Name: oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

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1. Preparazione del campione
<ol><li>Primo giorno. Cellule di semi HeLa in mezzo completo ad una concentrazione di 100.000-200,000 cellule / mL in piatti in vetro-fondo. Seme 6-8 replicare piatti. NOT:</</c0> In questo esempio, il mezzo è integrato con il 10% di calore inattivato Siero Fetale Bovino (FBS), 1 mM di pirata di sodio, 100 U/100 g di penicillina/streptomicina. Diversi piatti replicare sono preparati.</li>
	<li>Giorno 2-3. Quando le cellule sono a sub-confluenza, trasfect metà dei piat...

<ol>
	<li>Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+insights+into+gonadotropin+hormone+receptor+dimerization+and+oligomerization.">Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization.</a> Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).</li><li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited:+functional+and+pharmacological+perspectives.">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).</li><li>Marsango, S., Ward, R. 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N&B richiede diverse precauzioni nella scelta del modello di cella e della strategia di etichettatura. Può essere applicato solo alle cellule vive che rimangono aderenti stabilmente durante il tempo di acquisizione dell'immagine. Le fluttuazioni extra dovute allo spostamento rigido dell'intera cellula potrebbero essere gestite con approcci appropriati per il ripristino dell'immagine38. Tuttavia, generalmente quando una cellula si muove, anche la membrana cellulare si deforma e la deformazione del...

Descriviamo un approccio di imaging TIRF-N&B (Total Internal Reflection Fluorescence-Number and Brightness) per determinare lo stato oligomerico medio delle molecole recettoriali alla membrana plasmatica delle cellule vive, con l'obiettivo di collegare l'assemblaggio del recettore funzione biologica delle proteine (Figura 1).
Al momento del legame del ligando extracellulare, i recettori avviano la trasduzione del segnale intracellulare a seconda della loro conformazione, oligomerizzazione, potenziali co-recettori e composizione della membrana. Nonostante l'importanza e l'ubiquità dell'oligomerizzazione del recettore, riconosciuto come un evento chiave nella segnalazione cellulare1,2,3,4,5,6, 7, pochi metodi possono rilevare gli eventi di clustering e misurare il grado di clustering sperimentalmente8,9. Il volume confocale (x,y : 300 nm, z ) non è sufficientemente risolto per dimostrare l'interazione molecolare e la stoichiometria, anche dopo l'ottimizzazione da parte degli algoritmi di ripristino delle immagini10. La composizione di sottounità di oligomeri proteici non può essere risolta su base puramente spaziale anche con metodi di super-risoluzione a risoluzione x,y di 20-70 nm come PALM11, STORM12e STED13. Inoltre, la loro risoluzione temporale (nell'ordine dei minuti per immagine) non può seguire la cinetica nell'intervallo di secondi. Lo sbiancamento a passo di singola molecola risolve la stoichiometria degli oligomeri proteici solo se sono immobili14.
Uno dei metodi più versatili per misurare la densità e l'oligomerizzazione delle proteine fluorescenti all'interno di singole immagini è l'analisi della distribuzione dell'intensità spaziale (SpIDA), che si basa sul campionamento spaziale. È applicabile sia alle cellule chimicamente fisse che vive e consente l'analisi di diverse regioni di interesse della cellula contemporaneamente utilizzando la microscopia a fluorescenza standard15. In alternativa, i metodi del momento, come la spettroscopia fluorescenza-correlazione (FCS)16, l'istogramma di conteggio fotone (PCH)17e il numero e la luminosità (N&B)18,19, sono adatti per oligomeri quantitativi Misure. Questi metodi analizzano le fluttuazioni di intensità della fluorescenza che possono essere osservate nel tempo in cui i fluorofori si diffondono dentro e fuori da un volume di illuminazione. Le ampiezze delle fluttuazioni di intensità possono essere descritte in modo univoco dalla luminosità molecolare del fluoroforo e dal numero medio di fluorofori (n) all'interno del volume di illuminazione17 (Figura 2). Tipicamente, il coefficiente di diffusione dei fluorofori e il numero medio di molecole (inversamente correlate al valore G(0) all'interno del volume di illuminazione possono essere ottenuti da FCS20. Tuttavia, poiché il tempo di diffusione si adatta solo alla radice cubica della massa, la FCS non è sufficientemente sensibile per rilevare i cambiamenti nella massa molecolare21. In pratica, fcS monocolore non è in grado di rilevare la dimerizzazione dei recettori della membrana. PCH risolve con precisione le miscele di diversi oligomeri. Utilizzando più di due momenti della distribuzione dell'ampiezza, rileva molecole di luminosità diversa che occupano lo stesso volume di illuminazione. Scansione FCS22 e sviluppi, come l'interessante coppia-correlazione di luminosità molecolare (pCOMB) approccio23, introdotto per estendere la gamma di applicabilità dei metodi di correlazione della fluorescenza nei sistemi biologici24 , rimangono metodi a punto singolo privi della capacità di misurazioni veloci in un'ampia area di una cella, richiedendo molte osservazioni consecutive ad ogni pixel e l'acquisizione di dati nell'ordine di secondi.
