Name: oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

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1. Préparation de l'échantillon
<ol><li>Jour 1. Cellules HeLa de graine dans le milieu complet à une concentration de 100.000-200.000 cellules/mL dans les plats en verre-fond. Graines 6-8 reproduire les plats. REMARQUE: Dans cet exemple, le milieu est complété par 10% de chaleur inactivée sérum bovin fœtal (FBS), 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/100 g de pénicilline/streptomycine. Plusieurs plats reproduits sont préparés.</li>
	<li>Jour 2-3. Lorsque les cellules sont sous-confluences, tr...

<ol>
	<li>Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+insights+into+gonadotropin+hormone+receptor+dimerization+and+oligomerization.">Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization.</a> Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).</li><li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited:+functional+and+pharmacological+perspectives.">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).</li><li>Marsango, S., Ward, R. 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R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+brightness+image+analysis+reveals+ATF-induced+dimerization+kinetics+of+uPAR+in+the+cell+membrane.">Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane.</a> FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).</li><li>Zamai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+brightness+analysis+reveals+that+NCAM+and+FGF2+elicit+different+assembly+and+dynamics+of+FGFR1+in+live+cells.">Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells.</a> Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).</li><li>Hassler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+correlation+spectroscopy+(TIR-FCS)+with+low+background+and+high+count-rate+per+molecule.">Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule.</a> Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).</li><li>Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fast+fluorescence+imaging+to+molecular+diffusion+law+on+live+cell+membranes+in+a+commercial+microscope.">From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+incidence+angle+for+through-the-objective+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).</li><li>Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+limits+and+data+correction+in+number+of+molecules+and+brightness+analysis.">Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis.</a> Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).</li><li>Caiolfa, V. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+red+fluorescent+protein.">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).</li><li>Cutrale, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+enhanced+number+and+brightness+to+measure+protein+oligomerization+dynamics+in+live+cells.">Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells.</a> Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).</li><li>Dunsing, V., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence+Fluctuation+Spectroscopy+Assay+of+Protein-Protein+Interactions+at+Cell-Cell+Contacts.">A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li></ol>

La N-B exige plusieurs précautions dans le choix du modèle cellulaire et de la stratégie d'étiquetage. Il ne peut être appliqué qu'aux cellules vivantes qui restent stablement respectées pendant le temps de capture d'image. Les fluctuations supplémentaires dues à l'ensemble du déplacement rigide de la cellule peuvent être traitées avec des approches appropriées de restauration d'image38. Cependant, généralement quand une cellule se déplace, la membrane cellulaire se déforme égale...

Nous décrivons une approche d'imagerie de fluorescence et de luminosité de réflexion interne totale (TIRF-N-B) pour déterminer l'état oligomeric moyen des molécules de récepteur à la membrane de plasma des cellules vivantes, visant à relier l'assemblage de récepteur dynamique à la fonction biologique des protéines (Figure 1).
Sur la liaison extracellulaire de ligand, les récepteurs initient la transduction intracellulaire de signal selon leur conformation, oligomerization, co-récepteurs potentiels et composition de membrane. Malgré l'importance et l'omniprésence de l'oligomerisation des récepteurs, reconnu comme un événement clé dans la signalisation cellulaire1,2,3,4,5,6, 7, peu de méthodes peuvent détecter les événements de clustering et mesurer le degré de clustering expérimentalement8,9. Le volume confocal (x,y 300 nm, z '900 nm) est insuffisamment résolu pour prouver l'interaction moléculaire et la stoichiométrie, même après optimisation par des algorithmes de restauration d'image10. La composition sous-unité des oligomères protéiques ne peut pas être résolue sur une base purement spatiale, même par des méthodes de super-résolution à x, y résolution de 20-70 nm tels que PALM11, STORM12, et STED13. En outre, leur résolution temporelle (de l'ordre de minutes par image) ne peut pas suivre la cinétique dans la gamme de secondes. Le blanchiment par étapes d'une seule molécule ne résout la stoichiométrie des oligomères protéiques que s'ils sont immobiles14.
