Name: oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

Die CNIC wird vom Ministerium für Ciencia, Innovacion y Universidades und der Pro CNIC Foundation unterstützt und ist ein Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Wir werden auch vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (FEDER) "Una manera de hacer Europa" unterstützt. Die UC würdigt die Unterstützung der Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, der Association for International Cancer Research (heute als Worldwide Cancer Research bekannt) und des italienischen Gesundheitsministeriums. A.T. würdigt die "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" für die teilweise Unterstützung seiner Arbeit mit dem PV-Stipendium "Progetto Professionalit" Ivano Becchi" 2011-2012.

1. Probenvorbereitung
<ol><li>Tag 1. Saat-HeLa-Zellen in vollständiger Medium mit einer Konzentration von 100.000-200.000 Zelle/ml in Glasbodenschalen. Samen 6-8 replizieren Gerichte. HINWEIS: In diesem Beispiel wird das Medium durch 10% hitzeinaktiviertes Fetal Bovine Serum (FBS), 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/100 g Penicillin/Streptomycin ergänzt. Mehrere nachgebildete Gerichte werden zubereitet.</li>
	<li>Tag 2-3. Wenn Zellen in Subkonfluenz sind, transfezieren Sie die Hälfte der Gerichte mit dem...

<ol>
	<li>Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+insights+into+gonadotropin+hormone+receptor+dimerization+and+oligomerization.">Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization.</a> Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).</li><li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited:+functional+and+pharmacological+perspectives.">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).</li><li>Marsango, S., Ward, R. 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N&B erfordert mehrere Vorsichtsmaßnahmen bei der Wahl des Zellmodells und der Kennzeichnungsstrategie. Sie kann nur auf lebende Zellen angewendet werden, die während der Bildaufnahmezeit stabil haften bleiben. Zusätzliche Schwankungen durch die gesamte Zelle starre Verschiebung kann mit entsprechenden Bildwiederherstellungsansätzen38behandelt werden. Wenn sich jedoch eine Zelle bewegt, verformt sich die Zellmembran ebenfalls, und die Strukturverformung führt zu einer erheblichen zusätzlichen...

Wir beschreiben einen Bildansatz der totalen inneren Reflexionfluoreszenz-Anzahl und Helligkeit (TIRF-N&B) zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von Rezeptormolekülen an der Plasmamembran lebender Zellen mit dem Ziel, die Rezeptor-Baugruppe zu verknüpfen. Dynamik zur biologischen Funktion der Proteine (Abbildung 1).
Bei extrazellulärer Ligandenbindung initiieren Rezeptoren die intrazelluläre Signaltransduktion in Abhängigkeit von ihrer Konformation, Oligomerisierung, potenziellen Co-Rezeptoren und Membranzusammensetzung. Trotz der Bedeutung und Allgegenwart der Rezeptor-Oligomerisierung, anerkannt als schlüsseleines Ereignis in der zellulären Signalisierung1,2,3,4,5,6, 7können nur wenige Methoden Clustering-Ereignisse erkennen und den Grad des Clusterings experimentell messen8,9. Das konfokale Volumen (x,y bei 300 nm, z x 900 nm) ist für den Nachweis der molekularen Interaktion und Stoichiometrie nicht ausreichend aufgelöst, auch nach der Optimierung durch Bildwiederherstellungsalgorithmen10. Die Untereinheitszusammensetzung von Proteinoligomeren kann nicht auch nur durch Superauflösungsmethoden bei einer Auflösung von 20-70 nm wie PALM11, STORM12und STED13rein räumlich gelöst werden. Darüber hinaus kann ihre zeitliche Auflösung (in der Reihenfolge von Minuten pro Bild) der Kinetik im Sekundenbereich nicht folgen. Einzelne Molekül-Stepbleichung löst die Stoichiometrie von Protein-Oligomeren nur, wenn sie unbeweglich sind14.