N&B è una versione semplificata di PCH che considera solo il primo e il secondo momento dell'ampiezza della distribuzione della fluorescenza, vale a dire l'intensità media, , e la varianza,2 (Figura 2)18,19 e, per questo motivo, non può determinare la frazione molare di oligomeri sconosciuti in una miscela, ma stima solo lo stato medio di oligomerizzazione della miscela. Tuttavia, N&B ha il vantaggio di lavorare con serie temporali relativamente più piccole di immagini di cellule vive rispetto al PCH su base pixel per pixel, semplicemente monitorando le fluttuazioni al momento dell'intensità di fluorescenza. Poiché N&B riduce il tempo per pixel a pochi microsecondi, può seguire cinetiche di oligomerizzazione veloce su grandi aree cellulari, consentendo l'acquisizione di immagini su una scala temporale di secondi nella microscopia a scansione raster (ad esempio, confocale, 2 fotone) e millisecondi microscopia basata su fotocamera (ad es. TIRFM).
Diversi rapporti hanno dimostrato la capacità di N&B di quantificare il numero di sottounità nei cluster proteici mediante l'imaging di regioni cellulari estese. Gli ammassi di Paxillin-EGFP sono stati rilevati nei siti di adesione nelle cellule CHO-K125e l'aggregazione intracellulare del peptide patogeno Httex1p è stata descritta nelle cellule COS-726. N&B è stato richiesto per seguire l'oligomerizzazione guidata dal ligando del recettore ErbB27e l'effetto del ligand FGF21 su Klothob (KLB) e FGFR1c nelle celle HeLa28. La combinazione di imaging TIRF e analisi N&B è stata utilizzata per dimostrare che la dinamina-2 è principalmente tetramerica in tutta la membrana cellulare29. Abbiamo applicato N&B sia alla scansione raster che alle immagini TIRF per dimostrare la dimerizzazione guidata dal ligando dei recettori della membrana cellulare uPAR e FGFR130,31.
I metodi di correlazione della fluorescenza, come N&B, FCS e PCH, si basano sull'idea che in un volume aperto il numero di occupazione delle particelle segua una distribuzione di Poisson. Poiché possono essere rilevati solo i fotoni emettiti dai fluorofori, il valore medio per un'intensità di fluorescenza misurata rispetto al tempo in un pixel dell'immagine, <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> </img>è il prodotto del numero medio di fluorofori nel volume di illuminazione, n, e la loro luminosità molecolare,17:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
dove il numero di fotoni emessi per unità di tempo (convenzionalmente al secondo) per molecola quando la molecola è al centro del volume di illuminazione.