L'une des méthodes les plus polyvalentes pour mesurer la densité et l'oligomerisation des protéines étiquetées fluorescentes dans des images uniques est l'analyse de distribution de l'intensité spatiale (SpIDA), qui repose sur l'échantillonnage spatial. Il s'applique à la fois aux cellules fixes et vivantes chimiquement, et permet l'analyse de plusieurs régions d'intérêt de la cellule simultanément en utilisant la microscopie de fluorescence standard15. Alternativement, les méthodes de moment, telles que la spectroscopie de fluorescence-corrélation (FCS)16,l'histogramme de comptage de photon (PCH)17,et le nombre et la luminosité (N et B)18,19,sont appropriés pour l'oligomère quantitatif Mesures. Ces méthodes analysent les fluctuations d'intensité de fluorescence qui peuvent être observées à temps lorsque les fluorophores se diffusent dans et hors d'un volume d'éclairage. Les amplitudes des fluctuations d'intensité peuvent être décrites de façon unique par la luminosité moléculaire du fluorophore (mD) et le nombre moyen de fluorophores (n) dans le volume d'éclairage17 (figure 2). Typiquement, le coefficient de diffusion des fluorophores et le nombre moyen de molécules (inversement liés à la valeur G(0) dans le volume d'éclairage peuvent être obtenus par FCS20. Cependant, puisque le temps de diffusion ne s'écaille qu'avec la racine cubique de la masse, le FCS n'est pas suffisamment sensible pour détecter les changements de masse moléculaire21. Dans la pratique, FCS de couleur unique ne peut pas détecter la dimerisation des récepteurs membranaires. PCH résout avec précision les mélanges de différents oligomères. À l'aide de plus de deux moments de la distribution de l'amplitude, il détecte des molécules d'une luminosité différente qui occupent le même volume d'éclairage. Balayage FCS22 et les développements, tels que l'intéressante paire-corrélation de la luminosité moléculaire (pCOMB) approche23, introduit pour étendre la gamme d'applicabilité des méthodes de corrélation de fluorescence dans les systèmes biologiques24 , restent des méthodes à point unique dépourvues de la capacité de mesures rapides dans une grande zone d'une cellule, nécessitant de nombreuses observations consécutives à chaque pixel et acquisition de données dans l'ordre de secondes.
N-B est une version simplifiée de PCH qui ne tient compte que des premiers et deuxièmes moments de l'amplitude de la distribution de fluorescence, à savoir l'intensité moyenne, lt;I-gt;, et la variance,'2 (Figure 2)18,19 et, pour cette raison, il ne peut pas déterminer la fraction molaire des oligomères inconnus dans un mélange, mais seulement estime l'état moyen d'oligomerisation du mélange. Néanmoins, n'a l'avantage de travailler avec des séries temporelles d'images de cellules vivantes relativement plus petites que PCH sur une base pixel par pixel, simplement en surveillant les fluctuations à l'heure de l'intensité de la fluorescence. Étant donné que le temps par pixel réduit le temps par pixel à quelques microsecondes, il peut suivre la cinétique d'oligomerisation rapide sur de grandes zones cellulaires, permettant l'acquisition d'images sur une échelle de temps de secondes dans la microscopie de balayage de raster (par exemple, confocal, 2-photon) et millisecondes microscopie à la caméra (p. ex. TIRFM).
Plusieurs rapports ont démontré la capacité de N-B à quantifier le nombre de sous-unités dans les grappes de protéines par imagerie des régions cellulaires étendues. Des amas de Paxillin-EGFP ont été détectés aux emplacements d'adhérence dans les cellules de CHO-K125,et l'agrégation intracellulaire du peptide pathogène de Httex1p a été décrite dans les cellules coS-726. Le n et B a été appliqué pour suivre l'oligomerisation ligand-conduite du récepteur d'ErbB27,et l'effet du ligand FGF21 sur Klothob (KLB) et FGFR1c dans les cellules de HeLa28. La combinaison de l'imagerie TIRF et de l'analyse N-B a été utilisée pour montrer que le dynamin-2 est principalement tétracumé dans toute la membrane cellulaire29. Nous avons appliqué n'et B à la fois raster balayage et images TIRF pour prouver ligand-conduit dimerization des récepteurs de membrane cellulaire uPAR et FGFR130,31.