Eine der vielseitigsten Methoden zur Messung der Dichte und Oligomerisierung fluoreszierender Proteine in Einzelbildern ist die räumliche Intensitätsverteilungsanalyse (SpIDA), die auf räumlicher Probenahme beruht. Es ist sowohl auf chemisch fixierte als auch auf lebende Zellen anwendbar und ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Interessenbereiche der Zelle mit Standardfluoreszenzmikroskopie15. Alternativ eignen sich Momentmethoden wie Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS)16, Photonenzählhistogramm (PCH)17und Zahl und Helligkeit (N&B)18,19, für quantitative oligomere Messungen. Diese Methoden analysieren die Fluoreszenzintensitätsschwankungen, die in der Zeit beobachtet werden können, wenn die Fluorophore in und aus einem Beleuchtungsvolumen diffundieren. Die Amplituden der Intensitätsschwankungen können eindeutig durch die molekulare Helligkeit des Fluorophors () und die durchschnittliche Anzahl der Fluorophore (n) innerhalb des Beleuchtungsvolumens17 (Abbildung 2) beschrieben werden. Typischerweise können der Diffusionskoeffizient der Fluorophore und die durchschnittliche Anzahl der Moleküle (umgekehrt bezogen auf den G(0)-Wert) innerhalb des Beleuchtungsvolumens durch FCS20ermittelt werden. Da die Diffusionszeit jedoch nur mit der kubischen Wurzel der Masse skaliert, ist FCS nicht empfindlich genug, um Veränderungen in der Molekularmasse21zu erkennen. In der Praxis kann einfarbiges FCS die Dimerisierung von Membranrezeptoren nicht erkennen. PCH löst Mischungen verschiedener Oligomere genau auf. Mit mehr als zwei Momenten der Amplitudenverteilung erkennt es Moleküle unterschiedlicher Helligkeit, die das gleiche Beleuchtungsvolumen belegen. Scannen von FCS22 und Entwicklungen, wie z. B. der interessante Paarkorrelationsansatz der molekularen Helligkeit (pCOMB)23, eingeführt, um den Alikatbereich der Anwendbarkeit von Fluoreszenzkorrelationsmethoden in biologischen Systemen zu erweitern24 bleiben Einzelpunktmethoden, denen die Fähigkeit zu schnellen Messungen in einem großen Zellbereich fehlt, was viele aufeinander folgende Beobachtungen an jedem Pixel und die Datenerfassung in der Reihenfolge von Sekunden erfordert.
N&B ist eine vereinfachte Version von PCH, die nur den ersten und zweiten Moment der Amplitude der Fluoreszenzverteilung berücksichtigt, nämlich die mittlere Intensität, , und die Varianz,2 (Abbildung 2)18,19 und aus diesem Grund kann sie den mollaren Anteil unbekannter Oligomere in einer Mischung nicht bestimmen, sondern schätzt nur den durchschnittlichen Oligomerisierungszustand der Mischung. Dennoch hat N&B den Vorteil, mit relativ kleineren Zeitreihen von Bildern von Lebendenzellen als PCH pixelweise zu arbeiten, indem einfach die Zeitlichen schwankungen der Fluoreszenzintensität überwacht werden. Da N&B die Zeit pro Pixel auf wenige Mikrosekunden reduziert, kann es einer schnellen Oligomerisierungskinetik über große Zellbereiche folgen und eine Bildaufnahme auf einer Zeitskala von Sekunden in der Raster-Scanmikroskopie (z. B. konfokale, 2-photon) und Millisekunden ermöglichen. in der kamerabasierten Mikroskopie (z.B. TIRFM).
Mehrere Berichte haben die Fähigkeit von N&B gezeigt, die Anzahl der Untereinheiten in Proteinclustern zu quantifizieren, indem erweiterte Zellregionen geabbildungen. Paxillin-EGFP-Cluster wurden an den Haftstellen in den CHO-K1-Zellen25nachgewiesen und die intrazelluläre Aggregation des pathogenen Httex1p-Peptids in COS-7-Zellen26beschrieben. N&B wurde nach der Liganden-gesteuerten Oligomerisierung des ErbB-Rezeptors27und der Wirkung des Liganden FGF21 auf Klothob (KLB) und FGFR1c in den HeLa-Zellen28angewendet. Die Kombination von TIRF-Bildgebung und N&B-Analyse wurde verwendet, um zu zeigen, dass Dynamin-2 in erster Linie tetramerisch in der gesamten Zellmembran29ist. Wir haben N&B sowohl auf Raster-Scanning als auch auf TIRF-Bilder angewendet, um die Liganden-gesteuerte Dimerisierung von uPAR- und FGFR1-Zellmembranrezeptoren30,31zu beweisen.
