Name: oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

CNIC נתמך על ידי משרד של Ciencia, מרכז האוניברסיטה והקרן הפרו CNIC, והוא המרכז המרכזי של אוצ'ואה מצוינות (צב-2015-0505). אנחנו גם נתמכים על ידי הקרן האירופית לפיתוח האזור (פדר) "אונה סון נרה דה האג אירופה". אוניברסיטת קליפורניה מכירה בתמיכה של האגודה לחקר הסרטן הבינלאומי (הידוע כיום כ מחקר הסרטן העולמי), ומשרד הבריאות האיטלקי. א. ש. מכירה בעמותת "פוננדאלקה דל מונטה די לומברדיה" לתמיכה חלקית בעבודתו עם מלגת PV "המקצוענים בצ" 2011-2012.

1. הכנה לדוגמא
<ol><li>. היום הראשון זרעים הלה התאים בינוני מלא בריכוז של 100,000-200000 cell/mL במנות התחתון זכוכית. . זרע 6-8 משכפל מנות הערה: בדוגמה זו, המדיום הוא שיושלם עם 10% חום בלתי מופעל סרום שור העוברי (FBS), 1 mM נתרן פירובט, 100 U/100 μg פניצילין/סטרפטומיצין. מספר מנות שכפול מוכנות.</li>
	<li>. היום 2-3 ?...

<ol>
	<li>Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+insights+into+gonadotropin+hormone+receptor+dimerization+and+oligomerization.">Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization.</a> Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).</li><li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited:+functional+and+pharmacological+perspectives.">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).</li><li>Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+receptor+oligomerization.">Muscarinic receptor oligomerization.</a> Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).</li><li>Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+Receptor+Signaling:+Impact+of+Receptor+Oligomerization+on+Receptor+Function.">Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).</li><li>Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+oligomerization:+functional+considerations.">Chemokine receptor oligomerization: functional considerations.</a> Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).</li><li>Van Craenenbroeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+oligomerization:+contribution+to+receptor+biogenesis.">GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis.</a> Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).</li><li>Wnorowski, A., Jozwiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-+and+hetero-oligomerization+of+beta2-adrenergic+receptor+in+receptor+trafficking,+signaling+pathways+and+receptor+pharmacology.">Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology.</a> Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).</li><li>Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+methods+to+study+membrane+receptor+oligomerization.">Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization.</a> Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).</li><li>Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+complementation+assays:+new+tools+to+study+G+protein-coupled+receptor+oligomerization+and+GPCR-mediated+signaling.">Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).</li><li>Trussell, H. J., et al., Trussell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Academic Press Library in Signal Processing. 4, 3-9 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+dendritic+spines+by+STED+microscopy.">Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).</li><li>Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+accurately+locate+and+count+large+numbers+of+steps+by+photobleaching.">A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).</li><li>Godin, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+protein+oligomerization+and+densities+in+situ+using+spatial+intensity+distribution+analysis.">Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).</li><li>Qian, H., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+molecular+aggregation+by+analysis+of+fluctuation+moments.">Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).</li><li>Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photon+counting+histogram+in+fluorescence+fluctuation+spectroscopy.">The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).</li><li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode.">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).</li><li>Unruh, J. R., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+concentration+and+brightness+from+fluorescence+fluctuation+data+with+an+electron+multiplied+CCD+camera.">Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera.</a> Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).</li><li>Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+chemical+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+review.">Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review.</a> Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).</li><li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy.">Fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li><li>Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+FCS,+a+novel+method+for+three-dimensional+particle+tracking.">Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking.</a> Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).</li><li>Hinde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+dynamics+of+the+oligomeric+transcription+factor+STAT3+by+pair+correlation+of+molecular+brightness.">Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness.</a> Nature Communications. 7, 11047 (2016).</li><li>Waithe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+processing+and+analysis+of+conventional+confocal+microscopy+generated+scanning+FCS+data.">Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data.</a> Methods. 140-141, 62-73 (2018).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Ossato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+path+to+inclusion+formation+of+huntingtin+peptides+revealed+by+number+and+brightness+analysis.">A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).</li><li>Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+resting+and+ligand-bound+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases+in+living+cells+using+number+and+brightness+analysis.">Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).</li><li>Ming, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Distribution+of+Klothobeta+(KLB)+and+fibroblast+growth+factor+receptor-1+(FGFR1)+in+living+cells+reveal+the+fibroblast+growth+factor-21+(FGF21)-induced+receptor+complex.">Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).</li><li>Ross, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+state+of+dynamin+2+in+cell+membranes+using+TIRF+and+number+and+brightness+analysis.">Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).</li><li>Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+brightness+image+analysis+reveals+ATF-induced+dimerization+kinetics+of+uPAR+in+the+cell+membrane.">Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane.</a> FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).</li><li>Zamai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+brightness+analysis+reveals+that+NCAM+and+FGF2+elicit+different+assembly+and+dynamics+of+FGFR1+in+live+cells.">Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells.</a> Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).</li><li>Hassler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+correlation+spectroscopy+(TIR-FCS)+with+low+background+and+high+count-rate+per+molecule.">Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule.</a> Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).</li><li>Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fast+fluorescence+imaging+to+molecular+diffusion+law+on+live+cell+membranes+in+a+commercial+microscope.">From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).</li><li>Beenken, A., Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FGF+family:+biology,+pathophysiology+and+therapy.">The FGF family: biology, pathophysiology and therapy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).</li><li>Joubert, J., Sharma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+digital+imaging.">Light microscopy digital imaging.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2011).</li><li>Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIRF+microscopy+evanescent+field+calibration+using+tilted+fluorescent+microtubules.">TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules.</a> Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).</li><li>Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+incidence+angle+for+through-the-objective+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).</li><li>Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+limits+and+data+correction+in+number+of+molecules+and+brightness+analysis.">Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis.</a> Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).</li><li>Caiolfa, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomer-dimer+dynamics+and+distribution+of+GPI-anchored+uPAR+are+determined+by+cell+surface+protein+assemblies.">Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies.</a> Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).</li><li>Campbell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+red+fluorescent+protein.">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).</li><li>Cutrale, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+enhanced+number+and+brightness+to+measure+protein+oligomerization+dynamics+in+live+cells.">Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells.</a> Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).</li><li>Dunsing, V., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence+Fluctuation+Spectroscopy+Assay+of+Protein-Protein+Interactions+at+Cell-Cell+Contacts.">A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li></ol>

