Name: oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

Den CNIC støttes av departementet Ciencia, Innovacion y universidades og Pro CNIC stiftelsen, og er en Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Vi er også støttet av European Regional Development Fund (FEDER) "UNA manera de hacer Europa". UC anerkjenner støtten fra Associazione Italiana Ricerca Sul Cancro, foreningen for internasjonal kreftforskning (nå kjent som Worldwide Cancer Research), og det italienske Helsedepartementet. A.T. anerkjenner "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" for delvis støtte hans arbeid med PV Fellowship "Progetto Professionalità Ivano Becchi" 2011-2012.

1. prøveforberedelse
<ol><li>Dag 1. Seed HeLa celler i komplett medium ved en konsentrasjon på 100000-200000 Cell/mL i glass-Bottom retter. Seed 6-8 gjenskape retter. Merk: I dette eksempelet suppleres mediet med 10% varme deaktivert fosterets storfe serum (FBS), 1 mM natrium pyruvat, 100 U/100 μg penicillin/Streptomycin. Flere gjenskape retter er forberedt.</li>
	<li>Dag 2-3. Når cellene er på sub-confluency, transfect halvparten av rettene med proteinet plasmider og andre halvdel med referans...

<ol>
	<li>Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+insights+into+gonadotropin+hormone+receptor+dimerization+and+oligomerization.">Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization.</a> Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).</li><li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited:+functional+and+pharmacological+perspectives.">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).</li><li>Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+receptor+oligomerization.">Muscarinic receptor oligomerization.</a> Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).</li><li>Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+Receptor+Signaling:+Impact+of+Receptor+Oligomerization+on+Receptor+Function.">Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).</li><li>Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+oligomerization:+functional+considerations.">Chemokine receptor oligomerization: functional considerations.</a> Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).</li><li>Van Craenenbroeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+oligomerization:+contribution+to+receptor+biogenesis.">GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis.</a> Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).</li><li>Wnorowski, A., Jozwiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-+and+hetero-oligomerization+of+beta2-adrenergic+receptor+in+receptor+trafficking,+signaling+pathways+and+receptor+pharmacology.">Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology.</a> Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).</li><li>Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+methods+to+study+membrane+receptor+oligomerization.">Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization.</a> Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).</li><li>Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+complementation+assays:+new+tools+to+study+G+protein-coupled+receptor+oligomerization+and+GPCR-mediated+signaling.">Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).</li><li>Trussell, H. J., et al., Trussell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Academic Press Library in Signal Processing. 4, 3-9 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+dendritic+spines+by+STED+microscopy.">Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).</li><li>Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+accurately+locate+and+count+large+numbers+of+steps+by+photobleaching.">A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).</li><li>Godin, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+protein+oligomerization+and+densities+in+situ+using+spatial+intensity+distribution+analysis.">Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).</li><li>Qian, H., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+molecular+aggregation+by+analysis+of+fluctuation+moments.">Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).</li><li>Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photon+counting+histogram+in+fluorescence+fluctuation+spectroscopy.">The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).</li><li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode.">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).</li><li>Unruh, J. R., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+concentration+and+brightness+from+fluorescence+fluctuation+data+with+an+electron+multiplied+CCD+camera.">Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera.</a> Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).</li><li>Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+chemical+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+review.">Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review.</a> Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).</li><li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy.">Fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li><li>Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+FCS,+a+novel+method+for+three-dimensional+particle+tracking.">Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking.</a> Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).</li><li>Hinde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+dynamics+of+the+oligomeric+transcription+factor+STAT3+by+pair+correlation+of+molecular+brightness.">Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness.</a> Nature Communications. 7, 11047 (2016).</li><li>Waithe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+processing+and+analysis+of+conventional+confocal+microscopy+generated+scanning+FCS+data.">Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data.</a> Methods. 140-141, 62-73 (2018).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Ossato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+path+to+inclusion+formation+of+huntingtin+peptides+revealed+by+number+and+brightness+analysis.">A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).</li><li>Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+resting+and+ligand-bound+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases+in+living+cells+using+number+and+brightness+analysis.">Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).</li><li>Ming, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Distribution+of+Klothobeta+(KLB)+and+fibroblast+growth+factor+receptor-1+(FGFR1)+in+living+cells+reveal+the+fibroblast+growth+factor-21+(FGF21)-induced+receptor+complex.">Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).</li><li>Ross, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+state+of+dynamin+2+in+cell+membranes+using+TIRF+and+number+and+brightness+analysis.">Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).</li><li>Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+brightness+image+analysis+reveals+ATF-induced+dimerization+kinetics+of+uPAR+in+the+cell+membrane.">Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane.</a> FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).</li><li>Zamai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+brightness+analysis+reveals+that+NCAM+and+FGF2+elicit+different+assembly+and+dynamics+of+FGFR1+in+live+cells.">Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells.</a> Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).</li><li>Hassler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+correlation+spectroscopy+(TIR-FCS)+with+low+background+and+high+count-rate+per+molecule.">Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule.</a> Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).</li><li>Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fast+fluorescence+imaging+to+molecular+diffusion+law+on+live+cell+membranes+in+a+commercial+microscope.">From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).</li><li>Beenken, A., Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FGF+family:+biology,+pathophysiology+and+therapy.">The FGF family: biology, pathophysiology and therapy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).</li><li>Joubert, J., Sharma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+digital+imaging.">Light microscopy digital imaging.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2011).</li><li>Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIRF+microscopy+evanescent+field+calibration+using+tilted+fluorescent+microtubules.">TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules.</a> Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).</li><li>Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+incidence+angle+for+through-the-objective+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).</li><li>Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+limits+and+data+correction+in+number+of+molecules+and+brightness+analysis.">Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis.</a> Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).</li><li>Caiolfa, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomer-dimer+dynamics+and+distribution+of+GPI-anchored+uPAR+are+determined+by+cell+surface+protein+assemblies.">Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies.</a> Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).</li><li>Campbell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+red+fluorescent+protein.">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).</li><li>Cutrale, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+enhanced+number+and+brightness+to+measure+protein+oligomerization+dynamics+in+live+cells.">Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells.</a> Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).</li><li>Dunsing, V., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence+Fluctuation+Spectroscopy+Assay+of+Protein-Protein+Interactions+at+Cell-Cell+Contacts.">A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li></ol>

