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+incidence+angle+for+through-the-objective+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).</li><li>Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+limits+and+data+correction+in+number+of+molecules+and+brightness+analysis.">Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis.</a> Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).</li><li>Caiolfa, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomer-dimer+dynamics+and+distribution+of+GPI-anchored+uPAR+are+determined+by+cell+surface+protein+assemblies.">Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies.</a> Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).</li><li>Campbell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+red+fluorescent+protein.">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).</li><li>Cutrale, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+enhanced+number+and+brightness+to+measure+protein+oligomerization+dynamics+in+live+cells.">Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells.</a> Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).</li><li>Dunsing, V., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence+Fluctuation+Spectroscopy+Assay+of+Protein-Protein+Interactions+at+Cell-Cell+Contacts.">A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li></ol>

N & B يتطلب العديد من الاحتياطات في اختيار نموذج الخلية واستراتيجية وضع العلامات. ويمكن تطبيقه فقط علي الخلايا الحية التي لا تزال ملتزمه بثبات خلال وقت التقاط الصورة. ويمكن التعامل مع التقلبات الاضافيه الناجمة عن النزوح الجامد للخلية بأكملها مع نهج استعاده الصورة المناسبة38. و?...

ونحن وصف إجمالي انعكاس الداخلية الفلورية-عدد والسطوع (TIRF-N & B) نهج التصوير لتحديد متوسط الدولة القلة من جزيئات مستقبلات في غشاء البلازما من الخلايا الحية ، وتهدف إلى ربط التجمع مستقبلات ديناميات الوظيفة البيولوجية للبروتينات (الشكل 1).
عند الربط خارج الخلية وملزمه ، والمستقبلات بدء محول الاشاره داخل الخلايا اعتمادا علي التشكيل الخاصة بهم ، والقلة ، والمستقبلات المشتركة المحتملة وتكوين الغشاء. علي الرغم من اهميه وانتشار القلة المستقبلة ، المعترف بها كحدث رئيسي في الإشارات الخلوية1،2،3،4،5،6، 7, طرق قليله يمكن الكشف عن تجمع الاحداث وقياس درجه التجميع تجريبيا8,9. وحده التخزين البؤري (x ، y ≈ 300 nm ، z ≈ 900 nm) غير محلول بشكل كاف لإثبات التفاعل الجزيئي والقياس ، حتى بعد التحسين بواسطة خوارزميات استعاده الصورة10. لا يمكن حل تكوين الوحدة الفرعية من قله البروتين علي أساس المكانية بحته حتى من خلال أساليب فائقه الدقة في x, y القرار من 20-70 nm مثل النخيل11, العاصفة12, وتيد13. وعلاوة علي ذلك ، فان الدقة الزمنيه (بترتيب الدقائق لكل صوره) لا يمكن ان تتبع الحركية في نطاق الثواني. جزيء واحد خطوه التبييض علي حل القياس من قله البروتين فقط إذا كانت غير المتنقلة14.
واحده من الطرق الأكثر تنوعا لقياس الكثافة وقله الفلوريسسينتلي من البروتينات الموسومة داخل صور واحده هو تحليل توزيع كثافة المكانية (SpIDA) ، والتي تعتمد علي أخذ العينات المكانية. وهو ينطبق علي كل من الخلايا الثابتة كيميائيا والحية ، ويسمح تحليل العديد من المناطق التي تهم الخلية في وقت واحد باستخدام المجهر القياسية الفلورية15. بدلا من ذلك ، وأساليب لحظه ، مثل الطيفية الارتباط فلوري (FCS)16، المدرج التكراري العد الفوتون (pch)17، وعدد والسطوع (N & B) 18،19، هي مناسبه لقلهالسنالكمية القياسات. وتحلل هذه الطرق تقلبات الكثافة الفلورية التي يمكن ملاحظتها في الوقت الذي ينتشر فيه الفلوريد ويخرج من حجم الاضاءه. الاتساع من التقلبات شده يستطيع كنت بشكل فريد وصفت بالسطوع جزيئيه من ال [فلوفيبور] (ε) والرقم معدله [فلوبفرس] (ن) ضمن الاناره حجم17 (شكل 2). عاده ، يمكن الحصول علي معامل انتشار الفلوروبيورس ومتوسط عدد الجزيئات (المرتبطة عكسيا بقيمه G (0)) داخل حجم الاضاءه بواسطة FCS20. ومع ذلك ، منذ نشر الوقت فقط الجداول مع جذر مكعب من كتله ، FCS ليست حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن التغيرات في الكتلة الجزيئية21. في الممارسة العملية ، لا يمكن الكشف عن اللون واحد FCS ديميريشن من مستقبلات الغشاء. PCH يحل مخاليط من قله المواليد المختلفة بدقه. باستخدام أكثر من لحظتين من توزيع السعه ، يكتشف جزيئات السطوع المختلفة التي تشغل نفس حجم الاضاءه. المسح الضوئي FCS22 والتطورات ، مثل الزوج مثيره للاهتمام-ارتباط السطوع الجزيئي (pcomb) النهج23، وعرضت لتوسيع نطاق تطبيق أساليب الارتباط فلوري في النظم البيولوجية24 ، تبقي الطرق نقطه واحده تفتقر إلى القدرة علي القياسات السريعة في مساحة كبيره من الخلية ، والتي تتطلب العديد من الملاحظات المتتابعة في كل بكسل والحصول علي البيانات في ترتيب الثواني.