N & B דורש מספר אמצעי זהירות בבחירת דגם התא ואסטרטגיית התוויות. ניתן להחיל אותו רק על תאים חיים שנשארים ללא הפסק בזמן לכידת התמונה. תנודות נוספות בשל העקירה הנוקשה של התא כולו עשוי להיות מטופל עם גישות שחזור התמונה המתאים38. עם זאת, בדרך כלל כאשר התא זז, קרום התא גם deforms, ואת מבנה דפ...

אנו מתארים כולל השתקפות פנימית מספר ובהירות (TIRF-N & B) גישה להדמיה לקביעת מצב oligomeric הממוצע של מולקולות הקולטן בקרום פלזמה של תאים חיים, מכוון בקישור הרכבה הקולטן דינמיקה לתפקוד הביולוגי של החלבונים (איור 1).
עם ליגתאי ומחייב, קולטנים ליזום את האות תאיים התמרה האותות בהתאם הקונפורמציה שלהם, oligomerization, שיתוף הפוטנציאלי קולטנים והרכב קרום. למרות החשיבות והייתה של קולטן oligomerization, מוכר כאירוע מפתח באיתות סלולרי1,2,3,4,5,6, 7, כמה שיטות יכול לזהות אירועים באשכולות ולמדוד את מידת הניסויים באשכולות8,9. כרך קונפוקלית וקד (x, y ≈ 300 ננומטר, z ≈ 900 nm) הוא פתר מספיק להוכחת אינטראקציה מולקולרית וסטויכמטריה, גם לאחר אופטימיזציה על ידי אלגוריתמים שיקום התמונה10. הרכב התת-יחידתי של חלבון oligomers אינו ניתן לפענוח על בסיס מרחבי גרידא גם על ידי שיטות ברזולוציה גבוהה ב-x, y ברזולוציה של 20-70 ננומטר כגון PALM11, סטורם12, ו ההיסטד13. יתר על כן, הרזולוציה הטמפורלית שלהם (בסדר של דקות לכל תמונה) לא יכול לעקוב אחר הקינטיקה בטווח של שניות. מולקולה בודדת צעד הלבנת פותרת את סטויכיומטריה של oligomers חלבון רק אם הם משותק14.
אחת השיטות הרב-תכליתיות ביותר כדי למדוד צפיפות ו oligomerization של חלבונים מתויגים פלואורוסקופים בתוך תמונות בודדות היא התפלגות בעוצמה מרחבית ניתוח (SpIDA), אשר נשענת על דגימה מרחבית. הוא חל על תאים כימיים קבועים ולחיות, ומאפשר ניתוח של מספר אזורים של העניין של התא בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ קרינה רגילה15. לחילופין, שיטות רגע, כגון ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית (fcs)16, היסטוגרמה לספירת פוטון (PCH)17, ומספר ובהירות (N & B)18,19, מתאימים לאולייומר כמותית דידות. שיטות אלה לנתח תנודות בעוצמה פלואורסצנטית כי ניתן להבחין בזמן כאשר fluorophores לפזר והחוצה של נפח התאורה. המוני התנודות באינטנסיביות ניתן לתאר באופן ייחודי על-ידי הבהירות המולקולרית של הזוהר (ε) והמספר הממוצע של fluorophores (n) בתוך כרך התאורה17 (איור 2). בדרך כלל, מקדם דיפוזיה של fluorophores ואת המספר הממוצע של מולקולות (הקשורים באופן הפוך לערך G (0) בתוך עוצמת התאורה ניתן להשיג על ידי FCS20. עם זאת, מאז זמן הדיפוזיה רק עם השורש העוקב של המסה, FCS אינו רגיש מספיק כדי לזהות שינויים במסה מולקולרית21. בפועל, לצבע אחד FCS אין אפשרות לזהות הדיסמזציה של קולטני הממברנה. PCH פותר תערובות של oligomers שונים במדויק. באמצעות יותר משני רגעים של התפלגות משרעת, הוא מזהה מולקולות של בהירות שונה התופסים את אותו נפח תאורה. סריקת FCS22 ופיתוחים, כגון מתאם זוג מעניין של בהירות מולקולרית (pcomb) גישה23, הציג כדי להאריך את מגוון הישימות של שיטות מתאם פלואורסצנטית במערכות ביולוגיות24 , השארו שיטות חד שונות חסרות יכולת של מדידות מהירות בשטח גדול של תא, הדורשות תצפיות רצופות רבות בכל פיקסל ורכישת נתונים בסדר השניות.
N & B הוא גרסה פשוטה של PCH הרואה רק את הרגעים הראשונים והשני של משרעת התפלגות הזריחה, כלומר את העוצמה ממוצע, < אני >, ואת השונות, σ2 (איור 2)18,19 ובגלל זה, זה לא יכול לקבוע את החלק הטוחנת של oligomers לא ידוע בתערובת, אבל רק מעריך את המצב הממוצע oligomeriטיזציה של התערובת. עם זאת, N & B יש את היתרון של עבודה עם סדרת זמן קטן יחסית של תמונות של תאים חיים מאשר PCH על בסיס פיקסל על ידי פיקסל, פשוט על ידי ניטור תנודות בזמן של עוצמת הקרינה. כיוון ש-N & B מפחית את הזמן בפיקסל למספר מיקרו-שניות, הוא יכול לעקוב אחר מהירות הקינטיקה המנותרת באזורי תאים גדולים, ולאפשר רכישת תמונה בסרגל זמן של שניות במיקרוסקופ סריקת רסטר (למשל, confocal וקד, 2-פוטון) ואלפיות השניה במיקרוסקופיה המבוססת על מצלמה (למשל, TIRFM).