La luminosità è una proprietà di ogni fluoroforo in una data acquisizione impostata, mentre l'intensità è la somma di tutti i contributi di tutti i fluorofori. Nei concorsi biologici, la luminosità aumenterà con l'aumento del numero di fluorofori che fluttuano insieme, fornendo informazioni sullo stato di oligomerizzazione della proteina fluorescente. Le ampiezze di fluttuazione in un determinato pixel vengono misuratedalla varianza del segnale di fluorescenza,
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
Dove la media del quadrato <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> </img>di intensità, , e il <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> </img>quadrato della media di intensità, , vengono calcolati dai singoli valori di intensità in ogni pixel di ogni fotogramma:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
dove K è il numero di fotogrammi totali nella serie temporale. Sperimentalmente, è necessario calcolare per l'intera serie di immagini la varianza che descrive la dispersione dei singoli valori di intensità in ogni pixel di una singola immagine intorno al valore di intensità media. La varianza include tutte le fluttuazioni di origini diverse. In una prima approssimazione, la varianza dovuta alla diffazione delle particelle di fusione nel volume di illuminazione,20, può essere separata dalla varianza a causa del rumore del rivelatore,2d. Le due varianze sono indipendenti; pertanto, la varianza totale è data dalla loro somma:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
La varianza, dovuta alle fluttuazioni molecolari all'esterno e all'esterno del volume di rilevamento, dipende linearmente dalla luminosità e dall'intensità molecolari:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
Riorganizzazione di eq. 6 in base a eq. 1:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
Secondo il concetto tipico nella spettroscopia di correlazione a fluorescenza, l'equazione 7 afferma che la varianza dovuta al numero di fluttuazioni dipende dal quadrato della luminosità della particella.
Quindi, la varianza dovuta alle fluttuazioni del rivelatore è una funzione lineare dell'intensità rilevata, partendo dal presupposto che il rivelatore sia azionato al di sotto del suo limite di saturazione19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
Nel caso dei rilevatori di conteggio dei fotoni unvalore 1 e c.0, quindi la varianza del rivelatore è uguale all'intensità media:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
Per applicare questi concetti alle misurazioni reali nelle cellule vive, Gratton e colleghi18 definiscono la luminosità apparente, B, per ogni pixel come rapporto della varianza rispetto all'intensità media:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B è il parametro misurato sperimentalmente. In questo lavoro, le immagini di serie temporali dei recettori FGFR1 nella membrana plasmatica delle cellule HeLa vengono catturate dalla microscopia TIRF e la luminosità media apparente, B, è determinata dall'analisi N&B. Quindi, dopo l'aggiunta di FGF2, serie temporali consecutive vengono catturate per seguire i cambiamenti nell'auto-assemblaggio delle molecole recettoriali nella superficie della membrana dopo la stimolazione del recettore con il ligando canonico.
Tuttavia, poiché il rilevatore del microscopio TIRF è una telecamera EMCCD, l'espressione per la luminosità apparente deve essere modificata come19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
dove offset è l'offset di intensità dell'elettronica di rilevamento che è una caratteristica delle impostazioni del rivelatore. La varianza e l'intensità media per un rilevatore analogico sono date rispettivamente da:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
dove G è il guadagno analogico nei livelli digitali (DL/fotoni), S, i livelli digitali per fotone19, è dato dalla pendenza di un'intensità rispetto al grafico di varianza per una fonte di luce con intensità costante (senza fluttuazioni temporali). Il fattore z è correlato alla forma del volume di rilevamento dei pixel. Secondo Hassler et al.32, il fattore z è pari a 0,3 per l'imaging TIRF che lavora al massimo guadagno della telecamera di rilevamento19. I parametri offset, S e G sono caratteristiche della fotocamera e del microscopio. La luminosità apparente, B, si ottiene riorganizzando eq. 11 secondo eq. 12 e 13:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
Dal punto di torto dal punto di toesa dal punto di tordo, è una funzione complessa dell'intensità del laser e dell'efficienza di rilevamento del sistema. Tuttavia, dal momento che B/S dipende linearmente da , è importante solo determinare il valore relativo di , per una determinata modalità di rilevamento:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
dove è proporzionale a " s" . Tuttavia, una calibrazione viene eseguita utilizzando un riferimento interno.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum 98% minimun</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>21063029</td>