Les méthodes de corrélation de fluorescence, telles que le N-B, le FCS et le PCH, sont basées sur l'idée que dans un volume ouvert le nombre d'occupation des particules suit une distribution de Poisson. Parce que seuls les photons que les fluorophores émettent peuvent être détectés, la valeur moyenne <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> </img>d'une intensité de fluorescence mesurée par rapport au temps dans un pixel de l'image, est le produit du nombre moyen de fluorophores dans le volume d'éclairage, n, et leur luminosité moléculaire,17euros :
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
où le nombre de photons émis par unité de temps (conventionnellement par seconde) par molécule lorsque la molécule est au centre du volume d'éclairage.
La luminosité est une propriété de chaque fluorophore dans une acquisition donnée mise en place, tandis que l'intensité est la somme de toutes les contributions de tous les fluorophores. Dans les concours biologiques, la luminosité augmentera avec l'augmentation du nombre de fluorophores qui fluctuent ensemble, donnant des informations sur l'état d'oligomerisation de la protéine fluorescente. Les amplitudes de fluctuation à un pixel donné sont mesurées à partir de la variance du signal de fluorescence,no 2:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
Lorsque la moyenne du carré <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> </img>d'intensité, et le <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> </img>carré de la moyenne de l'intensité, , sont calculer à partir des valeurs d'intensité individuelle dans chaque pixel de chaque image:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
où K est le nombre total d'images dans la série chronologique. Expérimentalement, il est nécessaire de calculer pour l'ensemble de la série d'images la variance qui décrit la diffusion des valeurs d'intensité individuelles à chaque pixel d'une seule image autour de la valeur moyenne de l'intensité. La variance comprend toutes les fluctuations d'origines différentes. Dans une première approximation, la variance due aux particules de diffusion dans le volume d'éclairage,20, peut être séparée de la variance en raison du bruit de tir du détecteur,2d. Les deux écarts sont indépendants; ainsi, l'écart total est donné par leur somme :
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
La variance, due aux fluctuations moléculaires dans et hors du volume de détection, dépend linéairement de la luminosité et de l'intensité moléculaires :
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
Réorganisation eq. 6 selon eq. 1:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
Selon le concept typique de la spectroscopie de corrélation de fluorescence, l'équation 7 indique que la variance due au nombre de fluctuations dépend du carré de la luminosité des particules.
Ensuite, la variance due aux fluctuations du détecteur est une fonction linéaire de l'intensité détectée, en supposant que le détecteur est exploité en dessous de sa limite de saturation19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
Dans le cas des détecteurs de comptage de photons de1 et de 0,la variance du détecteur est donc égale à l'intensité moyenne :
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
Pour appliquer ces concepts à des mesures réelles dans des cellules vivantes, Gratton et ses collègues18 définissent la luminosité apparente, B, pour chaque pixel comme le rapport de la variance par rapport à l'intensité moyenne :
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B est le paramètre qui est mesuré expérimentalement. Dans ce travail, les images de séries chronologiques des récepteurs FGFR1 à la membrane plasmatique des cellules HeLa sont capturées par microscopie TIRF et la luminosité apparente moyenne, B, est déterminée par l'analyse N et B. Puis, après l'ajout de FGF2, des séries chronologiques consécutives sont capturées pour suivre les changements dans l'auto-assemblage des molécules de récepteur dans la surface de membrane après stimulation du récepteur avec le ligand canonique.