מספר דוחות הפגינו את היכולת של N & B כדי לכמת את מספר יחידות המשנה באשכולות חלבונים על-ידי הדמיה של אזורי תאים מורחבים. אשכולות פעבלין-EGFP זוהו באתרי הדבקה ב-CHO-K1 תאים25, והצבירה התאיים של הפפטיד Httex1p הפתוגניים תוארה ב-COS-7 תאים26. N & B הוחל לאחר oligomerization מונחה ליגאן של הקולטן ErbB27, ואת ההשפעה של ליגFGF21 על קלותוב (klb) ו FGFR1c בתאי הלה28. השילוב של הדמיה TIRF ו-N & B ניתוח שימש כדי להראות כי דינמיות ב-2 היא בעיקר tetrameric לאורך כל קרום התא29. החלתי N & B לשני סריקת רסטר ותמונות tirf להוכיח dimerization מונחה ליגור של upar ו FGFR1 תא קולטנים קרום30,31.
שיטות מתאם פלואורסצנטית, כגון N & B, FCS ו-PCH, מבוססות על הרעיון שבנפח פתוח מספר הכיבוש של החלקיקים עוקב אחר התפלגות פואסון. כי רק את הפוטונים כי פולטות fluorophores ניתן להבחין, ערך ממוצע של עוצמת הזריחה נמדד לעומת הזמן בפיקסל של התמונה <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> </img>,, הוא התוצר של המספר הממוצע של fluorophores נפח התאורה, n, ואת ה בהירות מולקולרית, ε17:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
כאשר ε מבוטא כמספר הפוטונים הנפלטים ליחידת זמן (מקובל לשניה) לכל מולקולה כאשר המולקולה נמצאת במרכז עוצמת התאורה.
בהירות היא תכונה של כל fluorophore ברכישה נתונה להגדיר, בעוד האינטנסיביות הוא הסכום של כל התרומות מכל fluorophores. בתחרויות ביולוגיות, הבהירות יגדל עם הגידול של מספר fluorophores המתאחד יחד, נותן מידע על המצב oligomerization של חלבון fluoresc, מתויג. מגביר תנודות בפיקסל נתון נמדד מן השונות של האות הפלואורסצנטית, σ2:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
כאשר המשמעות של ריבוע העוצמה <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> </img>, והריבוע של העוצמה <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> </img>, מחושבים מערכי העוצמה האינדיווידואליים בכל פיקסל בכל מסגרת:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
כאשר K הוא מספר המסגרות הכוללות בסידרת הזמן. ניסויים, יש צורך לחשב עבור סדרת התמונות כולה את השונות המתארת את פיזור ערכי העוצמה הבודדת בכל פיקסל של תמונה אחת סביב ערך העוצמה הממוצע. השונות כוללת את כל התנודות במקורות שונים. בקירוב ראשון, השונות הנובעת מהחלקיקים הניתנים לפיזור בעוצמת התאורה, σ20, יכולה להיות מופרדת מן השונות עקב רעש שוט הגלאי, σ2ד. שני השונויות הן עצמאיות; לפיכך, השונות הכוללת ניתנת על-ידי הסכום שלהם:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
השונות, עקב תנודות מולקולריות של עוצמת האיתור והיציאה, תלויה בצורה לינארית בבהירות ובעוצמה המולקולרית:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
מסידור מחודש של eq 6 לפי eq .1:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
על פי המושג האופייני ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית, משוואה 7 קובעת כי השונות בשל מספר התנודות תלויה בריבוע של בהירות החלקיקים.
לאחר מכן, השונות עקב תנודות גלאי היא פונקציה קווית של העוצמה שזוהתה, תחת ההנחה כי הגלאי מופעל מתחת למגבלת הרוויה שלה19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
במקרה של גלאים של ספירת פוטון a= 1 ו- c= 0, ולכן שונות הגלאי שווה לעוצמה הממוצעת:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
כדי להחיל מושגים אלה על מדידות אמיתיות בתאים חיים, Gratton ועמיתים18 להגדיר את הבהירות לכאורה, B, עבור כל פיקסל כיחס של שונות על העוצמה הממוצעת:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B הוא הפרמטר הנמדד באמצעות הניסויים. בעבודה זו, סדרת הזמן תמונות של קולטני FGFR1 בקרום פלזמה של תאי הלה נלכדים על ידי מיקרוסקופ TIRF ואת הבהירות לכאורה הממוצעת, B, נקבעת על ידי ניתוח N & B. לאחר מכן, לאחר הוספת FGF2, סדרת הזמן ברציפות נלכדים לבצע את השינויים העצמית הרכבה של מולקולות הקולטן במשטח הקרום לאחר גירוי של הקולטן עם ligand קאנוני.