			<td>Used serum free for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high-glucose GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>Used for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0515-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitting system Photometrics DV2</td>
			<td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td>10% inactivated supplement for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes</td>
			<td>MatTek, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>uncoated, glass thickness 0.17 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells</td>
			<td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CB_08011102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software</td>
			<td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td>
			<td></td>
			<td>This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&#38;B time series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Executable N&#38;B routine</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab v.2018b</td>
			<td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x</td>
			<td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td>
			<td>LONZA 17-602E</td>
			<td>supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100&#181;g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector</td>
			<td>Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td>Zamai et al., 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGF2</td>
			<td>PeproTech EC, Ltd., London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate GIBCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>1mM supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIt-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid 10 mL</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513 859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM2618</td>
			<td>0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis

Nonostante l'importanza e l'ubiquità dell'oligomerizzazione del recettore, pochi metodi sono applicabili per rilevare gli eventi di clustering e misurare il grado di clustering. Qui, descriviamo un approccio imaging per determinare lo stato oligomerico medio degli omocomplessi del recettore mEGFP nella membrana delle cellule viventi. Il protocollo si basa sulla microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) combinata con l'analisi di Number and Brightness (N&B). N&B è un metodo simile alla spettroscopia fluorescenza-correlazione (FCS) e all'istogramma di conteggio dei fotoni (PCH), che si basano sull'analisi statistica delle fluttuazioni dell'intensità della fluorescenza dei fluorofori che si diffondono dentro e fuori da un'illuminazione volume durante un periodo di osservazione. In particolare, N&B è una semplificazione del PCH per ottenere informazioni sul numero medio di proteine nelle miscele oligomeriche. Le ampiezze di fluttuazione dell'intensità sono descritte dalla luminosità molecolare del fluoroforo e dal numero medio di fluorofori all'interno del volume di illuminazione. Pertanto, N&B considera solo il primo e il secondo momento della distribuzione dell'ampiezza, vale a dire l'intensità media e la varianza. Questo è, allo stesso tempo, la forza e la debolezza del metodo. Poiché vengono considerati solo due momenti, N&B non è in grado di determinare la frazione molare degli oligomeri sconosciuti in una miscela, ma stima solo lo stato medio di oligomerizzazione della miscela. Tuttavia, può essere applicato a serie temporali relativamente piccole (rispetto ad altri metodi di momento) di immagini di cellule vive su base pixel per pixel, semplicemente monitorando le fluttuazioni temporali dell'intensità della fluorescenza. Riduce il tempo effettivo per pixel a pochi microsecondi, consentendo l'acquisizione nell'intervallo di tempo di secondi a millisecondi, che è necessario per l'oligomerizzazione rapida cinetica. Infine, è possibile esplorare grandi aree cellulari e compartimenti subcellulari.

I risultati per due celle HeLa-mEGFP-FGFR1 rappresentative seminato nello stesso piatto di coltura sono mostrati nella Figura 5 e nella Tabella supplementare 1. Le due celle sono state catturate al momento 0 min (Figura 5A, superiore) e 7 min (Figura 5A, fondo) dopo l'aggiunta del ligando FGF2.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

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Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Descriviamo un approccio di imaging per la determinazione dello stato oligomerico oligomerico medio degli oligomeri mEGFP-tagged-receptor indotti dal legame del ligando nella membrana plasmatica delle cellule viventi. Il protocollo si basa sulla microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) combinata con l'analisi di Number and Brightness (N&B).