N & B krever flere forholdsregler ved valg av celle modell og merkings strategi. Den kan bare brukes på levende celler som fortsatt stabilt overholdt under bilde opptakstiden. Ekstra svingninger på grunn av hele cellen stiv forskyvning kan håndteres med riktig bilde restaurering tilnærminger38. Men generelt når en celle beveger seg, cellemembranen også deformeres, og struktur deformasjon, produsere store ekstra varians, introduserer alvorlig begrensning til analyse av membran proteiner. I de...

Vi beskriver en total intern refleksjon fluorescens-nummer og lysstyrke (TIRF-N & B) Imaging tilnærming for å bestemme den gjennomsnittlige oligomer tilstand reseptor molekyler ved plasma membranen av levende celler, med sikte på å knytte reseptoren forsamlingen dynamikk til biologisk funksjon av proteiner (figur 1).
Upon ekstracellulære ligand binding, reseptorer initiere intracellulære signal Transduction avhengig av deres konformasjon, oligomerisering, potensielle co-reseptorer og membran sammensetning. Til tross for viktigheten og ubiquity av reseptor oligomerisering, anerkjent som en viktig hendelse i mobilnettet signalering1,2,3,4,5,6, 7, få metoder kan oppdage Clustering hendelser og måle graden avClustering eksperimentelt. Den konfokalmikroskopi volum (x, y ≈ 300 NM, z ≈ 900 NM) er utilstrekkelig løst for å bevise molekylær interaksjon og støkiometri, selv etter optimalisering av bildet restaurering algoritmer10. Den sub-enhet sammensetning av protein oligomers kan ikke løses på en rent romlig basis, selv ved super-oppløsning metoder ved x, y oppløsning på 20-70 NM som PALM11, Storm12, og sted13. Videre kan deres timelige oppløsning (i størrelsesorden minutter per bilde) ikke følge Kinetics i løpet av sekunder. Enkelt molekyl trinn-bleking løser støkiometri av protein oligomers bare hvis de er Immobile14.
En av de mest allsidige metoder for å måle tetthet og oligomerisering av fluorescensmerkete merkede proteiner i enkeltbilder er den romlige intensitet distribusjon analyse (SpIDA), som er avhengig av romlig prøvetaking. Det gjelder både kjemisk faste og levende celler, og tillater analyse av flere regioner av interesse av cellen samtidig ved hjelp av standard fluorescens mikroskopi15. Alternativt, øyeblikk metoder, som fluorescens-korrelasjon spektroskopi (FCS)16, Foton opptellingen histogram (PCH)17, og antallet og klarheten (N & B)18,19, er egnet til kvantitativ oligomer Målinger. Disse metodene analyserer fluorescens intensitet svingninger som kan observeres i tid når fluorophores diffus inn og ut av en belysning volum. Amplituder av intensiteten svingninger kan være unikt beskrevet av den molekylære lysstyrken på fluoroforen (ε) og gjennomsnittlig antall fluorophores (n) innenfor belysning volum17 (figur 2). Vanligvis kan diffusjon koeffisient av fluorophores og gjennomsnittlig antall molekyler (omvendt relatert til G (0) verdi) innenfor belysning volumet fås ved FCS20. Men siden diffusjon tiden bare skalerer med kubikkroten av massen, er FCS ikke tilstrekkelig følsom for å oppdage endringer i molekylær masse21. I praksis kan én farge FCS ikke oppdage dimerization av membran reseptorer. PCH løser blandinger av forskjellige oligomers nøyaktig. Ved hjelp av mer enn to øyeblikk av amplitude fordelingen, oppdager det molekyler av ulik lysstyrke som opptar samme belysning volum. Skanning FCS22 og utvikling, slik som interessant par-korrelasjon av molekylær lysstyrke (pCOMB) tilnærming23, innført for å utvide omfanget av anvendelsen av fluorescens korrelasjons metoder i biologiske systemer24 , forbli enkelt punkt metoder mangler evnen til raske målinger i et stort område av en celle, som krever mange påfølgende observasjoner på hver piksel og datainnsamling i rekkefølgen av sekunder.
N & B er en forenklet versjon av PCH som bare vurderer første og andre øyeblikk av amplituden til den fluorescens fordelingen, nemlig gjennomsnittlig intensitet, og variansen, σ2 (figur 2)18,19 og på grunn av det, kan det ikke bestemme molar brøkdel av ukjent oligomers i en blanding, men bare anslår den gjennomsnittlige oligomerisering tilstand av blandingen. N & B har imidlertid fordelen av å arbeide med relativt mindre tidsserier av bilder av levende celler enn PCH på piksel for piksel basis, ganske enkelt ved å overvåke svingningene på tidspunktet for fluorescens intensitet. Fordi N & B reduserer tiden per piksel til noen få mikrosekunder, kan den følge rask oligomerisering Kinetics over store celleområder, slik at bildeinnhenting på en tidsskala på sekunder i raster skanning mikroskopi (f.eks. konfokalmikroskopi, 2-Foton) og millisekunder i kamerabasert mikroskopi (f.eks. TIRFM).
