Name: oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

CNIC støttes af Ministeriet for Ciencia, Innovacion y Universidades og Pro CNIC Foundation, og er et Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Vi støttes også af den europæiske fond for regional udvikling (FEDER) "UNA Manera de hacer Europa". UC anerkender støtten fra Associazione Italiana Ricerca Sul Cancro, foreningen for international Cancer Research (nu kendt som Worldwide Cancer Research) og det italienske sundhedsministerium. A.T. anerkender "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" for delvist at støtte hans arbejde med PV Fellowship "Progetto Professionkend Ivano Becchi" 2011-2012.

1. forberedelse af prøver
<ol><li>Dag 1. Frø HeLa celler i komplet medium i en koncentration på 100000-200000 celle/mL i glas-bund retter. Seed 6-8 replikater retter. Bemærk: I dette eksempel suppleres mediet med 10% varme inaktiveret føtal bovint serum (FBS), 1 mM natrium pyruvat, 100 U/100 μg penicillin/streptomycin. Flere replikater retter er tilberedt.</li>
	<li>Dag 2-3. Når cellerne er ved sub-confluency, transficere halvdelen af retterne med protein plasmid og anden halvdel med referenc...

<ol>
	<li>Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+insights+into+gonadotropin+hormone+receptor+dimerization+and+oligomerization.">Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization.</a> Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).</li><li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited:+functional+and+pharmacological+perspectives.">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).</li><li>Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+receptor+oligomerization.">Muscarinic receptor oligomerization.</a> Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).</li><li>Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+Receptor+Signaling:+Impact+of+Receptor+Oligomerization+on+Receptor+Function.">Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).</li><li>Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+oligomerization:+functional+considerations.">Chemokine receptor oligomerization: functional considerations.</a> Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).</li><li>Van Craenenbroeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+oligomerization:+contribution+to+receptor+biogenesis.">GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis.</a> Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).</li><li>Wnorowski, A., Jozwiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-+and+hetero-oligomerization+of+beta2-adrenergic+receptor+in+receptor+trafficking,+signaling+pathways+and+receptor+pharmacology.">Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology.</a> Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).</li><li>Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+methods+to+study+membrane+receptor+oligomerization.">Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization.</a> Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).</li><li>Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+complementation+assays:+new+tools+to+study+G+protein-coupled+receptor+oligomerization+and+GPCR-mediated+signaling.">Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).</li><li>Trussell, H. J., et al., Trussell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Academic Press Library in Signal Processing. 4, 3-9 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+dendritic+spines+by+STED+microscopy.">Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).</li><li>Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+accurately+locate+and+count+large+numbers+of+steps+by+photobleaching.">A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).</li><li>Godin, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+protein+oligomerization+and+densities+in+situ+using+spatial+intensity+distribution+analysis.">Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).</li><li>Qian, H., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+molecular+aggregation+by+analysis+of+fluctuation+moments.">Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).</li><li>Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photon+counting+histogram+in+fluorescence+fluctuation+spectroscopy.">The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).</li><li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode.">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).</li><li>Unruh, J. R., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+concentration+and+brightness+from+fluorescence+fluctuation+data+with+an+electron+multiplied+CCD+camera.">Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera.</a> Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).</li><li>Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+chemical+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+review.">Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review.</a> Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).</li><li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy.">Fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li><li>Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+FCS,+a+novel+method+for+three-dimensional+particle+tracking.">Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking.</a> Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).</li><li>Hinde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+dynamics+of+the+oligomeric+transcription+factor+STAT3+by+pair+correlation+of+molecular+brightness.">Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness.</a> Nature Communications. 7, 11047 (2016).</li><li>Waithe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+processing+and+analysis+of+conventional+confocal+microscopy+generated+scanning+FCS+data.">Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data.</a> Methods. 140-141, 62-73 (2018).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Ossato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+path+to+inclusion+formation+of+huntingtin+peptides+revealed+by+number+and+brightness+analysis.">A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).</li><li>Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+resting+and+ligand-bound+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases+in+living+cells+using+number+and+brightness+analysis.">Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).</li><li>Ming, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Distribution+of+Klothobeta+(KLB)+and+fibroblast+growth+factor+receptor-1+(FGFR1)+in+living+cells+reveal+the+fibroblast+growth+factor-21+(FGF21)-induced+receptor+complex.">Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).</li><li>Ross, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+state+of+dynamin+2+in+cell+membranes+using+TIRF+and+number+and+brightness+analysis.">Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).</li><li>Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+brightness+image+analysis+reveals+ATF-induced+dimerization+kinetics+of+uPAR+in+the+cell+membrane.">Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane.</a> FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).</li><li>Zamai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+brightness+analysis+reveals+that+NCAM+and+FGF2+elicit+different+assembly+and+dynamics+of+FGFR1+in+live+cells.">Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells.</a> Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).</li><li>Hassler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+correlation+spectroscopy+(TIR-FCS)+with+low+background+and+high+count-rate+per+molecule.">Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule.</a> Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).</li><li>Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fast+fluorescence+imaging+to+molecular+diffusion+law+on+live+cell+membranes+in+a+commercial+microscope.">From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).</li><li>Beenken, A., Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FGF+family:+biology,+pathophysiology+and+therapy.">The FGF family: biology, pathophysiology and therapy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).</li><li>Joubert, J., Sharma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+digital+imaging.">Light microscopy digital imaging.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2011).</li><li>Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIRF+microscopy+evanescent+field+calibration+using+tilted+fluorescent+microtubules.">TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules.</a> Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).</li><li>Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+incidence+angle+for+through-the-objective+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).</li><li>Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+limits+and+data+correction+in+number+of+molecules+and+brightness+analysis.">Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis.</a> Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).</li><li>Caiolfa, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomer-dimer+dynamics+and+distribution+of+GPI-anchored+uPAR+are+determined+by+cell+surface+protein+assemblies.">Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies.</a> Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).</li><li>Campbell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+red+fluorescent+protein.">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).</li><li>Cutrale, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+enhanced+number+and+brightness+to+measure+protein+oligomerization+dynamics+in+live+cells.">Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells.</a> Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).</li><li>Dunsing, V., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence+Fluctuation+Spectroscopy+Assay+of+Protein-Protein+Interactions+at+Cell-Cell+Contacts.">A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li></ol>