עם זאת, מאז גלאי המיקרוסקופ TIRF הוא מצלמה EMCCD, הביטוי לבהירות לכאורה צריך להיות שונה19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
כאשר היסט הוא היסט האינטנסיביות של האלקטרוניקה לאיתור שהוא מאפיין של הגדרות הגלאי. השונות והעוצמה הממוצעת עבור גלאי אנלוגי ניתנות בהתאמה על-ידי:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
כאשר G הוא רווח אנלוגי ברמות דיגיטליות (DL/פוטונים), S, הרמות הדיגיטליות לכל פוטון19, ניתנת על ידי השיפוע של עוצמה לעומת מזימה שונות עבור מקור אור עם עוצמה מתמדת (אין תנודות בזמן). הפקטור הγ קשור לצורה של אמצעי האחסון לזיהוי פיקסלים. לדברי האסלר ואח '32, הפקטור γ שווה 0.3 עבור הדמיה tirf עבודה ברווח המקסימלי של מצלמת האיתור19. היסט, S ו-G פרמטרים הם מאפיינים של המצלמה ואת המיקרוסקופ. הבהירות לכאורה, B, מתקבלת על ידי סידור משנה של eq. 11 לפי eq .12 ו -13:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
ניסויים, ε היא פונקציה מורכבת של עוצמת לייזר ויעילות הזיהוי של המערכת. עם זאת, מאחר ש-B/S תלוי באופן ליניארי ב ε, חשוב רק לקבוע את הערך היחסי של ε עבור מצב זיהוי נתון:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
כאשר ε ' הוא פרופורציונלי לε. עדיין, כיול מבוצע באמצעות הפניה פנימית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum 98% minimun</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>21063029</td>
			<td>Used serum free for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high-glucose GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>Used for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0515-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitting system Photometrics DV2</td>
			<td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td>10% inactivated supplement for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes</td>
			<td>MatTek, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>uncoated, glass thickness 0.17 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells</td>
			<td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CB_08011102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software</td>
			<td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td>
			<td></td>
			<td>This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&#38;B time series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Executable N&#38;B routine</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab v.2018b</td>
			<td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x</td>
			<td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td>
			<td>LONZA 17-602E</td>
			<td>supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100&#181;g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector</td>
			<td>Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td>Zamai et al., 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGF2</td>
			<td>PeproTech EC, Ltd., London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate GIBCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>1mM supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIt-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid 10 mL</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513 859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM2618</td>
			<td>0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis

למרות החשיבות והייתה של הקולטן, שיטות מעטות ישימות לגילוי אירועים באשכולות ומדידת מידת הקיבוץ. כאן, אנו מתארים גישה להדמיה כדי לקבוע את המצב oligomeric הממוצע של mEGFP-מתויג-קולטן הומוקומפלקסי בקרום של תאים חיים. הפרוטוקול מבוסס על סך הכל מיקרוסקופ של השתקפות פנימית (TIRF) בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות (N & B). N & B היא שיטה דומה ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית (FCS) והיסטוגרמה ספירת פוטון (PCH), אשר מבוססים על ניתוח סטטיסטי של תנודות של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של fluorophores מפזרת פנימה והחוצה של תאורה אמצעי אחסון במהלך זמן התבוננות. בפרט, N & B הוא פישוט של PCH כדי להשיג מידע על המספר הממוצע של חלבונים בתערובות oligomeric. תנודות אינטנסיביות המוני מתוארים על ידי בהירות מולקולרית של fluorophore ואת המספר הממוצע של fluorophores בתוך עוצמת התאורה. כך, N & B רואה רק את הרגעים הראשונים והשני של התפלגות משרעת, כלומר, את העוצמה הממוצע ואת השונות. זה, באותו זמן, את הכוח והחולשה של השיטה. כי רק שני רגעים נחשבים, N & B לא יכול לקבוע את החלק הטוחנת של oligomers לא ידוע בתערובת, אבל זה רק מעריך את מצב oligomeriטיזציה הממוצע של התערובת. עם זאת, זה יכול להיות מיושם על סדרת זמן קטן יחסית (לעומת שיטות רגע אחר) של תמונות של תאים חיים על בסיס פיקסל על ידי פיקסל, פשוט על ידי ניטור תנודות הזמן של עוצמת הקרינה. זה מפחית את הזמן האפקטיבי לפיקסל לכמה מיקרו שניות, המאפשר רכישה בטווח הזמן של שניות לאלפיות השניה, אשר הכרחי עבור הקינטיקה מהירה של oligomerization. לבסוף, שטחי תאים גדולים כמו גם תאים תת סלולריים ניתן לחקור.