N & B هو نسخه مبسطه من pch التي تعتبر فقط اللحظات الاولي والثانية من سعة التوزيع الفلوري ، وهي متوسط الكثافة ، ، والفرق ، σ2 (الشكل 2)18،19 وبسبب ذلك ، فانه لا يمكن تحديد الجزء المولي من القلة غير المعروفة في خليط ، ولكن فقط تقديرات الدولة المعتدلة القلة من الخليط. ومع ذلك ، N & B لديه ميزه العمل مع سلسله زمنيه أصغر نسبيا من الصور من الخلايا الحية من PCH علي أساس بكسل بكسل ، وذلك ببساطه عن طريق رصد التقلبات في الوقت المناسب من كثافة مضان. لان N & B يقلل من الوقت لكل بكسل إلى بضع ميكروثانية ، فانه يمكن ان تتبع حركيه القلة السريعة علي مناطق الخلايا الكبيرة ، مما يسمح اكتساب الصورة علي مقياس الوقت من الثواني في المسح الضوئي المجهر (علي سبيل المثال ، التنسيق ، 2-الفوتون) ومللي ثانيه في المجهر القائم علي الكاميرا (علي سبيل المثال ، TIRFM).
وقد أظهرت عده تقارير قدره N & B علي قياس عدد الوحدات الفرعية في مجموعات البروتين عن طريق تصوير مناطق الخلايا الموسعة. تم الكشف عن مجموعات باكيلين-EGFP في مواقع التصاق في الخلايا تشو-K125، وتم وصف التجميع داخل الخلايا من الببتيد Httex1p المسببة للامراض في الخلايا كوس-726. وقد تم تطبيق N & B لاتباع القلة التي يحركها الأمر من مستقبلات erbb27، وتاثير يجند علي كلوثوب (klb) و FGFR1c في الخلايا هيلا28. تم استخدام الجمع بين التصوير TIRF وتحليل N & B لإظهار ان دينامين-2 هو رباعيه في المقام الأول في جميع انحاء الغشاء الخلوي بأكمله29. قمنا بتطبيق N & B لكل من المسح النقطي والصور tirf لإثبات ديميريشن الموجهة من upar ومستقبلات غشاء الخلية FGFR130,31.
طرق الارتباط الفلورية ، مثل N & B ، FCS و PCH ، وتستند إلى فكره انه في حجم مفتوح الاحتلال عدد من الجزيئات يتبع توزيع Poisson. لأنه فقط الفوتونات التي تنبعث منها الفلوروبيورس يمكن الكشف عنها ، والقيمة المتوسطة لكثافة مضان قياس <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> </img>مقابل الوقت في بكسل من الصورة ، ، هو نتاج متوسط عدد الفلوبورس في حجم الاضاءه ، ن ، وبهم السطوع الجزيئي ، ε17:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
حيث يتم التعبير عن ε كعدد من الفوتونات المنبعثة لكل وحده من الوقت (تقليديا في الثانية) لكل جزيء عندما يكون الجزيء في مركز حجم الاضاءه.
السطوع هو خاصيه لكل فلوكوفيري في عمليه استحواذ معينه ، في حين ان الكثافة هي مجموع جميع المساهمات من جميع الفلوبورس. في المسابقات البيولوجية ، سيزداد السطوع مع زيادة عدد الفلوريد الذي يتقلب معا ، مما يعطي معلومات عن حاله قله الفلوريسسينتلي من البروتين الموسوم. يتم قياس سعة التذبذب في بكسل معينه من التباين في اشاره مضان ، σ2:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
حيث المتوسطة من المربع الشدة <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> </img>,, والمربع من المدى الشدة <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> </img>,, يحسب من الفردية كثافة قيم في كل [بكسل] من كل اطار:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
حيث K هو عدد الإطارات الاجماليه في سلسله الوقت. من الناحية التجريبية ، فمن الضروري حساب لسلسله الصورة بأكملها الفرق الذي يصف مبعثر قيم كثافة الفردية في كل بكسل من صوره واحده حول قيمه كثافة متوسط. ويشمل الفرق جميع التقلبات من أصول مختلفه. في تقريب اولي, التباين واجبه ال ينتشر جسيمات في الاناره حجم, σ20, يستطيع كنت فصلت من التباين واجبه إلى الكاشف طلقه خردق ضوضاء, σ2[د.]. والفرق بينهما مستقل ؛ التالي ، يتم إعطاء الفرق الإجمالي من خلال المبلغ الخاص بهم:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
الفرق ، بسبب التقلبات الجزيئية داخل وخارج حجم الكشف ، يعتمد خطيا علي السطوع الجزيئي وكثافة:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
أعاده ترتيب المكافئ 6 وفقا لمكافئ 1:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
وفقا للمفهوم النموذجي في الطيفي الترابط الفلوري ، المعادلة 7 تنص علي ان الفرق بسبب عدد من التقلبات يعتمد علي مربع من سطوع الجسيمات.
ثم, الفرق بسبب تقلبات كاشف هو وظيفة خطيه من كثافة الكشف, تحت افتراض ان يتم تشغيل كاشف تحت الحد التشبع19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