N & B kræver flere forsigtighedsregler i valget af celle model og mærknings strategi. Den kan kun anvendes på levende celler, der forbliver stabilt overholdt under billed optagelsestiden. Ekstra udsving på grund af hele cellens stive forskydning kan håndteres med passende billede restaurering tilgange38. Men generelt, når en celle bevæger sig, cellemembranen også deforme, og struktur deformation, producerer store ekstra varians, introducerer alvorlig begrænsning til analyse af membran pro...

Vi beskriver en samlet intern refleksion fluorescens-antal og lysstyrke (TIRF-N & B) Imaging tilgang til bestemmelse af den gennemsnitlige oligomeriske tilstand af receptor molekyler i plasma membranen af levende celler, sigter mod at forbinde receptoren forsamling dynamik til proteinerne biologiske funktion (figur 1).
Ved ekstracellulær ligand binding initierer receptorer det intracellulære signal transduktion afhængigt af deres kropsbygning, oligomerisering, potentielle Co-receptorer og membran sammensætning. På trods af betydningen og allesteds nærende receptor oligomerisering, anerkendt som en vigtig begivenhed i cellulære signalering1,2,3,4,5,6, 7, få metoder kan detektere klyngedannelse begivenheder og måle graden af klyngedannelse eksperimentelt8,9. Den confokale volumen (x, y ≈ 300 Nm, z ≈ 900 nm) er utilstrækkeligt løst til at bevise molekylære interaktion og støkiometri, selv efter optimering af billedet restaurering algoritmer10. Under enheds sammensætningen af protein oligomerer kan ikke løses på et rent geografisk grundlag, selv ved super opløsnings metoder ved x, y-opløsning på 20-70 nm såsom PALM11, storm12og sted13. Desuden kan deres tidsmæssige opløsning (i rækkefølgen af minutter pr. billede) ikke følge kinetikken i intervallet fra sekunder. Enkelt molekyle Step-blegning løser kun støkiometri af protein oligomerer, hvis de er immobile14.
En af de mest alsidige metoder til at måle tæthed og oligomerisering af fluorescently mærkede proteiner inden for enkeltbilleder er den rumlige intensitets fordelings analyse (SpIDA), som er afhængig af rumlig prøvetagning. Det gælder både kemisk faste og levende celler, og gør det muligt at analysere flere områder af interesse for cellen samtidig ved hjælp af standard Fluorescens mikroskopi15. Alternativt, moment metoder, såsom fluorescens-korrelations spektroskopi (FCS)16, photon Counting histogram (PCH)17, og tal og lysstyrke (N & B)18,19, er egnet til kvantitativ oligomer Målinger. Disse metoder analyserer fluorescens intensitets udsving, der kan observeres i tide, når fluorophorerne diffus ind og ud af en belysnings volumen. Amplituder af intensitets svingningerne kan entydigt beskrives ved den molekylære lysstyrke af fluoroforet (ε) og det gennemsnitlige antal fluorophorer (n) i belysnings volumenet17 (figur 2). Typisk kan diffusions koefficienten for fluorophorerne og det gennemsnitlige antal molekyler (omvendt relateret til G (0)-værdien) inden for belysnings volumenet opnås af FCS20. Men da diffusions tiden kun skalerer med den kubiske rod af massen, er FCS ikke tilstrækkelig følsom til at påvise ændringer i molekylmasse21. I praksis kan en enkelt farve FCS ikke detektere dimerisering af membranreceptorer. PCH løser blandinger af forskellige oligomerer nøjagtigt. Ved hjælp af mere end to øjeblikke af amplitude fordelingen, det registrerer molekyler af forskellig lysstyrke, der indtager den samme belysning volumen. Scanning FCS22 og udviklinger, såsom den interessante par-korrelation af Molekylær lysstyrke (pcomb) tilgang23, indført for at udvide anvendelsesområdet for fluorescens korrelations metoder i biologiske systemer24 , forblive enkelt punkt metoder, der mangler evnen til hurtige målinger i et stort område af en celle, kræver mange på hinanden følgende observationer på hver pixel og data erhvervelse i rækkefølgen af sekunder.