התוצאות עבור שני תאים מייצגים הלה-mEGFP-FGFR1 שנזרע באותה צלחת תרבות מוצגים באיור 5 ו טבלה משלימה 1. שני התאים נלכדו בזמן 0 דקות (איור 5א, למעלה) ו -7 דקות (איור 5א, למטה) לאחר הוספת FGF2 ligand.
<p class="jove_content" fo:ke...

Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

אנו מתארים את גישת ההדמיה לקביעת המצב oligomeric הממוצע של megfp-מתויג-קולטן מתויגים oligomeric הנגרמת על ידי ליגנד קשירה ממברנה פלזמה של תאים חיים. הפרוטוקול מבוסס על סך הכל מיקרוסקופ של השתקפות פנימית (TIRF) בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות (N & B).

ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

אשכולות קולטן נמצא בכל מקום ולעתים קרובות הכרחי עבור איתות הפעלה מפל. עם זאת, שיטות מעטות זמינות למדידת מידת הקיבוץ באשכולות. אנו משתמשים פלואורסצנטיות השתקפות פנימית מוחלטת, מיקרוסקופיה TIRF, כדי לעקוב אחר דיפוזיה של מולקולות FGFR1-mEGFP בממברנה פלזמה של תאים חיים.לאחר מכן אנו מיישמים בהירות מספר, ניתוח N&B, כדי לתאר את הדינמיקה של אשכולות קולטן מגורה. TIRF אידיאלי להדמיה זמנית מהירה של אירועים מולקולריים המתרחשים ליד פני התא, בעוד N&B קובע את המצב האוליגומרי הממוצע של מולקולות פלואורסצנטיות בהתבסס על המקום שבו דיפוזיה פנימה ובחוץ את נפח התאורה של המיקרוסקופ. אכן, זהו כלי לחיבור ארגון הזמן המרחבי של הקולטנים על פני התא שבו הם מאותתים.N&B זקוקה רק לגישה למיקרוסקופ עם מודול רכישה מהירה. אתה יכול לנתח שטח גדול של תאים חיים שיש רק את הידע הבסיסי של שיטות תנודות פלואורסצנטיות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על חלבונים ויוצרים עמעום או אשכולות והוא יכול להיות מתויג stoichiometrically עם צבע פלואורסצנטי.אם החלבונים נמצאים בתאים תאיים, סוגים אחרים של מיקרוסקופים משמשים לרכישת התמונות. חשוב להכין מבנה המבטא את הצורה המונומרית של הפלואורופור למדידה בתנאים ניסיוניים את הבהירות המונומרית הטהורה כפקד. ביום הראשון, זרע תאי HeLa ב 1.5 מיליליטר של מדיום שלם בריכוז של 100, 000 עד 200, 000 תאים למיליליטר במנות תחתית זכוכית.זרעים 6-8 משכפלים כלים, ו דגירה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. ביום השני או השלישי, התאים הגיעו תת-מודע. מוסיפים מדיום נטול סרום עם חלבון פלסמיד למחצית מהמנות, ומוסיפים פלסמידים התייחסות עם מונומר ועמעום למחצית השנייה של הכלים כדי לשנות את התאים.לאחר יום אחד, בדוק כי התאים המבוצפים דבוקים לתחתית הכלים ואת קרום התא הוא פלואורסצנטי. השלך כלים עם תאים מגודלים או עם פלואורסצנטיות נמוכה מאוד. ארבע שעות לפני הניסוי, להפעיל את חממת הטמפרטורה של המיקרוסקופ ב 37 מעלות צלזיוס.