في حاله الفوتون العد كاشفات a= 1 و c= 0 ، التالي فان الفرق كاشف يساوي متوسط كثافة:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
لتطبيق هذه المفاهيم علي القياسات الحقيقية في الخلايا الحية ، Gratton وزملاءه18 تحديد سطوع واضح ، B ، لكل بكسل كنسبه الفرق علي مدي كثافة متوسط:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B هي المعلمة التي تقاس بالتجربة. في هذا العمل ، يتم التقاط صور السلسلة الزمنيه لمستقبلات FGFR1 في غشاء البلازما من الخلايا هيلا من قبل المجهر TIRF ومتوسط سطوع واضح ، B ، يتم تحديده من قبل تحليل N & B. بعد ذلك ، بعد أضافه FGF2 ، يتم التقاط سلسله زمنيه متتالية لمتابعه التغييرات في التجميع الذاتي لجزيئات المستقبلات في سطح الغشاء بعد تحفيز المستقبلات مع ligand المتعارف عليه.
ومع ذلك ، منذ كاشف المجهر TIRF هو كاميرا EMCCD ، والتعبير عن سطوع واضح يحتاج إلى تعديل كما19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
حيث أزاحه هو أزاحه كثافة الكترونيات الكشف التي هي سمه من سمات إعدادات كاشف. يتم إعطاء الفرق ومتوسط كثافة للكشف التناظرية علي التوالي من قبل:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
حيث G هو كسب التناظرية في المستويات الرقمية (DL/الفوتونات) ، S، والمستويات الرقمية لكل فوتون19، وتعطي من قبل منحدر كثافة مقابل مؤامرة الفرق لمصدر الضوء مع كثافة ثابته (اي تقلبات الزمنيه). يرتبط عامل γ بشكل وحده تخزين الكشف عن البكسل. وفقا ل Hassler وآخرون32، عامل γ يساوي 0.3 للتصوير tirf العمل في الكسب الأقصى من الكاميرا الكشف19. الازاحه ، S و G المعلمات هي خصائص الكاميرا والمجهر. السطوع الظاهر ، B ، يتم الحصول عليه عن طريق أعاده ترتيب المكافئ 11 وفقا لمكافئ 12 و 13:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
تجريبيا ، ε هو وظيفة معقده من كثافة الليزر وكفاءه الكشف عن النظام. ومع ذلك ، بما ان B/S يعتمد خطيا علي ε ، فمن المهم تحديد القيمة النسبية لε لوضع الكشف المعطي:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
حيث ε ' يتناسب مع الε. ومع ذلك ، يتم اجراء المعايرة باستخدام مرجع داخلي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum 98% minimun</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>21063029</td>
			<td>Used serum free for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high-glucose GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>Used for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0515-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitting system Photometrics DV2</td>
			<td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td>10% inactivated supplement for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes</td>
			<td>MatTek, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>uncoated, glass thickness 0.17 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells</td>
			<td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CB_08011102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software</td>
			<td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td>
			<td></td>
			<td>This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&#38;B time series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Executable N&#38;B routine</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab v.2018b</td>
			<td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x</td>
			<td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td>
			<td>LONZA 17-602E</td>
			<td>supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100&#181;g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector</td>
			<td>Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td>Zamai et al., 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGF2</td>
			<td>PeproTech EC, Ltd., London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate GIBCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>1mM supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIt-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid 10 mL</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513 859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM2618</td>
			<td>0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis

علي الرغم من اهميه وانتشار القلة المستقبلة ، فان بعض الطرق قابله للتطبيق للكشف عن احداث التجميع وقياس درجه التجميع. هنا ، ونحن وصف نهج التصوير لتحديد الدولة المعتدلة القلة من mEGFP-الموسومة-مستقبلات المتجانسات في غشاء الخلايا الحية. يعتمد البروتوكول علي المجهر الداخلي للانعكاس الكلي (TIRF) المدمج مع تحليل العدد والسطوع (N & B). N & B هو أسلوب مشابه للتحليل الطيفي للعلاقة الفلورية (FCS) والرسم البياني للعد الفوتون (PCH) ، والتي تستند إلى التحليل الإحصائي للتقلبات في كثافة الفلورية من الفلورية التي تنشر داخل وخارج الاضاءه حجم خلال فتره المراقبة. علي وجه الخصوص ، N & B هو تبسيط PCH للحصول علي معلومات عن متوسط عدد البروتينات في مخاليط القلة. وتوصف شده تذبذب الكثافة بالسطوع الجزيئي للفلوكوفيري ومتوسط عدد الفلوبوهورس داخل حجم الاضاءه. التالي ، لا يعتبر N & B سوي اللحظتين الاولي والثانية من توزيع السعه ، وهما متوسط الكثافة والتباين. هذا هو ، في الوقت نفسه ، وقوه وضعف الأسلوب. لأنه يتم النظر في لحظات فقط ، N & B لا يمكن تحديد الجزء المولي من القلة غير المعروفة في خليط ، ولكنه فقط يقدر متوسط حاله قله العدد من الخليط. ومع ذلك ، فانه يمكن تطبيقها علي سلسله زمنيه صغيره نسبيا (بالمقارنة مع أساليب لحظه أخرى) من الصور من الخلايا الحية علي أساس بكسل بكسل ، وذلك ببساطه عن طريق رصد تقلبات الوقت من كثافة مضان. فانه يقلل من الوقت الفعلي لكل بكسل إلى بضعة ميكروثانية ، مما يسمح الاستحواذ في النطاق الزمني من ثوان إلى مللي ثانيه ، وهو أمر ضروري لحركيه القلة السريعة. وأخيرا ، يمكن استكشاف مناطق الخلايا الكبيرة وكذلك المقصورات شبه الخلوية.