N & B er en forenklet version af PCH, der kun betragter det første og andet øjeblik af amplituden i fluorescens fordelingen, nemlig den gennemsnitlige intensitet, , og variansen, σ2 (figur 2)18,19 og på grund af dette, kan den ikke bestemme den molære fraktion af ukendte oligomerer i en blanding, men anslår kun den gennemsnitlige oligomeriserings tilstand af blandingen. Ikke desto mindre har N & B den fordel at arbejde med relativt mindre tidsserier af billeder af levende celler end PCH på en pixel-for-pixel basis, blot ved at overvåge udsving på tidspunktet for fluorescens intensitet. Da N & B reducerer tiden pr. pixel til nogle få mikrosekunder, kan den følge en hurtig oligomeriserings kinetik over store celleområder, hvilket giver mulighed for at erhverve billeder på en tidsskala i sekunder i mikroskopi af raster scanning (f. eks. confocal, 2-photon) og millisekunder i Kamerabaseret mikroskopi (f. eks. TIRFM).
Flere rapporter har vist, at N & B er i stand til at kvantificere antallet af under enheder i protein klynger ved at afbilde udvidede celleområder. Der blev fundet paxillin-EGFP-klynger på vedhæftnings stederne i CHO-K1-cellerne25, og den intracellulære sammenlægning af det patogene Httex1p peptid blev beskrevet i cos-7-cellerne26. N & B blev ansøgt om at følge den ligand-drevne oligomerisering af ErbB-receptoren27og virkningen af ligand-FGF21 på Klothob (klb) og FGFR1c i Hela-cellerne28. Kombinationen af TIRF Imaging og N & B analyse blev brugt til at vise, at dynamin-2 primært er tetrameric i hele cellemembranen29. Vi anvendte N & B til både raster scanning og tirf billeder til at bevise ligand-drevet denne af uPAR og FGFR1 celle membranreceptorer30,31.
Fluorescens korrelations metoder, såsom N & B, FCS og PCH, er baseret på forestillingen om, at antallet af partikler i et åbent volumen følger en Poisson-fordeling. Da kun de fotoner, som fluorophorerne udsender, kan påvises, er middelværdien for en målt fluorescens intensitet versus tid i en pixel i billedet <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> </img>, produktet af det gennemsnitlige antal fluorophorer i belysnings volumen n og deres Molekylær lysstyrke, ε17:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
hvor ε udtrykkes som antallet af fotoner, der udsendes pr. tidsenhed (konventionelt pr. sekund) pr. molekyle, når molekylet er i midten af belysnings volumenet.
Lysstyrke er en egenskab for hver fluoroforet i en given erhvervelse oprettet, mens intensitet er summen af alle bidrag fra alle fluorophorer. I biologiske konkurrencer, vil lysstyrken stige med stigningen i antallet af fluorophorer, der svinger sammen, giver oplysninger om oligomerisering tilstand af fluorescently-mærkede protein. Udsvingene amplituder ved en given pixel måles fra variansen af fluorescens signalet, σ2:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
Hvor middelværdien af kvadratet af intensitet <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> </img>,, og kvadratet af middelværdien af <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> </img>intensitet, er beregnet ud fra de individuelle intensitetsværdier i hver pixel i hver ramme:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
hvor K er antallet af samlede rammer i tidsserierne. Eksperimentelt er det nødvendigt at beregne variansen for hele billedserien, der beskriver spredningen af de individuelle intensitetsværdier ved hver pixel i et enkelt billede omkring middelintensitets værdien. Variansen omfatter alle udsving af forskellig oprindelse. Ved første tilnærmelse kan variansen på grund af sprede-partiklerne i belysnings volumenet, σ20, adskilles fra variansen på grund af detektor støjen, σ2d. De to afvigelser er uafhængige; således, den samlede varians er givet ved deres sum:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
Variansen på grund af molekylære udsving i og ud af detekterings volumenet er lineært afhængigt af den molekylære lysstyrke og intensitet:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
Omarrangering af EQ. 6 ifølge EQ. 1:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
Ifølge den typiske koncept i fluorescens korrelations spektroskopi, ligning 7 hedder det, at variansen på grund af antallet af udsving afhænger af kvadratet af partikel lysstyrken.
Variansen på grund af detektor udsving er derefter en lineær funktion af den detekterede intensitet under den antagelse, at detektoren drives under dens mætningsgrænse19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
I tilfælde af foton tælle detektorer a= 1 og c= 0, således detektor variansen er lig med den gennemsnitlige intensitet:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