Fluoreszenzkorrelationsmethoden wie N&B, FCS und PCH basieren auf der Vorstellung, dass in einem offenen Volumen die Besatzungszahl der Teilchen einer Poisson-Verteilung folgt. Da nur die Photonen, die die Fluorophore emittieren, erkannt werden können, ist der Mittelwert <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> </img>für eine gemessene Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Zeit in einem Pixel des Bildes, das Produkt der durchschnittlichen Anzahl von Fluorophoren im Beleuchtungsvolumen, n, und molekulare Helligkeit, Nr.17:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
wobei die Anzahl der Photonen, die pro Zeiteinheit (konventionell pro Sekunde) pro Molekül emittiert werden, wenn sich das Molekül im Zentrum des Beleuchtungsvolumens befindet.
Helligkeit ist eine Eigenschaft jedes Fluorophors in einer bestimmten Anschaffung eingerichtet, während Intensität ist die Summe aller Beiträge aus allen Fluorophoren. In biologischen Wettbewerben wird die Helligkeit mit der Zunahme der Anzahl der Fluorophore, die zusammen schwanken, zunehmen, was Informationen über den Oligomerisierungszustand des fluoreszierend getaggten Proteins gibt. Die Fluktuationsamplituden an einem bestimmten Pixel werden anhand der Varianz des Fluoreszenzsignals gemessen,2:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
Wobei der Mittelwert des Quadrats der Intensität <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> </img>, und das <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> </img>Quadrat des Mittelwerts der Intensität , aus den individuellen Intensitätswerten in jedem Pixel jedes Frames berechnet werden:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
wobei K die Anzahl der Gesamtframes in der Zeitreihe ist. Experimentell ist es notwendig, für die gesamte Bildreihe die Varianz zu berechnen, die die Streuung der einzelnen Intensitätswerte an jedem Pixel eines einzelnen Bildes um den mittleren Intensitätswert beschreibt. Die Varianz umfasst alle Schwankungen unterschiedlicher Herkunft. In einer ersten Annäherung kann die Varianz durch die diffundierenden Partikel im Beleuchtungsvolumen,20, durch das Detektor-Schussrauschen von der Varianz getrennt werden,2d. Die beiden Varianzen sind unabhängig; somit wird die Gesamtabweichung durch ihre Summe angegeben:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
Die Varianz aufgrund molekularer Schwankungen im und aus dem Nachweisvolumen ist linear abhängig von der molekularen Helligkeit und Intensität:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
Neuanordnung eq. 6 nach 1q. 1:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
Nach dem typischen Konzept der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie besagt Gleichung 7, dass die Varianz aufgrund der Anzahl der Schwankungen vom Quadrat der Partikelhelligkeit abhängt.
Dann ist die Varianz aufgrund von Detektorschwankungen eine lineare Funktion der erfassten Intensität, unter der Annahme, dass der Detektor unterhalb seiner Sättigungsgrenze19betrieben wird:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
Bei Photonenzähldetektoren a=1 und c=0 entspricht die Detektorvarianz also der durchschnittlichen Intensität:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
Um diese Konzepte auf reale Messungen in lebenden Zellen anzuwenden, definieren Gratton und Kollegen18 die scheinbare Helligkeit B für jedes Pixel als Verhältnis der Varianz zur durchschnittlichen Intensität:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B ist der Parameter, der experimentell gemessen wird. In dieser Arbeit werden Zeitreihenbilder von FGFR1-Rezeptoren an der Plasmamembran von HeLa-Zellen durch die TIRF-Mikroskopie erfasst und die durchschnittliche scheinbare Helligkeit B wird durch die N&B-Analyse bestimmt. Dann, nach Zugabe von FGF2, werden aufeinander folgende Zeitreihen erfasst, um die Veränderungen in der Selbstmontage der Rezeptormoleküle in der Membranoberfläche nach der Stimulation des Rezeptors mit dem kanonischen Liganden zu verfolgen.