Cependant, puisque le détecteur du microscope TIRF est une caméra EMCCD, l'expression de la luminosité apparente doit être modifiée comme19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
lorsque le décalage est le décalage d'intensité de l'électronique de détection qui est une caractéristique des paramètres du détecteur. La variance et l'intensité moyenne d'un détecteur analogique sont données respectivement par :
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
où G est le gain analogique dans les niveaux numériques (DL/photons), S, les niveaux numériques par photon19, est donné par la pente d'une intensité par rapport à l'intrigue de variance pour une source lumineuse avec une intensité constante (pas de fluctuations temporelles). Le facteur de l'aétée est lié à la forme du volume de détection des pixels. Selon Hassler et coll.32, le facteur d'aété est égal à 0,3 pour l'imagerie TIRF travaillant au gain maximum de la caméra de détection19. Les paramètres de décalage, S et G sont des caractéristiques de la caméra et du microscope. La luminosité apparente, B, est obtenue en réorganisant eq. 11 selon eq. 12 et 13:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
Expérimentalement, est une fonction complexe de l'intensité laser et de l'efficacité de détection du système. Néanmoins, étant donné que le B/S dépend linéairement de l'activité, il est seulement important de déterminer la valeur relative de l'application pour un mode de détection donné :
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
où est proportionnelle à la proportion de ' Pourtant, un étalonnage est effectué à l'aide d'une référence interne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum 98% minimun</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>21063029</td>
			<td>Used serum free for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high-glucose GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>Used for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0515-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitting system Photometrics DV2</td>
			<td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td>10% inactivated supplement for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes</td>
			<td>MatTek, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>uncoated, glass thickness 0.17 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells</td>
			<td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CB_08011102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software</td>
			<td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td>
			<td></td>
			<td>This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&#38;B time series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Executable N&#38;B routine</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab v.2018b</td>
			<td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x</td>
			<td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td>
			<td>LONZA 17-602E</td>
			<td>supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100&#181;g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector</td>
			<td>Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td>Zamai et al., 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGF2</td>
			<td>PeproTech EC, Ltd., London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate GIBCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>1mM supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIt-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid 10 mL</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513 859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM2618</td>
			<td>0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis

Malgré l'importance et l'omniprésence de l'oligomerisation des récepteurs, peu de méthodes sont applicables pour détecter les événements de regroupement et mesurer le degré de regroupement. Ici, nous décrivons une approche de formation image pour déterminer l'état oligomeric moyen des homocomplexes mEGFP-marqué-récepteur dans la membrane des cellules vivantes. Le protocole est basé sur la microscopie de la fluorescence de la réflexion interne totale (TIRF) combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité (N-B). La méthode est une méthode semblable à la spectroscopie de corrélation fluorescence (FCS) et à l'histogramme de comptage de photons (PCH), qui sont basées sur l'analyse statistique des fluctuations de l'intensité de fluorescence des fluorophores diffusant dans et hors d'un éclairage volume pendant un temps d'observation. En particulier, n'est une simplification de PCH pour obtenir des informations sur le nombre moyen de protéines dans les mélanges d'oligomériques. Les amplitudes de fluctuation d'intensité sont décrites par la luminosité moléculaire du fluorophore et le nombre moyen de fluorophores dans le volume d'illumination. Ainsi, N-B ne considère que les premier et deuxième moments de la distribution de l'amplitude, à savoir l'intensité moyenne et la variance. C'est, en même temps, la force et la faiblesse de la méthode. Étant donné que seulement deux moments sont pris en considération, n'est pas en passe de déterminer la fraction molaire des oligomères inconnus dans un mélange, mais elle n'estime que l'état moyen d'oligomerisation du mélange. Néanmoins, il peut être appliqué à des séries chronologiques relativement petites (par rapport à d'autres méthodes de moment) d'images de cellules vivantes sur une base pixel par pixel, simplement en surveillant les fluctuations temporelles de l'intensité de la fluorescence. Il réduit le temps efficace par pixel à quelques microsecondes, permettant l'acquisition dans la plage de temps de secondes à millisecondes, ce qui est nécessaire pour la cinétique d'oligomerisation rapide. Enfin, de grandes zones cellulaires ainsi que des compartiments sous-cellulaires peuvent être explorés.

Les résultats de deux cellules représentatives HeLa-mEGFP-FGFR1 ensemées dans le même plat de culture sont présentés dans la figure 5 et le tableau supplémentaire 1. Les deux cellules ont été capturées à l'époque 0 min (Figure 5A, top) et 7 min (Figure 5A, bottom) après l'ajout du ligand FGF2.
<p class="jove_content" fo:keep-together...

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Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Nous décrivons une approche de formation image pour la détermination de l'état oligomeric moyen des oligomères mEGFP-marqué-récepteurs induits par la liaison de ligand dans la membrane de plasma des cellules vivantes. Le protocole est basé sur la microscopie de la fluorescence de la réflexion interne totale (TIRF) combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité (N-B).