For at anvende disse begreber til reelle målinger i levende celler, Gratton og kolleger18 definere den tilsyneladende lysstyrke, B, for hver pixel som forholdet mellem variansen over den gennemsnitlige intensitet:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B er den parameter, der måles eksperimentelt. I dette arbejde, tidsserie billeder af FGFR1 receptorer på plasma membranen af HeLa celler er fanget af TIRF mikroskopi og den gennemsnitlige tilsyneladende lysstyrke, B, bestemmes af N & B analyse. Derefter, efter tilsætning af FGF2, sammenhængende tidsserier er fanget for at følge ændringerne i den selv-samling af receptor molekyler i membranen overflade efter stimulation af receptoren med den kanoniske ligand.
Men da detektoren af TIRF mikroskop er et EMCCD-kamera, skal udtrykket for den tilsyneladende lysstyrke ændres som19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
hvor offset er den intensitets forskydning af detekterings elektronikken, der er karakteristisk for detektor indstillingerne. Variansen og den gennemsnitlige intensitet for en analog detektor angives henholdsvis ved:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
hvor G er analog gevinst i digitale niveauer (DL/photons), S, de digitale niveauer per photon19, er givet ved hældningen af en intensitet versus varians plot for en lyskilde med konstant intensitet (ingen tidsmæssige udsving). Γ-faktoren er relateret til form af pixel detekterings volumen. Ifølge Hassler et al.32er γ faktoren lig med 0,3 for tirf-billeddannelse, der arbejder ved den maksimale gevinst ved detekterings kameraet19. Parametrene offset, S og G er egenskaber for kameraet og mikroskopet. Den tilsyneladende lysstyrke, B, opnås ved at omarrangere EQ. 11 i henhold til EQ. 12 og 13:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
Eksperimentelt er ε en kompleks funktion af laser intensitet og systemets detekterings effektivitet. Da B/S ikke desto mindre er lineært afhængig af ε, er det kun vigtigt at bestemme den relative værdi af ε for en given detekterings tilstand:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
hvor ε ' er proportional med ε. Alligevel udføres en kalibrering ved hjælp af en intern reference.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum 98% minimun</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>21063029</td>
			<td>Used serum free for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high-glucose GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>Used for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0515-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitting system Photometrics DV2</td>
			<td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td>10% inactivated supplement for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes</td>
			<td>MatTek, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>uncoated, glass thickness 0.17 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells</td>
			<td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CB_08011102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software</td>
			<td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td>
			<td></td>
			<td>This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&#38;B time series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Executable N&#38;B routine</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab v.2018b</td>
			<td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x</td>
			<td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td>
			<td>LONZA 17-602E</td>
			<td>supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100&#181;g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector</td>
			<td>Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td>Zamai et al., 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGF2</td>
			<td>PeproTech EC, Ltd., London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate GIBCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>1mM supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIt-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid 10 mL</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513 859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM2618</td>
			<td>0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis

På trods af betydningen og allesteds nærhed af receptor oligomerisering, få metoder er gældende for påvisning klyngedannelse begivenheder og måling af graden af klyngedannelse. Her beskriver vi en Imaging tilgang til at bestemme den gennemsnitlige oligomeriske tilstand af mEGFP-mærkede-receptor homokomplekser i membranen af levende celler. Protokollen er baseret på total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi kombineret med tal og lysstyrke (N & B) analyse. N & B er en metode, der svarer til fluorescens-korrelations spektroskopi (FCS) og foton-optællings histogram (PCH), som er baseret på den statistiske analyse af svingningerne i fluorescens intensitet af fluorophorer, der spredes ind og ud af en belysning volumen i løbet af observationstiden. Navnlig er N & B en forenkling af PCH for at indhente oplysninger om det gennemsnitlige antal proteiner i oligomeriske blandinger. Amplituder for intensitets udsving er beskrevet af fluoroforet molekyle lysstyrke og det gennemsnitlige antal fluorophorer inden for belysnings volumenet. N & B betragter således kun første og andet øjeblik af amplitude fordelingen, nemlig den gennemsnitlige intensitet og variansen. Dette er på samme tid, styrken og svagheden af metoden. Da der kun tages hensyn til to øjeblikke, kan N & B ikke bestemme den molære fraktion af ukendte oligomerer i en blanding, men den anslår kun den gennemsnitlige oligomeriserings tilstand for blandingen. Ikke desto mindre kan det anvendes til relativt små tidsserier (sammenlignet med andre moment metoder) af billeder af levende celler på en pixel-for-pixel basis, blot ved at overvåge tids udsving i fluorescens intensitet. Det reducerer den effektive time-per-pixel til et par mikrosekund, tillader erhvervelse i tidsinterval af sekunder til millisekunder, hvilket er nødvendigt for hurtig oligomerisering kinetik. Endelig kan store celleområder såvel som sub-cellulære rum udforskes.