Dinamica di oligomerizzazione dei recettori delle superfici cellulari nelle cellule viventi mediante microscopia a fluorescenza totale di riflessione interna combinata con l'analisi del numero e della luminosità

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Il clustering del recettore è onnipresente e spesso necessario per segnalare un'attivazione a cascata. Tuttavia, sono disponibili pochi metodi per misurare il grado di clustering. Utilizziamo la fluorescenza di riflessione interna totale, microscopia TIRF, per seguire la diffusione delle molecole FGFR1-mEGFP nella membrana plasmatica delle cellule vive.Quindi applichiamo la luminosità del numero, l'analisi N&B, per descrivere la dinamica del clustering del recettore stimolato. TIRF è ideale per l'imaging temporale veloce di eventi molecolari che si verificano vicino alla superficie cellulare, mentre N&B determina lo stato oligomerico medio delle molecole fluorescenti in base a dove la diffusione in uscita e in uscita il volume di illuminazione del microscopio. In effetti, questo è uno strumento per collegare l'organizzazione temporale spaziale dei recettori sulla superficie cellulare dove stanno segnalando.N&B ha solo bisogno dell'accesso a un microscopio con un modulo di acquisizione veloce. È possibile analizzare una vasta area di cellule vive con solo la conoscenza di base dei metodi di fluttuazione della fluorescenza. Questo metodo può essere applicato a proteine che formano dimeri o ammassi e può essere etichettato stechiometricamente con il colorante fluorescente.Se le proteine sono in compartimenti intracellulari, altri tipi di microscopi vengono utilizzati per acquisire le immagini. È importante preparare un costrutto che esprima la forma monomerica del fluoroforo per misurare in condizioni sperimentali la pura luminosità monomerica come controllo. Il primo giorno, seminare cellule HeLa in 1,5 millilitri di mezzo completo ad una concentrazione da 100.000 a 200.000 cellule per millilitro in piatti con fondo di vetro.Seme da sei a otto replicano i piatti e incubano in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Il secondo o il terzo giorno, le cellule hanno raggiunto la subconfluenza. Aggiungere il mezzo privo di siero con plasmide proteico a metà dei piatti e aggiungere plasmidi di riferimento con il monomero e il dimero alla seconda metà dei piatti per trasfettare le cellule.Dopo un giorno, controllare che le cellule trasfette siano aderenti al fondo delle stoviglie e che la membrana cellulare sia fluorescente. Scartare i piatti con cellule ricoperte di vegetazione o con fluorescenza molto bassa. Quattro ore prima dell'esperimento, attivare l'incubatore di temperatura del microscopio a 37 gradi Celsius.Accendi il microscopio, i computer e le telecamere e attendi che le telecamere raggiungano la temperatura di lavoro corretta di meno 75 gradi Celsius. Posizionare una piccola goccia di olio sull'obiettivo. Mettere un piatto campione nell'incubatrice del microscopio e chiudere le porte dell'incubatrice per lasciare che la temperatura del piatto equilibra per 10 minuti.Accendi la lampada a epifluorescenza e il laser da 488 nanometri. Selezionare la modalità di contrasto dell'epifluorescenza per esplorare il campione, cercando una cella da mettere a fuoco dalla lente oculare. Selezionare il filtro corretto per la raccolta dell'emissione verde attraverso la fotocamera del microscopio con pass a banda Ex 490/20 500 e pass banda Em 525/50 o simili.Passare dal rapporto oculare alla camma in modalità epifluorescenza. Perfezionare lo stato attivo e passare alla modalità TIRF. Quindi attivare l'allineamento automatico seguendo le istruzioni del microscopio TIRF.Scegli una profondità di illuminazione adatta e ottimizza la direzione del campo evanescente. Passare a una seconda fotocamera. Definire un'area di interesse di almeno 256 per 256 pixel.Impostare l'esposizione su un millisecondo e il guadagno em su 1.000. Regolare la potenza del laser a 0,5 milliwatt. È necessario avere alcune informazioni sul coefficiente di diffusione della proteina perché il tempo di esposizione deve essere inferiore al tempo medio trascorso dalle molecole fluorescenti nel volume luminato.Eseguire una prima sequenza di prova in condizioni iniziali e stimare approssimativamente il valore segnale-rumore. Le condizioni sono accettabili al segnale-rumore pari o superiore a due o tre, come misurato nella prima serie di tempo. Quindi utilizzare il dispositivo di scorrimento del sistema