النتائج لاثنين من الخلايا الممثلة هيلا-mEGFP-FGFR1 المصنفة في نفس الطبق الثقافة وترد في الشكل 5 والجدول التكميلي 1. تم القبض علي الخليتين في وقت 0 دقيقه (الشكل 5a، اعلي) و 7 دقيقه (الشكل 5a، أسفل) بعد أضافه ...

Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

ونحن وصف نهج التصوير لتحديد الدولة المعتدلة القلة من الأقليات megfp-الموسومة-مستقبلات التي يسببها يجند ملزمه في غشاء البلازما من الخلايا الحية. يعتمد البروتوكول علي المجهر الداخلي للانعكاس الكلي (TIRF) المدمج مع تحليل العدد والسطوع (N & B).

ديناميات القلة من مستقبلات سطح الخلية في الخلايا الحية من قبل المجهر الداخلي الكلي انعكاس الشامل مع عدد وتحليل السطوع

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

مستقبلات التجمع في كل مكان وغالبا ما تكون ضرورية للإشارة إلى التوازية التنشيط. ومع ذلك، هناك عدد قليل من الطرق المتاحة لقياس درجة التجمع. نحن نستخدم الانعكاس الداخلي الكلي، المجهر TIRF، لمتابعة انتشار جزيئات FGFR1-mEGFP في غشاء البلازما للخلايا الحية.ثم نحن تطبيق سطوع عدد، وتحليل N & B، لوصف ديناميات مجمعات مستقبلات حفز. TIRF مثالية للتصوير الصدغي السريع للأحداث الجزيئية التي تحدث بالقرب من سطح الخلية، في حين أن N&B يحدد متوسط حالة القلة من جزيئات الفلورسنت على أساس انتشار داخل وخارج حجم الإضاءة من المجهر. في الواقع، هذا هو أداة لربط التنظيم الزماني المكاني للمستقبلات في سطح الخلية حيث أنها تشير.تحتاج N&B فقط إلى الوصول إلى المجهر مع وحدة اقتناء سريعة. يمكنك تحليل مساحة كبيرة من الخلايا الحية وجود مجرد معرفة أساسية من أساليب التقلبات الفلورية. يمكن تطبيق هذه الطريقة على البروتينات التي تشكل الخافتات أو المجموعات ويمكن أن تكون ذات تسمية رصينة مع صبغة الفلورسنت.إذا كانت البروتينات في مقصورات داخل الخلايا، يتم استخدام أنواع أخرى من المجاهر للحصول على الصور. من المهم إعداد بناء يعبر عن شكل أحادية اللون من الفلوروفور لقياس السطوع أحادية اللون النقية تحت الظروف التجريبية كتحكم. في اليوم الأول، بذور خلايا HeLa في 1.5 ملليلتر من المتوسط الكامل بتركيز من 100، 000 إلى 200، 000 خلية لكل ملليلتر في أطباق الزجاج القاع.بذور ستة إلى ثمانية أطباق تكرار، واحتضان في حاضنة في 37 درجة مئوية. في اليوم الثاني أو الثالث، وصلت الخلايا إلى التوافق الفرعي. إضافة المصل خالية من المتوسطة مع البروتين plasmid إلى نصف الأطباق، وإضافة plasmids المرجعية مع مونومر وأدم إلى النصف الثاني من الأطباق إلى نقل الخلايا.بعد يوم واحد ، تحقق من أن الخلايا المصابة بالعدوى هي التي تلتهم الجزء السفلي من الأطباق وغشاء الخلية هو الفلورسنت. تخلص من الأطباق مع الخلايا المتضخمة أو مع الفلورس المنخفض جدا. قبل أربع ساعات من التجربة، قم بتنشيط حاضنة درجة الحرارة للمجهر عند 37 درجة مئوية.