Flere rapporter har vist evnen til N & B å kvantifisere antall under enheter i protein klynger av Imaging utvidede celleområder. Paxillin-EGFP klynger ble oppdaget ved vedheft steder i CHO-K1 celler25, og intracellulære aggregering av patogene Httex1p peptid ble beskrevet i cos-7 celler26. N & B ble søkt om etter den ligand-drevne oligomerisering av ErbB reseptor27, og effekten av ligand FGF21 på KLOTHOB (KLB) og FGFR1c i jakten på cellene28. Kombinasjonen av TIRF Imaging og N & B analyse ble brukt for å vise at dynamin-2 er primært tetramerisk gjennom hele cellemembranen29. Vi anvendt N & B å begge to raster skanning og TIRF profilen å bevise ligand-kjørt dimerization av uPAR og FGFR1 cellen membran reseptorer30,31.
Fluorescens korrelasjons metoder, slik som N & B, FCS og PCH, er basert på forestillingen om at okkupasjons antallet partikler i et åpent volum følger en Poisson-fordeling. Fordi bare fotoner at fluorophores avgir kan oppdages, gjennomsnittlig verdi for en målt fluorescens intensitet versus tid i en piksel av bildet, <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> </img>er produktet av gjennomsnittlig antall fluorophores i belysning volum, n, og deres molekylær lysstyrke, ε17:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
der ε uttrykkes som antall fotoner som slippes ut per tidsenhet (konvensjonelt per sekund) per molekyl når molekylet er midt i belysnings volumet.
Lysstyrke er en egenskap ved hver fluoroforen i et gitt oppkjøp satt opp, mens intensiteten er summen av alle bidrag fra alle fluorophores. I biologiske konkurranser vil lysstyrken øke med økningen av antall fluorophores som svinger sammen, noe som gir informasjon om oligomerisering tilstand av det fluorescensmerkete proteinet. Svingningene amplituder ved en gitt piksel måles fra variansen i fluorescens signalet, σ2:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
Der gjennomsnittet av kvadratet av intensitet, <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> </img>og kvadratet av gjennomsnittet av intensitet, <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> </img>er beregnet fra de enkelte intensitet verdier i hver piksel i hver ramme:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
der K er antallet totale del bilder i tidsserien. Eksperimentelt, er det nødvendig å beregne for hele bildet serien variansen som beskriver spredningen av de enkelte intensitet verdier på hver piksel i et enkelt bilde rundt gjennomsnittet intensitet verdi. Variansen omfatter alle svingninger i ulik opprinnelse. I en første tilnærming kan variansen som skyldes de spre partiklene i belysnings volumet, σ20, skilles fra variansen på grunn av at detektoren skjøt støy, σ2d. De to avvikene er uavhengige. Dermed blir den totale variansen gitt av deres sum:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
Variansen, på grunn av molekylære svingninger inn og ut av deteksjons volumet, er lineært avhengig av molekyl lysstyrke og intensitet:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
Omorganisere EQ. 6 i henhold til EQ. 1:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
Ifølge den typiske konseptet i fluorescens korrelasjon spektroskopi, ligningen 7 fastslår at variansen på grunn av antall svingninger avhenger av kvadratet av partikkel lysstyrken.
Deretter er variansen på grunn av detektor svingninger en lineær funksjon av den oppdagede intensiteten, under forutsetning av at detektoren betjenes under metnings grensen19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
Når det gjelder Foton telle detektorer a= 1 og c= 0, dermed detektor avviket er lik den gjennomsnittlige intensiteten:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