Da es sich bei dem Detektor des TIRF-Mikroskops jedoch um eine EMVD-Kamera handelt, muss der Ausdruck für die scheinbare Helligkeit als19geändert werden:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
wobei der Offset der Intensitätsausgleich der Erkennungselektronik ist, der ein Merkmal der Detektoreinstellungen ist. Die Varianz und die durchschnittliche Intensität eines analogen Detektors werden jeweils angegeben durch:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
wobei G die analoge Verstärkung in digitalen Pegeln (DL/Photonen), S, die digitalen Pegel pro Photon19, durch die Steigung eines Intensitäts-Gegen-Varianzdiagramms für eine Lichtquelle mit konstanter Intensität (keine zeitlichen Schwankungen) angegeben wird. Der Faktor ist mit der Form des Pixelerkennungsvolumens verknüpft. Nach Hassler et al.32beträgt der Faktor 0,3 für die TIRF-Bildgebung, die mit der maximalen Verstärkung der Detektionskamera19arbeitet. Die Offset-, S- und G-Parameter sind Merkmale der Kamera und des Mikroskops. Die scheinbare Helligkeit B wird durch Neuanordnung von 11 nach 12 und 13 erreicht:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
Experimentell ist die s eine komplexe Funktion der Laserintensität und der Detektionseffizienz des Systems. Da B/S jedoch linear von der Abhängigkeit von - abhängig ist, ist es nur wichtig, den relativen Wert von . für einen bestimmten Erkennungsmodus zu bestimmen:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
wobei das S' proportional zu . Dennoch wird eine Kalibrierung mit einem internen Verweis durchgeführt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum 98% minimun</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>21063029</td>
			<td>Used serum free for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high-glucose GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>Used for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0515-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitting system Photometrics DV2</td>
			<td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td>10% inactivated supplement for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes</td>
			<td>MatTek, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>uncoated, glass thickness 0.17 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells</td>
			<td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CB_08011102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software</td>
			<td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td>
			<td></td>
			<td>This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&#38;B time series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Executable N&#38;B routine</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab v.2018b</td>
			<td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x</td>
			<td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td>
			<td>LONZA 17-602E</td>
			<td>supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100&#181;g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector</td>
			<td>Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td>Zamai et al., 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGF2</td>
			<td>PeproTech EC, Ltd., London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate GIBCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>1mM supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIt-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid 10 mL</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513 859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM2618</td>
			<td>0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis

Trotz der Bedeutung und Allgegenwart der Rezeptor-Oligomerisierung sind nur wenige Methoden zum Erkennen von Clustering-Ereignissen und zur Messung des Clustering-Grades anwendbar. Hier beschreiben wir einen bildgebenden Ansatz zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von mEGFP-getaggten Rezeptor-Homokomplexen in der Membran lebender Zellen. Das Protokoll basiert auf der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie in Kombination mit der Number and Brightness (N&B)-Analyse. N&B ist eine Methode ähnlich der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) und dem Photonenzählhistogramm (PCH), die auf der statistischen Analyse der Schwankungen der Fluoreszenzintensität von Fluorophoren basieren, die in und aus einer Beleuchtung diffundieren. Volumen während einer Beobachtungszeit. Insbesondere ist N&B eine Vereinfachung von PCH, um Informationen über die durchschnittliche Anzahl von Proteinen in oligomeren Mischungen zu erhalten. Die Intensitätsschwankungsamplituden werden durch die molekulare Helligkeit des Fluorophors und die durchschnittliche Anzahl von Fluorophoren innerhalb des Beleuchtungsvolumens beschrieben. N&B berücksichtigt daher nur den ersten und zweiten Moment der Amplitudenverteilung, nämlich die mittlere Intensität und die Varianz. Dies ist gleichzeitig die Stärke und schwächelinde Methode. Da nur zwei Momente berücksichtigt werden, kann N&B den molaren Anteil unbekannter Oligomere in einer Mischung nicht bestimmen, sondern schätzt nur den durchschnittlichen Oligomerisierungszustand der Mischung. Dennoch kann es auf relativ kleine Zeitreihen (im Vergleich zu anderen Momentmethoden) von Bildern von lebenden Zellen pixelweise angewendet werden, einfach durch die Überwachung der Zeitschwankungen der Fluoreszenzintensität. Es reduziert die effektive Zeit pro Pixel auf wenige Mikrosekunden, wodurch die Erfassung im Zeitbereich von Sekunden bis Millisekunden möglich ist, was für eine schnelle Oligomerisierungskinetik erforderlich ist. Schließlich können große Zellbereiche sowie subzelluläre Kompartimente erkundet werden.