Dynamique d'oligomerisation des récepteurs de surface cellulaire dans les cellules vivantes par microscopie de fluorescence interne totale combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

L’amas de récepteurs est omniprésent et souvent nécessaire pour signaler une activation en cascade. Cependant, peu de méthodes sont disponibles pour mesurer le degré de regroupement. Nous utilisons la fluorescence de réflexion interne totale, microscopie TIRF, pour suivre la diffusion des molécules FGFR1-mEGFP dans la membrane plasmatique des cellules vivantes.Ensuite, nous appliquons la luminosité des nombres, l’analyse N & B, pour décrire la dynamique de clustering des récepteurs stimulés. Tirf est idéal pour l’imagerie temporelle rapide des événements moléculaires qui se produisent près de la surface cellulaire, tandis que N & B détermine l’état oligomérique moyen des molécules fluorescentes en fonction de l’endroit où la diffusion dans et hors du volume d’éclairage du microscope. En effet, il s’agit d’un outil pour relier l’organisation temporelle spatiale des récepteurs à la surface de la cellule où ils signalent.N&B n’a besoin que d’un microscope avec un module d’acquisition rapide. Vous pouvez analyser une grande surface de cellules vivantes ayant juste la connaissance de base des méthodes de fluctuation de fluorescence. Cette méthode peut être appliquée aux protéines qui forment des dimers ou des grappes et peuvent être stoichiométriquement étiquetées avec le colorant fluorescent.Si les protéines se trouvent dans des compartiments intracellulaires, d’autres types de microscopes sont utilisés pour l’acquisition des images. Il est important de préparer une construction qui exprime la forme monomère du fluorophore pour mesurer dans des conditions expérimentales la luminosité monomérique pure comme un contrôle. Le premier jour, les cellules HeLa semer dans 1,5 millilitres de milieu complet à une concentration de 100.000 à 200.000 cellules par millilitre dans les plats à fond de verre.Graines six à huit reproduire les plats, et incuber dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Le deuxième ou le troisième jour, les cellules ont atteint la sous-confluence. Ajouter le milieu sans sérum avec le plasmide protéique à la moitié des plats, et ajouter des plasmides de référence avec le monomère et le dimère à la deuxième moitié des plats pour transfecter les cellules.Après une journée, vérifiez que les cellules transfectées adhèrent au fond de la vaisselle et que la membrane cellulaire est fluorescente. Jeter les plats avec des cellules envahies ou avec une fluorescence très faible. Quatre heures avant l’expérience, activez l’incubateur de température du microscope à 37 degrés Celsius.Allumez le microscope, les ordinateurs et les caméras, et attendez que les caméras atteignent la température de travail appropriée de moins 75 degrés Celsius. Placez une petite goutte d’huile sur la lentille objective. Mettez un échantillon de plat dans l’incubateur du microscope, et fermez les portes de l’incubateur pour laisser la température du plat équilibrer pendant 10 minutes.Allumez la lampe d’épifluorescence et le laser de 488 nanomètres. Sélectionnez le mode de contraste d’épifluorescence pour explorer l’échantillon, en fouillant une cellule pour se concentrer à partir de la lentille oculaire. Sélectionnez le filtre approprié pour recueillir l’émission verte à travers la caméra microscope avec bandpass Ex 490/20 500 et bandpass Em 525/50 ou similaire.Passez de l’oculaire au rapport de came en mode épifluorescence. Affinez la mise au point et changez en mode TIRF. Activez ensuite l’alignement automatique suivant les instructions du microscope TIRF.Choisissez une profondeur d’éclairage appropriée et optimisez la direction du champ évanescent. Passez à une deuxième caméra. Définissez une région d’intérêt d’au moins 256 par 256 pixels.Réglez l’exposition à une milliseconde et le gain em à 1000. Réglez la puissance laser à 0,5 milliwatts. Il est nécessaire d’avoir quelques informations sur le coefficient de diffusion de la protéine parce que le temps d’exposition doit être plus court que le temps moyen passé par les molécules fluorescentes dans le volume luminé.Exécutez une première séquence d’essai dans des conditions initiales et estimez approximativement la valeur du signal au bruit. Les conditions sont acceptables au signal-au-bruit égal à deux à trois ou plus tel que mesuré dans la première série de temps. Utilisez ensuite le curseur du système de fractionnement des émissions reliant la caméra numéro deux au microscope pour