For å anvende disse begrepene på reelle målinger i levende celler, Gratton og kolleger18 definere den åpenbare lysstyrken, B, for hver piksel som forholdet mellom variansen over gjennomsnittlig intensitet:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B er parameteren som måles eksperimentelt. I dette arbeidet, tid serie bilder av FGFR1 reseptorer på plasma membranen av HeLa celler er fanget av TIRF mikroskopi og den gjennomsnittlige tilsynelatende lysstyrken, B, bestemmes av N & B-analyse. Deretter, etter tilsetning av FGF2, er påfølgende tidsserier tatt for å følge endringene i selv-montering av reseptoren molekyler i membranen overflaten etter stimulering av reseptoren med den kanoniske ligand.
Men siden detektoren til TIRF-mikroskopet er et EMCCD-kamera, må uttrykket for den tilsynelatende lysstyrken endres som19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
der forskyvning er intensiteten forskyvning av deteksjons elektronikken som er karakteristisk for detektor innstillingene. Variansen og gjennomsnittlig intensitet for en analog detektor er henholdsvis gitt av:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
der G er analog gevinst i digitale nivåer (DL/fotoner), S, den digitale nivåer per Foton19, er gitt ved skråningen av en intensitet versus varians tomten for en lyskilde med konstant intensitet (ingen timelige svingninger). Den γ faktoren er knyttet til formen på piksel deteksjons volumet. Alt etter Hassler et al.32, det γ faktoren er lik å 0,3 for TIRF tenkelig arbeider for det maksimum fortjene av oppdagelsen kameraet19. Offset-, S-og G-parametrene er kjennetegn på kameraet og mikroskopet. Den tilsynelatende lysstyrken, B, oppnås ved å omorganisere EQ. 11 i henhold til EQ. 12 og 13:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
Eksperimentelt, ε er en kompleks funksjon av laser intensitet og deteksjon effektiviteten av systemet. Likevel, siden B/S er lineært avhengig av ε, er det bare viktig å bestemme den relative verdien av ε for en gitt deteksjons modus:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
der ε ' er proporsjonal med ε. Likevel utføres en kalibrering ved hjelp av en intern referanse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum 98% minimun</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>21063029</td>
			<td>Used serum free for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high-glucose GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>Used for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0515-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitting system Photometrics DV2</td>
			<td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td>10% inactivated supplement for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes</td>
			<td>MatTek, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>uncoated, glass thickness 0.17 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells</td>
			<td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CB_08011102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software</td>
			<td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td>
			<td></td>
			<td>This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&#38;B time series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Executable N&#38;B routine</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab v.2018b</td>
			<td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x</td>
			<td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td>
			<td>LONZA 17-602E</td>
			<td>supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100&#181;g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector</td>
			<td>Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td>Zamai et al., 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGF2</td>
			<td>PeproTech EC, Ltd., London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate GIBCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>1mM supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIt-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid 10 mL</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513 859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM2618</td>
			<td>0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis

Til tross for viktigheten og ubiquity av reseptor oligomerisering, er det få metoder som gjelder for å oppdage klynge hendelser og måle graden av klynger. Her beskriver vi en tenkelig tilnærming for å bestemme den gjennomsnittlige oligomer tilstand mEGFP-Tagged-reseptor homocomplexes i membranen av levende celler. Protokollen er basert på total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi kombinert med tall og lysstyrke (N & B) analyse. N & B er en metode som ligner på fluorescens-korrelasjon spektroskopi (FCS) og Foton telling histogram (PCH), som er basert på statistisk analyse av svingningene i fluorescens intensiteten av fluorophores spre inn og ut av en belysning volum under en observasjonstid. Spesielt er N & B en forenkling av PCH for å få informasjon om gjennomsnittlig antall proteiner i oligomer blandinger. Intensiteten svingninger amplituder er beskrevet av den molekylære lysstyrken på fluoroforen og gjennomsnittlig antall fluorophores innenfor belysning volum. Således, N & B vurderer bare første og andre øyeblikk av amplitude fordelingen, nemlig gjennomsnittet intensitet og varians. Dette er, på samme tid, styrken og svakheten av metoden. Fordi bare to momenter blir vurdert, kan N & B ikke bestemme molar brøkdel av ukjent oligomers i en blanding, men det bare anslår den gjennomsnittlige oligomerisering tilstand av blandingen. Likevel, det kan brukes til relativt liten tid serien (sammenlignet med andre øyeblikk metoder) av bilder av levende celler på en piksel-for-piksel basis, bare ved å overvåke tiden svingninger av fluorescens intensitet. Det reduserer effektiv tid per piksel til noen få mikrosekunder, slik at anskaffelse i tidsintervallet av sekunder til millisekunder, noe som er nødvendig for rask oligomerisering Kinetics. Til slutt kan store celleområder samt sub-cellulære rom utforskes.