Die Ergebnisse für zwei repräsentative HeLa-mEGFP-FGFR1-Zellen, die in derselben Kulturschale gesät sind, sind in Abbildung 5 und Ergänzender Tabelle 1dargestellt. Die beiden Zellen wurden zum Zeitpunkt 0 min(Abbildung 5A, oben) und 7 min (Abbildung 5A, unten) nach Zugabe des FGF2-Ligands erfasst.
<p class="jove_content" fo:keep-together.with...

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Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Wir beschreiben einen bildgebenden Ansatz zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von mEGFP-getaggten Rezeptor-Oligomeren, die durch Ligandenbindung in der Plasmamembran lebender Zellen induziert werden. Das Protokoll basiert auf der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie in Kombination mit der Number and Brightness (N&B)-Analyse.

Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Rezeptor-Clustering ist allgegenwärtig und oft notwendig für die Signalisierung einer Kaskadenaktivierung. Es stehen jedoch nur wenige Methoden zur Verfügung, um den Grad der Clusterbildung zu messen. Wir verwenden die gesamte interne Reflexionsfluoreszenz, die TIRF-Mikroskopie, um die Diffusion von FGFR1-mEGFP-Molekülen in der Plasmamembran lebender Zellen zu verfolgen.Dann wenden wir die Zahlenhelligkeit, die N&B-Analyse, an, um die Dynamik des stimulierten Rezeptorclusterings zu beschreiben. TIRF ist ideal für die schnelle zeitliche Abbildung molekularer Ereignisse, die in der Nähe der Zelloberfläche auftreten, während N&B den durchschnittlichen oligomeren Zustand von fluoreszierenden Molekülen bestimmt, basierend darauf, wo die Diffusion in und aus dem Beleuchtungsvolumen des Mikroskops erfolgt. Tatsächlich ist dies ein Werkzeug, um die räumliche zeitliche Organisation der Rezeptoren an der Zelloberfläche zu verbinden, wo sie signalisieren.N&B benötigt nur den Zugang zu einem Mikroskop mit einem schnellen Erfassungsmodul. Sie können große Flächen von lebenden Zellen analysieren, die nur über die Grundlegendenkenntnisse der Fluoreszenzfluktuationsmethoden verfügen. Diese Methode kann auf Proteine angewendet werden, die Dimere oder Cluster bilden und stoichiometrisch mit dem Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet werden können.Wenn sich die Proteine in intrazellulären Kompartimenten befinden, werden andere Arten von Mikroskopen zum Erfassen der Bilder verwendet. Es ist wichtig, ein Konstrukt vorzubereiten, das die monomere Form des Fluorophors zum Messen unter experimentellen Bedingungen die reine monomere Helligkeit als Steuerung ausdrückt. Am ersten Tag samen HeLa-Zellen in 1,5 Milliliter n. Medium mit einer Konzentration von 100.000 bis 200.000 Zellen pro Milliliter in Glasbodenschalen.Samen sechs bis acht replizieren Gerichte, und in einem Brutkasten bei 37 Grad Celsius brüten. Am zweiten oder dritten Tag haben die Zellen die Subkonfluenz erreicht. Fügen Sie der Hälfte der Gerichte ein serumfreies Medium mit Proteinplasmid hinzu und fügen Sie referenziden Plasmide mit dem Monomer und Dimer in die zweite Hälfte der Gerichte ein, um die Zellen zu transfekten.