masquer un côté de l’image.Sélectionnez l’option d’arrêt automatique du fichier de la caméra. Commencez l’acquisition de la série d’images pour un minimum de 700 images à un rapport signal-bruit minimum de deux. Sans sortir le plat du microscope, ajouter le ligand.Sélectionnez une cellule avec une membrane de fluorescence brillante, et démarrez rapidement la première série de temps de la course cinétique. Rechercher une deuxième cellule, et d’acquérir le deuxième point de temps de la cinétique. Capturez une nouvelle cellule pour chaque point de temps de la course cinétique.Pour chaque nouveau plat, répétez l’alignement de la ligne laser et l’optimisation de l’éclairage TIRF. Maintenant convertir et enregistrer les fichiers d’image acquis avec le logiciel de la caméra que les fichiers tif. Importer des fichiers tif dans la routine logicielle d’analyse en activant l’utilisateur graphique N&B interphase MATLAB.Série de rejets pour laquelle le profil d’intensité moyenne montre plus de 10% de photobleaching et de séries dans lesquelles il y a eu une distorsion ou une traduction évidente de la membrane cellulaire lors de l’acquisition. Cadres de cultures qui sont évidemment hors de discussion. Gardez pour l’analyse uniquement les séries avec au moins 500 délais.Déterminez d’abord les paramètres de la caméra. Activez la caméra de calibre de routine. Sélectionnez une zone d’au moins 20 x 50 pixels dans la région du bruit du détecteur.Dans la fréquence du journal par rapport à l’intrigue numérique, déplacez le curseur rouge linéaire pour délimiter le Gaussian dans la partie linéaire de la courbe. Activez la clé B. Appliquer un binning minimum de 2,2 pour réduire la dispersion des données et pour générer l’histogramme B-I.Utilisez le curseur carré itératif pour inspecter l’histogramme B-I. Sélectionnez un roi carré pour l’analyse et générez la carte B du retour sur investissement sélectionné. Enregistrez ensuite le fichier ASCII des valeurs B associées à la sélection.Importer l’ASCII dans un logiciel graphique pour calculer la distribution des fréquences des données et obtenir la valeur B moyenne plus ou moins S.E.Appliquer l’équation d’epsilon pour obtenir la luminosité moyenne pour chaque cellule à chaque point de temps de la course cinétique. Normaliser les données en fonction de l’équation de normalisation, où B’t est la valeur moyenne B mesurée à l’époque t après l’addition ligand et B'0 est la valeur moyenne B mesurée à l’époque t égale zéro, qui est de 10 à 20 secondes après ligand additino. Tracez la luminosité moyenne normalisée par rapport au temps d’acquisition pour construire la course cinétique.Dans cette étude, les résultats représentatifs de deux cellules HeLa dans le même plat exprimant mEGFP-FGR1 capturés à l’époque zéro et sept, après ajout de 20 nanogrammes par millilitre de FGF2, sont montrés ici. Par rapport aux constructions de référence, GPI-mEGFP et GPI-mEGFP-mEGFP dimimer, l’ensemble de la séquence d’analyse montre l’intensité moyenne de la série de temps. Parcelle de toutes les valeurs B.Histogramme B-I. Carte B du roi choisi. Et l’histogramme associé à la distribution B.Après stimulation avec 20 nanogrammes par millilitre de FGF2, les courses cinétiques représentatives montrant la luminosité moyenne en fonction du temps décrivent le processus lent de dimérisation qui persiste pendant plusieurs minutes à la surface de la cellule. Lorsqu’il est stimulé par 50 microgrammes par millilitre de NCAM-Fc, le profil cinétique révèle des transitions rapides et cycliques du récepteur dans les mélanges oligomériques, qui atteint également des valeurs de luminosité supérieures à celle du dimère. Une valeur moyenne normalisée de trois est observée à plusieurs reprises.Il est important de minimiser les variantes supplémentaires en raison de l’aucune fluctuation moléculaire et le blanchiment. Et les cellules doivent être bien adhérés au plat à fond de verre, pas envahis, et ne pas s’empiler. Si nous sommes intéressés par une protéine qui diffuse plus rapidement à l’intérieur des compartiments intracellulaires, nous pouvons appliquer plus rapidement zéro fois et utiliser la numérisation sur les microscopes focaux ou multiphotons à l’image à l’intérieur de la cellule.Avec notre approche, nous minimisons les effets néfastes du photobleaching lorsque nous voulons explorer la dynamique d’événements tels que la diménisation. Ces événements contrôlent une variété de réponses cellulaires et sont très difficiles à prouver dans les cellules vivantes avec d’autres techniques.

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