Resultatene for to representative HeLa-mEGFP-FGFR1 celler seeded i samme kultur parabolen er vist i figur 5 og supplerende tabell 1. De to cellene ble fanget på tid 0 min (figur 5a, topp) og 7 min (figur 5a, bunn) etter tilsetning av FGF2 ligand.
Figur 5 viser...

Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Vi beskriver en tenkelig tilnærming for fastsettelse av gjennomsnittlig oligomer tilstand mEGFP-Tagged-reseptor oligomers indusert av ligand binding i plasma membranen av levende celler. Protokollen er basert på total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi kombinert med tall og lysstyrke (N & B) analyse.

Oligomerisering Dynamics av Cell Surface reseptorer i levende celler av total intern refleksjon fluorescens mikroskopi kombinert med tall og lysstyrke analyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Reseptor klynger er allestedsnærværende og ofte nødvendig for signalisering en kaskade aktivering. Få metoder er imidlertid tilgjengelige for å måle graden av klynger. Vi bruker total intern refleksjon fluorescens, TIRF mikroskopi, for å følge diffusjonen av FGFR1-mEGFP molekyler i plasmamembranen av levende celler.Deretter bruker vi talllyshet, N&B-analysen, for å beskrive dynamikken i stimulert reseptorklynging. TIRF er ideell for rask temporal avbildning av molekylære hendelser som oppstår nær celleoverflaten, mens N&B bestemmer den gjennomsnittlige oligomeriske tilstanden til fluorescerende molekyler basert på hvor diffusjon inn og ut belysningsvolumet av mikroskopet. Faktisk er dette et verktøy for å koble den romlige temporale organiseringen av reseptorene på celleoverflaten der de signaliserer.N&B trenger bare tilgang til et mikroskop med en rask oppkjøpsmodul. Du kan analysere stort område av levende celler som bare har grunnleggende kunnskap om fluorescenssvingninger metoder. Denne metoden kan brukes på proteiner som danner dimers eller klynger og kan være stoichiometrically merket med fluorescerende fargestoff.Hvis proteinene er i intracellulære rom, brukes andre typer mikroskoper til å anskaffe bildene. Det er viktig å forberede en konstruksjon som uttrykker fluoroforformen for å måle under eksperimentelle forhold den rene monomeriske lysstyrken som en kontroll. På den første dagen, frø HeLa celler i 1,5 milliliter av komplett medium i en konsentrasjon på 100,000 til 200, 000 celler per milliliter i glass-bunn retter.Seed seks til åtte replikere retter, og inkubere i en inkubator på 37 grader Celsius. På den andre eller tredje dagen har cellene nådd subkonfluens. Tilsett serumfritt medium med proteinplasmid til halvparten av rettene, og legg til referanseplasmider med monomer og dimer til andre halvdel av rettene for å transfisere cellene.Etter en dag må du kontrollere at de trans infiserte cellene er festet til bunnen av oppvasken og cellemembranen er fluorescerende. Kast retter med overgrodde celler eller med svært lav fluorescens. Fire timer før eksperimentet, aktiver temperaturinkubatoren av mikroskopet ved 37 grader Celsius.Slå på mikroskopet, datamaskinene og kameraene, og vent til kameraene når riktig arbeidstemperatur på minus 75 grader Celsius. Legg en liten dråpe olje på objektivobjektivet. Sett en prøverett i inkubatoren av mikroskopet, og lukk dørene til inkubatoren for å la temperaturen på parabolen likevekt i 10 minutter.Slå på epifluorescence lampen og 488-nanometer laser. Velg kontrastmodusen epifluorescence for å utforske prøven, og søk i en celle for å fokusere fra okulær linse. Velg riktig filter for å samle det grønne utslippet gjennom mikroskopkameraet med bandpass Ex 490/20 500 og bandpass Em 525/50 eller lignende.Bytt fra okulær til cam rapport i epifluorescence modus. Finjuster fokuset, og bytt til TIRF-modus. Aktiver deretter automatisk justering ved å følge instruksjonene i TIRF-mikroskopet.Velg en passende belysningsdybde, og optimaliser retningen på evanescent-feltet. Bytt til et annet kamera. Definer et område av interesse på minst 256 og 256 piksler.Sett eksponeringen til ett millisekund og EM-gevinsten til 1 000. Juster laserkraften til 0,5 milliwatt. Det er nødvendig å ha litt informasjon om proteinets diffusjonskoeffisient fordi eksponeringstiden må være kortere enn gjennomsnittlig tid brukt av fluorescerende molekyler i det lysende volumet.Kjør en første prøvesekvens under innledende forhold, og anslår omtrent signal-til-støy-verdien. Forholdene er akseptable ved signal-til-støy lik to til tre eller høyere målt i første gangs serie. Bruk deretter glidebryteren på utslippssplittingssystemet som kobler kamera nummer to til mikroskopet for å maskere en side av bildet.Velg alternativet for automatisk lagring av kamerafilen. Start oppkjøpet av bildeserien for minst 700 bilder med et