הפעל את המיקרוסקופ, המחשבים והמצלמות, והמתן עד שהמצלמות יגיעו לטמפרטורת העבודה הנכונה של מינוס 75 מעלות צלזיוס. מניחים טיפה קטנה של שמן על העדשה האובייקטיבית. שים צלחת מדגם לתוך החממה של המיקרוסקופ, ולסגור את הדלתות של החממה כדי לאפשר את הטמפרטורה של המנה לצייד במשך 10 דקות.הפעל את מנורת האפיפלואורסצנטיות ואת לייזר 488 ננומטר. בחר את מצב ניגודיות epifluorescence כדי לחקור את המדגם, חיפוש תא להתמקד מן העדשה העין. בחר את המסנן המתאים לאיסוף הפליטה הירוקה דרך מצלמת המיקרוסקופ עם bandpass Ex 490/20 500 ו bandpass Em 525/50 או דומה.עבור מן העין לדוח מצלמת במצב epifluorescence. מקד את המוקד ושנה למצב TIRF. לאחר מכן הפעל את היישור האוטומטי בהתאם להוראות המיקרוסקופ TIRF.בחרו עומק תאורה מתאים, ומטבו את כיוון השדה. עבור למצלמה שנייה. הגדר אזור מעניין של 256 על 256 פיקסלים לפחות.הגדר את החשיפה לאלפית שנייה אחת ואת הרווח EM ל 1, 000. כוונן את כוח הלייזר ל-0.5 מילי-וואט. יש צורך לקבל קצת מידע על מקדם דיפוזיה של החלבון כי זמן החשיפה חייב להיות קצר יותר מאשר הזמן הממוצע בילה על ידי מולקולות פלואורסצנטי בנפח הזוהר.הפעל רצף ניסיון ראשון בתנאים ראשוניים, והערך אות לרעש בערך. התנאים מקובלים באות לרעש השווה לשניים עד שלושה או יותר כפי שנמדד בסדרה הראשונה. לאחר מכן השתמשו במ המחוון של מערכת פיצול הפליטה המחברת בין מצלמה מספר שתיים למיקרוסקופ להסוות צד של התמונה.בחר באפשרות השמירה האוטומטית של קובץ המצלמה. התחל את הרכישה של סדרת התמונות עבור מינימום של 700 מסגרות ביחס אות לרעש מינימלי של שתיים. מבלי להוציא את המנה מהמיקרוסקופ, מוסיפים את הליגנד.בחר תא עם קרום פלואורסצנטי בהיר, והתחל במהירות את סדרת הפעם הראשונה של הריצה הקינטית. חפש בתא שני ורכוש את נקודת הזמן השנייה של הקינטיקה. לכוד תא חדש עבור כל נקודת זמן של הריצה הקינטית.עבור כל מנה חדשה, חזור על היישור של קו הלייזר ואופטימיזציה של תאורת TIRF. עכשיו להמיר ולשמור את קבצי התמונה שנרכשו עם תוכנת המצלמה כמו קבצי tif. יבא קבצי tif ב שגרת תוכנת הניתוח על-ידי הפעלת האינטרפארמה הגרפית של N&B MATLAB.השלך סדרות שעבורן פרופיל האינטנסיביות הממוצע מציג יותר מ- 10%photobleaching וסדרות שבהן היה עיוות או תרגום ברור של קרום התא במהלך הרכישה. חיתוך מסגרות שכנראה אינן בפוקוס. שמור לניתוח רק סדרות עם לפחות 500 מסגרות זמן.תחילה לקבוע את הפרמטרים המצלמה. הפעל את מצלמת הכיול השגרתית. בחר אזור של לפחות 20 על 50 פיקסלים באזור רעש הגלאי.בתדירות יומן הרישום לעומת התוויית רמה דיגיטלית, הזז את הסמן האדום ליניארי כדי לתחום את הגאוסיאני בחלק ליניארי של העקומה. הפעל את מקש B. החל binning מינימלי של 2.2 כדי להפחית את פיזור הנתונים כדי ליצור את היסטוגרמה B-I.