بدوره على المجهر، وأجهزة الكمبيوتر، والكاميرات، وانتظر الكاميرات للوصول إلى درجة حرارة العمل المناسبة من ناقص 75 درجة مئوية. وضع قطرة صغيرة من النفط على العدسة الهدف. وضع طبق عينة في حاضنة المجهر، وإغلاق أبواب الحاضنة للسماح لدرجة حرارة الطبق توازن لمدة 10 دقائق.قم بتشغيل مصباح epifluorescence ويزر 488 نانومتر. حدد وضع تباين epifluorescence لاستكشاف العينة، والبحث خلية للتركيز من عدسة العين. حدد مرشح المناسبة لجمع الانبعاثات الخضراء من خلال الكاميرا المجهر مع شريط 490/20 500 و bandpass إم 525/50 أو ما شابه ذلك.التبديل من العين إلى تقرير كام في وضع epifluorescence. قم بصقل التركيز، ثم قم بتغيير وضع TIRF. ثم قم بتنشيط المحاذاة التلقائية باتباع تعليمات مجهر TIRF.اختيار عمق الإضاءة المناسبة، وتحسين اتجاه الحقل الواح. التبديل إلى كاميرا ثانية. تعريف منطقة ذات أهمية لا تقل عن 256 في 256 بكسل.تعيين التعرض إلى ميلي ثانية واحدة وم م gain إلى 1,000. اضبط طاقة الليزر إلى 0.5 مللي واط. من الضروري الحصول على بعض المعلومات حول معامل انتشار البروتين لأن وقت التعرض يجب أن يكون أقصر من متوسط الوقت الذي تقضيه جزيئات الفلورسنت في الحجم المُحَمّم.تشغيل تسلسل تجريبي الأول في ظل الظروف الأولية، وتقدير قيمة إشارة إلى ضوضاء تقريبًا. الشروط مقبولة في إشارة إلى ضوضاء يساوي 2-3 أو أعلى كما يقاس في سلسلة المرة الأولى. ثم استخدم شريط التمرير لنظام تقسيم الانبعاثات الذي يربط الكاميرا رقم اثنين بالمجهر لإخفاء جانب من الصورة.حدد خيار الحفظ التلقائي لملف الكاميرا. ابدأ عملية الحصول على سلسلة الصور لما لا يقل عن 700 إطار بنسبة إشارة إلى ضوضاء أدنى من اثنين. دون أخذ الطبق من المجهر، إضافة ليغاند.حدد خلية ذات غشاء مضيء، ثم ابدأ بسرعة السلسلة الأولى من الركض الحركي. البحث في الخلية الثانية ، والحصول على نقطة الوقت الثاني من الحركية. التقاط خلية جديدة لكل نقطة وقت من تشغيل الحركية.لكل طبق جديد، كرر محاذاة خط الليزر وتحسين الإضاءة TIRF. الآن تحويل وحفظ ملفات الصور المكتسبة مع برنامج الكاميرا كملفات tif. استيراد ملفات tif في روتين برنامج التحليل عن طريق تنشيط المستخدم الرسومية N & B MATLAB.تجاهل سلسلة التي يظهر متوسط كثافة الملف الشخصي أكثر من 10٪ photobleaching وسلسلة التي كان هناك تشويه غشاء الخلية واضحة أو الترجمة أثناء الاستحواذ. اقتصاص الإطارات التي من الواضح أن من التركيز. احتفظ للتحليل فقط مع سلسلة 500 الأطر الزمنية على الأقل.أولا تحديد المعلمات الكاميرا. قم بتنشيط كاميرا المعايرة الروتينية. حدد مساحة لا تقل عن 20 في 50 بكسل في منطقة ضوضاء الكاشف.في وتيرة السجل مقابل الرسم الرقمي، حرك المؤشر الأحمر الخطي لتحديد الغاوسي في الجزء الخطي من المنحنى. تنشيط المفتاح B. تطبيق الحد الأدنى من binning 2.2 للحد من تشتت البيانات وتوليد الرسم البياني B-I.استخدم مؤشر مربع التكرار لفحص الرسم البياني B-I. حدد عائد استثمار مربع للتحليل، ثم قم بإنشاء خريطة B الخاصة بعائد الاستثمار المحدد. ثم احفظ ملف ASCII قيم B المقترنة التحديد.