minimum signal-til-støy-forhold på to. Uten å ta parabolen ut av mikroskopet, legg til ligand.Velg en celle med en lys fluorescensmembran, og start raskt første gangs serie av kinetisk løp. Søk i en annen celle, og hent det andre tidspunktet for kinetikken. Fang opp en ny celle for hvert tidspunkt for kinetisk kjøring.For hver ny rett, gjenta justeringen av laserlinjen og optimalisering av TIRF belysning. Nå konvertere og lagre bildefiler ervervet med kameraet programvare som tif filer. Importer tif filer i analyse programvare rutine ved å aktivere N & B grafisk bruker interphase MATLAB.Kast serier som den gjennomsnittlige intensitetsprofilen viser mer enn 10% fotobleaching og serier der det har vært en tydelig cellemembranforvrengning eller oversettelse under oppkjøpet. Beskjære rammer som tydeligvis er ute av fokus. Hold for analysen bare serien med minst 500 tidsrammer.Først bestemme kameraparametrene. Aktiver det rutinemessige kalibrere kameraet. Velg et område på minst 20 og 50 piksler i detektorstøyområdet.I loggfrekvensen kontra digital nivåplott flytter du den lineære røde markøren for å avgrense gaussianeren i den lineære delen av kurven. Aktiver B-tasten. Påfør et minimum binning på 2,2 for å redusere spredningen av dataene og for å generere B-I histogrammet.Bruk den iterative firkantede markøren til å inspisere B-I histogrammet. Velg en firkantet avkastning for analysen, og generer B-kartet for den valgte avkastningen. Deretter lagrer du ASCII-filen for B-verdiene som er knyttet til valget.Importer ASCII i en grafikkprogramvare for å beregne frekvensfordelingen av dataene og få gjennomsnittlig B-verdi pluss eller minus S.E.Bruk epsilon-ligningen for å utlede gjennomsnittlig lysstyrke for hver celle på hvert tidspunkt i den kinetiske kjøringen. Normaliser dataene i henhold til normaliseringsligningen, der B't er den gjennomsnittlige B-verdien målt til rett tid t etter ligand tillegg og B'0 er den gjennomsnittlige B-verdien målt på tidspunktet t er lik null, som er 10 til 20 sekunder etter ligand additino. Plott den normaliserte gjennomsnittlige lysstyrken kontra oppkjøpstid for å bygge det kinetiske løpet.I denne studien, representative resultater fra to HeLa celler i samme rett uttrykker mEGFP-FGR1 fanget på tid null og syv, etter tillegg av 20 nanograms per milliliter FGF2, vises her. Sammenlignet med referansekonstruksjonene, GPI-mEGFP og GPI-mEGFP-mEGFP-dimer, viser hele analysesekvensen den gjennomsnittlige intensiteten i tidsseriene. Plott av alle B-verdier.B-I histogrammet. B-kart over den valgte avkastningen. Og den tilhørende B-distribusjon histogrammet.Etter stimulering med 20 nanogram per milliliter FGF2, representative kinetiske kjører viser gjennomsnittlig lysstyrke som funksjon av tid beskriver den langsomme prosessen med dimerisering som vedvarer i flere minutter på celleoverflaten. Når stimulert med 50 mikrogram per milliliter NCAM-Fc, avslører den kinetiske profilen raske og sykliske overganger av reseptoren i oligomeriske blandinger, som også når lysstyrkeverdier over dimeren. En normalisert gjennomsnittsverdi på tre observeres gjentatte ganger.Det er viktig å minimere de ekstra variantene på grunn av ingen molekylære svingninger og bleking. Og celler må være godt festet til glassbunnsfatet, ikke overgrodd, og ikke stablet opp. Hvis vi er interessert i et protein som sprer seg raskere inne i intracellulære rom, kan vi bruke raskere null ganger og bruke skanning på fokale eller multiphoton mikroskoper for å bilde inne i cellen.Med vår tilnærming minimerer vi de skadelige effektene av fotografering når vi ønsker å utforske dynamikken i hendelser som dimerisering. Disse hendelsene kontrollerer en rekke cellulære svar og er svært vanskelig å bevise i levende celler med andre teknikker.

Research

JoVE Journal

Biology

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative Live-Cell fluorescens-mikroskopi Analyse av Fission gjær

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorescens Imaging med One-nanometer Nøyaktighet (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse av Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Ved hjelp av Sult Pads i kombinasjon med Fluorescensmikroskopi

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics med variabel vinkel epifluorescens Mikros

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Lys Sheet Fluorescensmikroskopi av planterøttene vokser på overflaten av en Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-partikkel Analyse for Super-oppløsning Mikroskopi med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersøkelse av mitotisk og Meiotic fisjon gjær Nuclear Dynamics av fluorescens Live-Cell mikroskopi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...