Resultaterne for to repræsentative HeLa-mEGFP-FGFR1-celler, der er seedet i samme dyrknings skål, er vist i figur 5 og supplerende tabel 1. De to celler blev fanget på tidspunktet 0 min (figur 5a, top) og 7 min (figur 5a, bund) efter tilsætning af FGF2 ligand.
Figur...

Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Vi beskriver en billedbehandlings metode til bestemmelse af den gennemsnitlige oligomeriske tilstand af mEGFP-mærkede receptor-oligomerer induceret af ligand binding i plasma membranen af levende celler. Protokollen er baseret på total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi kombineret med tal og lysstyrke (N & B) analyse.

Oligomerization dynamik af celleoverflade receptorer i levende celler ved total intern refleksion Fluorescens mikroskopi kombineret med tal og lysstyrke analyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Receptor klyngedannelse er allestedsnærværende og ofte nødvendigt for signalering en kaskade aktivering. Der findes dog få metoder til at måle graden af klyngedannelse. Vi bruger total intern refleksion fluorescens, TIRF mikroskopi, at følge diffusion af FGFR1-mEGFP molekyler i plasmamembranen af levende celler.Så vi anvender tal lysstyrke, N & B analyse, til at beskrive dynamikken i stimuleret receptor klyngedannelse. TIRF er ideel til hurtig tidsmæssig billeddannelse af molekylære hændelser, der forekommer nær celleoverfladen, mens N&B bestemmer den gennemsnitlige oligomeriske tilstand af fluorescerende molekyler baseret på, hvor diffusion ind og ud belysning volumen af mikroskopet. Faktisk er dette et værktøj til at forbinde den rumlige tidsmæssige organisering af receptorerne på celleoverfladen, hvor de signalerer.N&B har kun brug for adgang til et mikroskop med et hurtigt anskaffelsesmodul. Du kan analysere store område af levende celler, der kun har den grundlæggende viden om fluorescens udsving metoder. Denne metode kan anvendes på proteiner, der danner dimers eller klynger og kan støkiometrisk mærket med fluorescerende farvestof.Hvis proteinerne er i intracellulære rum, anvendes andre typer mikroskoper til at erhverve billederne. Det er vigtigt at forberede en konstruktion, der udtrykker fluorophores monomeriske form til måling under forsøgsbetingelser den rene monomeriske lysstyrke som en kontrol. På den første dag, frø HeLa celler i 1,5 milliliter komplet medium i en koncentration på 100, 000 til 200, 000 celler pr milliliter i glas-bund retter.Seed seks til otte replikere retter, og inkubere i en inkubator ved 37 grader Celsius. På den anden eller tredje dag har cellerne nået underkonfluency. Tilsæt serumfrit medium med proteinplasmid til halvdelen af retterne, og tilsæt referenceplasmider med monomer og dimer til anden halvdel af retterne for at transfect cellerne.Efter en dag, kontrollere, at de transfekterede celler er klæbende til bunden af retterne og cellemembranen er fluorescerende. Kassér retter med tilgroede celler eller med meget lav fluorescens. Fire timer før eksperimentet aktiveres mikroskopets temperaturkubvøse ved 37 grader Celsius.Tænd for mikroskopet, computere og kameraer, og vent på, at kameraerne når den korrekte arbejdstemperatur på minus 75 grader Celsius. Placer en lille dråbe olie på objektivet linsen. Sæt en prøveskål i mikroskopets inkubator, og luk dørene til rugemaskinen for at lade temperaturen af skålen være ligevægt i 10 minutter.Tænd for epifluorescenslampen og 488-nanometerlaseren. Vælg epifluorescenskontrasttilstanden for at udforske prøven og søge i en celle for at fokusere fra det okulære objektiv. Vælg det korrekte filter til indsamling af den grønne emission gennem mikroskopkameraet med bandpass Ex 490/20 500 og bandpass Em 525/50 eller lignende.Skift fra okulær til cam rapport i epifluorescens tilstand. Afgræns fokus, og skift til TIRF-tilstand. Aktivér derefter den automatiske justering efter instruktionerne i TIRF-mikroskopet.Vælg en passende belysningsdybde, og optimer retningen af evanescentfeltet. Skift til et andet kamera. Definer et område af interesse på mindst 256 gange 256 pixel.Indstil eksponeringen til et millisekund og EM-gevinsten til 1.000. Juster lasereffekten til 0,5 milliwatt. Det er nødvendigt at have nogle oplysninger om diffusionskoefficienten for proteinet, fordi eksponeringstiden skal være kortere end den gennemsnitlige tid, som lysstofmolekylerne bruger i det udlyste volumen.Kør en første prøvesekvens under indledende forhold, og anslå signal-støj-værdien groft. Betingelserne kan accepteres ved signal-til-støj svarende til to til tre eller højere som målt i første gangsserier. Brug derefter skyderen af emissionsspaltningssystemet, der forbinder kamera nummer to til mikroskopet til at maskere en side af billedet.Vælg indstillingen Automatisk lagring af kamerafilen. Start anskaffelsen af billedserien for