Überprüfen Sie nach einem Tag, ob die transfizierten Zellen an der Unterseite des Geschirrs haften und die Zellmembran fluoreszierend ist. Entsorgen Sie Gerichte mit überwucherten Zellen oder mit sehr geringer Fluoreszenz. Aktivieren Sie vier Stunden vor dem Experiment den Temperatur-Inkubator des Mikroskops bei 37 Grad Celsius.Schalten Sie das Mikroskop, Computer und Kameras ein und warten Sie, bis die Kameras die richtige Arbeitstemperatur von minus 75 Grad Celsius erreichen. Legen Sie einen kleinen Tropfen Öl auf die Objektivlinse. Legen Sie eine Probeschale in den Inkubator des Mikroskops, und schließen Sie die Türen des Inkubators, um die Temperatur der Schale für 10 Minuten ausdemieren zu lassen.Schalten Sie die Epifluoreszenzlampe und den 488-Nanometer-Laser ein. Wählen Sie den Epifluoreszenzkontrastmodus aus, um die Probe zu untersuchen, und suchen Sie eine Zelle, um sie von der Augenlinse aus zu fokussieren. Wählen Sie den richtigen Filter für die Erfassung der grünen Emission durch die Mikroskopkamera mit Bandpass Ex 490/20 500 und Bandpass Em 525/50 oder ähnlich.Wechseln Sie im Epifluoreszenzmodus vom Okular zum Nockenbericht. Verfeinern Sie den Fokus, und wechseln Sie in den TIRF-Modus. Aktivieren Sie dann die automatische Ausrichtung gemäß den Anweisungen des TIRF-Mikroskops.Wählen Sie eine geeignete Beleuchtungstiefe und optimieren Sie die Richtung des vereisten Feldes. Wechseln Sie zu einer zweiten Kamera. Definieren Sie einen Interessenbereich von mindestens 256 x 256 Pixeln.Stellen Sie die Belichtungsposition auf eine Millisekunde und die EM-Verstärkung auf 1.000 ein. Stellen Sie die Laserleistung auf 0,5 Milliwatt ein. Es ist notwendig, einige Informationen über den Diffusionskoeffizienten des Proteins zu haben, da die Expositionszeit kürzer sein muss als die durchschnittliche Zeit, die von den fluoreszierenden Molekülen im luminaten Volumen verbracht wird.Führen Sie eine erste Testsequenz unter Anfangsbedingungen aus, und schätzen Sie grob den Signal-Rausch-Wert. Die Bedingungen sind bei Signal-Rausch-Wert von zwei bis drei oder höher, gemessen in der ersten Zeitreihe, akzeptabel. Verwenden Sie dann den Schieberegler des Emissionstrennsystems, das die Kamera Nummer zwei mit dem Mikroskop verbindet, um eine Seite des Bildes zu maskieren.Wählen Sie die Option zum automatischen Speichern der Kameradatei aus. Starten Sie die Erfassung der Bildreihe für mindestens 700 Bilder bei einem minimalen Signal-Rausch-Verhältnis von zwei. Ohne die Schale aus dem Mikroskop zu nehmen, fügen Sie den Liganden hinzu.Wählen Sie eine Zelle mit einer hellen Fluoreszenzmembran aus, und starten Sie schnell die erste Zeitreihe des kinetischen Laufs. Suchen Sie eine zweite Zelle, und erfassen Sie den zweiten Zeitpunkt der Kinetik. Erfassen Sie eine neue Zelle für jeden Zeitpunkt des kinetischen Laufs.Wiederholen Sie für jede neue Schale die Ausrichtung der Laserlinie und die Optimierung der TIRF-Beleuchtung. Konvertieren und speichern Sie nun die mit der Kamerasoftware erfassten Bilddateien als tif-Dateien. Importieren Sie tif-Dateien in die Analysesoftwareroutine, indem Sie das grafische N&B-Benutzerinterphase-MATLAB aktivieren.Discard-Serien, bei denen das durchschnittliche Intensitätsprofil mehr als 10% Photobleaching und Serien zeigt, in denen es während der Erfassung eine offensichtliche Zellmembranverzerrung oder -übersetzung gegeben hat. Zuschneiden von Rahmen, die offensichtlich nicht im Fokus stehen. Halten Sie für die Analyse nur Serie mit mindestens 500 Zeitrahmen.Bestimmen Sie zunächst die