di divisione delle emissioni che collega la fotocamera numero due al microscopio per mascherare un lato dell'immagine.Selezionare l'opzione di salvataggio automatico del file della fotocamera. Inizia l'acquisizione della serie di immagini per un minimo di 700 fotogrammi con un rapporto segnale-rumore minimo di due. Senza togliere il piatto dal microscopio, aggiungere il ligando.Selezionare una cella con una membrana a fluorescenza brillante e iniziare rapidamente la prima serie di volte della corsa cinetica. Cerca una seconda cella e acquisisci il secondo punto di tempo della cinetica. Acquisire una nuova cella per ogni punto di tempo dell'esecuzione cinetica.Per ogni nuovo piatto, ripetere l'allineamento della linea laser e l'ottimizzazione dell'illuminazione TIRF. Ora converti e salva i file di immagine acquisiti con il software della fotocamera come file tif. Importare i file tif nella routine del software di analisi attivando l'interfaccia utente grafica N&B MATLAB.Serie di scarti per le quali il profilo di intensità media mostra più del 10% di fotobleaching e serie in cui c'è stata un'evidente distorsione o traslazione della membrana cellulare durante l'acquisizione. Ritagliare fotogrammi che sono evidentemente fuori fuoco. Conservare per l'analisi solo serie con almeno 500 tempi.Determinare innanzitutto i parametri della fotocamera. Attivare la fotocamera calibrata di routine. Selezionare un'area di almeno 20 per 50 pixel nell'area di disturbo del rilevatore.Nel grafico della frequenza di log rispetto al livello digitale, spostate il cursore rosso lineare per delimitare il gaussiano nella parte lineare della curva. Attivare il tasto B. Applicare un binning minimo di 2,2 per ridurre la dispersione dei dati e generare l'istogramma B-I.Utilizzare il cursore quadrato iterativo per ispezionare l'istogramma B-I. Selezionare un ROI quadrato per l'analisi e generare la mappa B del ROI selezionato. Salvare quindi il file ASCII dei valori B associati alla selezione.Importare l'ASCII in un software grafico per calcolare la distribuzione di frequenza dei dati e ottenere il valore B medio più o meno S.E.Applicare l'equazione di epsilon per derivare la luminosità media per ogni cella in ogni punto di tempo della corsa cinetica. Normalizzare i dati in base all'equazione di normalizzazione, dove B't è il valore medio B misurato al tempo t dopo l'addizione del ligando e B'0 è il valore medio B misurato nel momento in cui t è uguale a zero, che è da 10 a 20 secondi dopo l'additino ligando. Tracciate la luminosità media normalizzata rispetto al tempo di acquisizione per costruire la corsa cinetica.In questo studio, i risultati rappresentativi di due cellule HeLa nello stesso piatto che esprimono mEGFP-FGR1 catturato al tempo zero e sette, dopo l'aggiunta di 20 nanogrammi per millilitro di FGF2, sono mostrati qui. Rispetto ai costrutti di riferimento, GPI-mEGFP e GPI-mEGFP-mEGFP dimero, l'intera sequenza di analisi mostra l'intensità media delle serie temporali. Traccia di tutti i valori B.Istogramma B-I. Mappa B del ROI scelto. E l'istogramma della distribuzione B associato.Dopo la stimolazione con 20 nanogrammi per millilitro di FGF2, le esecuzioni cinetiche rappresentative che mostrano la luminosità media in funzione del tempo descrivono il lento processo di dimerizzazione che persiste per diversi minuti sulla superficie cellulare. Quando stimolato con 50 microgrammi per millilitro di NCAM-Fc, il profilo cinetico rivela transizioni veloci e cicliche del recettore in miscele oligomeriche, che raggiunge anche valori di luminosità superiori a quello del dimero. Si osserva ripetutamente un valore medio normalizzato di tre.È importante ridurre al minimo le varianti extra a causa di nessuna fluttuazione molecolare e sbiancamento. E le cellule devono essere ben aderenti al piatto con fondo di vetro, non ricoperte di vegetazione e non accatastate. Se siamo interessati a una proteina che si diffonde più velocemente all'interno dei compartimenti intracellulari, possiamo applicare zero volte più velocemente e utilizzare la scansione su microscopi focali o multifotoni per l'immagine all'interno della cellula.Con il nostro approccio, riduciamo al minimo gli effetti dannosi del fotobleaching quando vogliamo esplorare le dinamiche di eventi come la dimerizzazione. Questi eventi controllano una varietà di risposte cellulari e sono molto difficili da dimostrare nelle cellule vive con altre tecniche.

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