השתמש בסמן הריבועי האטרטיבי כדי לבדוק את היסטוגרמת B-I. בחר ROI מרובע עבור הניתוח והפיק את מפת B של ערך ההשקעה שנבחר. לאחר מכן שמרו את קובץ ASCII של ערכי B המשויכים לבחירה.יבא את ה- ASCII בתוכנת גרפיקה כדי לחשב את התפלגות התדרים של הנתונים ולקבל את ערך ה- B הממוצע פלוס או מינוס S.E.Apply משוואת האפסילון כדי להפיק את הבהירות הממוצעת עבור כל תא בכל נקודת זמן של הריצה הקינטית. לנרמל את הנתונים על פי משוואת הנורמליזציה, כאשר B't הוא ערך B הממוצע שנמדד בזמן t לאחר חיבור ליגנד ו- B'0 הוא ערך ה- B הממוצע הנמדד באותה עת שווה לאפס, שהוא 10 עד 20 שניות לאחר ligand additino. התווה את הבהירות הממוצעת המנורמלת לעומת זמן הרכישה כדי לבנות את הריצה הקינטית.במחקר זה, תוצאות מייצגות משני תאי HeLa באותה מנה המבטאת mEGFP-FGR1 שנתפסו בזמן אפס ושבע, לאחר תוספת של 20 ננוגרם למיליליטר של FGF2, מוצגים כאן. בהשוואה למבנהי הייחוס, GPI-mEGFP ו- GPI-mEGFP-mEGFP-mEGFP dimer, רצף הניתוח כולו מציג את העוצמה הממוצעת של סדרת הזמן. עלילה של כל ערכי B.היסטוגרמה בי-איי. B-מפה של ROI שנבחר. והיסטוגרמת הפצת B הקשורה.לאחר גירוי עם 20 ננוגרם למיליליטר של FGF2, ריצות קינטיות מייצגות המציגות את הבהירות הממוצעת כפונקציית הזמן מתארת את התהליך האיטי של עמעום שנמשך מספר דקות על פני התא. כאשר מגורה עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של NCAM-Fc, הפרופיל הקינטי חושף מעברים מהירים ומ מחזוריים של הקולטן בת תערובות אוליגומריות, אשר מגיע גם לערכי בהירות מעל זה של העמום. ערך ממוצע מנורמל של שלושה נצפה שוב ושוב.חשוב למזער את הגרסאות הנוספות ללא תנודות מולקולריות והלבנה. ותאים חייבים להיות דבקים היטב בצלחת התחתונה מזכוכית, לא מגודל, ולא נערם. אם אנו מעוניינים בחלבון המתפזר מהר יותר בתוך תאים תאיים, אנו יכולים ליישם אפס פעמים מהירות יותר ולהשתמש בסריקה על מיקרוסקופים מוקדיים או מולטיפוטונים כדי דימוי בתוך התא.עם הגישה שלנו, אנו למזער את ההשפעות המזיקות של photobleaching כאשר אנו רוצים לחקור את הדינמיקה של אירועים כגון עמעום. אירועים אלה שולטים במגוון תגובות תאיות וקשה מאוד להוכיח אותם בתאים חיים עם טכניקות אחרות.

Research

JoVE Journal

Biology

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

ניתוח של Autophagy ב<em&gt; Chrysogenum Penicillium</em&gt; על ידי שימוש ברפידות רעב בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור של שורשי הצמח גדל על פני השטח של ג&#39;ל

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...