Kameraparameter. Aktivieren Sie die Routine-Kalibrierkamera. Wählen Sie einen Bereich von mindestens 20 x 50 Pixeln im Geräuschbereich des Detektors aus.Bewegen Sie im Diagramm Protokollfrequenz im Vergleich zum Diagramm der digitalen Ebene den linearen roten Cursor, um den Gaußschen im linearen Teil der Kurve abzugrenzen. Aktivieren Sie die B-Taste. Wenden Sie eine Mindestbinning von 2,2 an, um die Streuung der Daten zu reduzieren und das B-I-Histogramm zu erzeugen.Verwenden Sie den iterativen quadratischen Cursor, um das B-I-Histogramm zu überprüfen. Wählen Sie einen quadratischen ROI für die Analyse aus, und generieren Sie die B-Karte des ausgewählten ROI. Speichern Sie dann die ASCII-Datei der Der Auswahl zugeordneten B-Werte.Importieren Sie den ASCII in eine Grafiksoftware, um die Frequenzverteilung der Daten zu berechnen und den durchschnittlichen B-Wert plus oder minus S.E. Zu erhalten. Wenden Sie die Epsilongleichung an, um die durchschnittliche Helligkeit für jede Zelle zu jedem Zeitpunkt des kinetischen Laufs abzuleiten. Normalisieren Sie die Daten gemäß der Normalisierungsgleichung, wobei B't der durchschnittliche B-Wert ist, der zum Zeitpunkt t nach Ligandaddition gemessen wird, und B'0 der durchschnittliche B-Wert ist, der zum Zeitpunkt t gleich Null gemessen wird, was 10 bis 20 Sekunden nach Ligand-Additino entspricht. Zeichnen Sie die normalisierte durchschnittliche Helligkeit im Vergleich zur Erfassungszeit, um den kinetischen Lauf zu erstellen.In dieser Studie werden hier repräsentative Ergebnisse von zwei HeLa-Zellen in derselben Schale gezeigt, die mEGFP-FGR1 zum Zeitpunkt Null und sieben nach Zugabe von 20 Nanogramm pro Milliliter FGF2 exemittieren. Verglichen mit den Referenzkonstrukten GPI-mEGFP und GPI-mEGFP-mEGFP dimer zeigt die gesamte Analysesequenz die durchschnittliche Intensität der Zeitreihen. Plot aller B-Werte.B-I Histogramm. B-Karte des gewählten ROI. Und das zugehörige B-Verteilungshistogramm.Nach der Stimulation mit 20 Nanogramm pro Milliliter FGF2 beschreiben repräsentative kinetische Läufe, die die durchschnittliche Helligkeit zeigen, da die Zeitfunktion den langsamen Prozess der Dimerisierung beschreibt, der mehrere Minuten an der Zelloberfläche anhält. Bei stimulationmitiert mit 50 Mikrogramm pro Milliliter NCAM-Fc zeigt das kinetische Profil schnelle und zyklische Übergänge des Rezeptors in oligomeren Mischungen, die auch Helligkeitswerte über denen des Dimers erreichen. Ein normalisierter Mittelwert von drei wird wiederholt beobachtet.Es ist wichtig, die zusätzlichen Varianten durch keine molekularen Schwankungen und Bleichen zu minimieren. Und die Zellen müssen gut an der Glasbodenschale haften, nicht überwuchert und nicht aufgetürmt werden. Wenn wir an einem Protein interessiert sind, das schneller in intrazellulären Fächern diffundiert, können wir schneller Null-Zeiten anwenden und das Scannen an Fokal- oder Multiphotonenmikroskopen verwenden, um in der Zelle zu fotografieren.Mit unserem Ansatz minimieren wir die schädlichen Auswirkungen der Photobleaching, wenn wir die Dynamik von Ereignissen wie Dimerisierung erforschen wollen. Diese Ereignisse steuern eine Vielzahl von zellulären Reaktionen und sind sehr schwierig, in lebenden Zellen mit anderen Techniken zu beweisen.

Research

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