mindst 700 billeder med et signal-støj-forhold på mindst to. Uden at tage skålen ud af mikroskopet, tilsæt ligand.Vælg en celle med en lys fluorescensmembran, og start hurtigt første gangsserien af det kinetiske løb. Søg i en anden celle, og få det andet tidspunktspunkt for kinetik. Hent en ny celle for hvert tidspunkt i den kinetiske kørsel.For hver ny skål gentages justeringen af laserlinjen og optimering af TIRF-belysning. Nu konvertere og gemme billedfiler erhvervet med kameraet software som tif filer. Importér tif-filer i analysesoftwarerutinen ved at aktivere N&B-brugerinterfase MATLAB.Kassér serier, hvor den gennemsnitlige intensitetsprofil viser mere end 10 % fotobleaching og serier, hvor der har været en tydelig cellemembranforvrængning eller oversættelse under erhvervelsen. Beskær rammer, der åbenbart er ude af fokus. Hold kun serie til analyse med mindst 500 tidsrammer.Først bestemme kameraets parametre. Aktiver det rutinemæssige kalibrere kamera. Vælg et område på mindst 20 gange 50 pixel i detektorstøjområdet.I logfrekvensen i forhold til det digitale niveau skal du flytte den lineære røde markør for at afgrænse Gaussian i den lineære del af kurven. Aktivér B-tasten. Anvend et minimum binning på 2,2 for at reducere spredningen af dataene og for at generere B-I histogrammet.Brug den iterative firkantede markør til at inspicere B-I histogram. Vælg et kvadratisk investeringsafkast til analysen, og opret B-kortet for det valgte investeringsafkast. Gem derefter ASCII-filen for de B-værdier, der er knyttet til markeringen.Importer ASCII i en grafiksoftware for at beregne dataenes frekvensfordeling og få den gennemsnitlige B-værdi plus eller minus S.E.Apply epsilonligningen for at udlede den gennemsnitlige lysstyrke for hver celle på hvert tidspunkt i den kinetiske kørsel. Normalisere dataene i henhold til normaliseringsligningen, hvor B't er den gennemsnitlige B-værdi målt på tidspunkt t efter ligandtilsætning, og B'0 er den gennemsnitlige B-værdi målt på det tidspunkt, hvor t er lig nul, hvilket er 10 til 20 sekunder efter ligand additino. Plot den normaliserede gennemsnitlige lysstyrke versus erhvervelse tid til at bygge den kinetiske køre.I denne undersøgelse, repræsentative resultater fra to HeLa celler i samme parabol udtrykker mEGFP-FGR1 fanget på tid nul og syv, efter tilsætning af 20 nanogram pr milliliter FGF2, er vist her. Sammenlignet med referencekonstruktionerne, GPI-mEGFP og GPI-mEGFP-mEGFP-dimer viser hele analysesekvensen den gennemsnitlige intensitet af tidsserien. Plot af alle B-værdier.B-I histogram. B-kort over det valgte investeringsafkast. Og det tilhørende B-distribution histogram.Efter stimulering med 20 nanogram pr. milliliter FGF2 beskriver repræsentative kinetiske kørsler, der viser den gennemsnitlige lysstyrke som tidens funktion, den langsomme dimeriseringsproces, der varer ved i flere minutter ved celleoverfladen. Når stimuleret med 50 mikrogram pr. milliliter NCAM-Fc, afslører den kinetiske profil hurtige og cykliske overgange af receptoren i oligomeriske blandinger, som også når lysstyrkeværdier over dimerens. En normaliseret gennemsnitsværdi på tre observeres gentagne gange.Det er vigtigt at minimere de ekstra varianter på grund af ingen molekylære udsving og blegning. Og celler skal være godt overholdt glasbundet fad, ikke tilgroet, og ikke stablet op. Hvis vi er interesseret i et protein, der spreder hurtigere inde i intracellulære rum, kan vi anvende hurtigere nul gange og bruge scanning på fokale eller multiphoton mikroskoper til billede inde i cellen.Med vores tilgang minimerer vi de skadelige virkninger af photobleaching, når vi ønsker at udforske dynamikken i begivenheder som dimerization. Disse begivenheder styrer en række cellulære reaktioner og er meget vanskelige at bevise i levende celler med andre teknikker.

Research

JoVE Journal

Biology

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative levende celler fluorescens-mikroskopi Analyse af Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorescensimagografi med One-nanometer Nøjagtighed (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse af Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Ved hjælp Sult Pads i kombination med Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Real-time Imaging af Plant Cell Surface Dynamics med variabel vinkel epifluorescens Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Light Sheet Fluorescens mikroskopi af planterødder Dyrkning på overfladen af ​​en gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open source Single-partikel Analyse for Super-resolution Microscopy med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersøgelse af mitotisk og meiotisk fission gær nuklear dynamik ved fluorescens levende celle mikroskopi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...