استيراد ASCII في برنامج رسومات لحساب توزيع التردد من البيانات والحصول على متوسط B-قيمة زائد أو ناقص S.E.Apply معادلة إبسيلون لاشتقاق متوسط سطوع لكل خلية في كل نقطة وقت من تشغيل الحركية. تطبيع البيانات وفقا لمعادلة التطبيع، حيث B't هو متوسط B-القيمة تقاس في الوقت t بعد إضافة ليغاند وB'0 هو متوسط B-القيمة التي تقاس في الوقت ر يساوي صفر، وهو 10 إلى 20 ثانية بعد ليجوند additino. رسم متوسط السطوع العادي مقابل وقت الاستحواذ لبناء تشغيل الحركية.في هذه الدراسة، تظهر هنا نتائج تمثيلية من خليتين HeLa اثنين في نفس الطبق تعبر عن mEGFP-FGR1 تم التقاطها في وقت صفر وسبعة، بعد إضافة 20 نانوغرام لكل ملليلتر من FGF2. مقارنة مع الانشاءات المرجعية، و GPI-mEGFP و GPI-mEGFP-mEGFP- mEGFP، يظهر تسلسل التحليل بأكمله متوسط كثافة السلسلة الزمنية. مؤامرة من جميع القيم B.B-I الرسم البياني. B-خريطة من العائد على الاستثمار المختار. و الرسم البياني المرتبط بتوزيع B.بعد التحفيز مع 20 نانوغرام لكل ملليلتر من FGF2، يدير الحركية التمثيلية التي تبين متوسط السطوع كدالة الزمن يصف عملية بطيئة من التملم التي تستمر لعدة دقائق في سطح الخلية. عندما حفزت مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من NCAM-Fc، يكشف التشكيل الجانبي الحركي التحولات السريعة وال دورية من المستقبلات في الخلائط القلوية، والتي تصل أيضا إلى قيم السطوع فوق أن من الديم. لوحظت قيمة متوسط تطبيع من ثلاثة بشكل متكرر.من المهم تقليل المتغيرات الإضافية بسبب عدم وجود تقلبات جزيئية وتبييض. ويجب أن تكون الخلايا ملتصقة جيدا طبق القاع الزجاجي، وليس متضخمة، وليس مكدسة. إذا كنا مهتمين بالبروتين الذي ينتشر بشكل أسرع داخل المقصورات داخل الخلايا ، يمكننا تطبيق أوقات الصفر الأسرع واستخدام المسح الضوئي على المجاهر البؤرية أو متعددة الصور على الصورة داخل الخلية.مع نهجنا ، ونحن تقليل الآثار الضارة للphotobleaching عندما نريد لاستكشاف ديناميات الأحداث مثل التمدن. هذه الأحداث السيطرة على مجموعة متنوعة من الردود الخلوية ويصعب جدا إثبات في الخلايا الحية مع تقنيات أخرى.

Research

JoVE Journal

Biology

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

التصوير مضان مع نانومتر دقة واحدة (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

تحليل الالتهام الذاتي في<em&gt; البنسليوم العسجدية</em&gt; باستخدام التجويع وسادات في تركيبة مع المجهر مضان

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

التصوير في الوقت الحقيقي من النبات خلية سطح حيوية مع زاوية المتغير المجهر epifluorescence

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

المجهر الضوئي ورقة الإسفار من جذور النباتات التي تنمو على سطح الأرض من هلام

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

فحص الديناميات النووية الخميرة الانشطارية الميتومية وMeiotic عن طريق الفلورة الخلية الحية المجهرية

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...