Name: oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

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1. Preparação da amostra
<ol><li>Dia 1. Células HeLa semente em meio completo em uma concentração de 100.000-200.000 células / mL em pratos de fundo de vidro. Sementes 6-8 replicar pratos. Nota: Neste exemplo, o meio é complementado com 10% de calor inativado Fetal Bovine Serum (FBS), 1 mM piruvado de sódio, 100 U/100 μg penicilina/estreptomicina. Vários pratos de replicar são preparados.</li>
	<li>Dia 2-3. Quando as células estão em sub-confluência, transfect metade dos pratos com o p...

<ol>
	<li>Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+insights+into+gonadotropin+hormone+receptor+dimerization+and+oligomerization.">Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization.</a> Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).</li><li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited:+functional+and+pharmacological+perspectives.">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).</li><li>Marsango, S., Ward, R. 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(142), (2018).</li></ol>

A N&B requer várias precauções na escolha do modelo celular e da estratégia de rotulagem. Ele pode ser aplicado apenas para células vivas que permanecem aderidas de forma enova durante o tempo de captura de imagem. Flutuações extras devido ao deslocamento rígido de toda a célula podem ser tratadas com abordagens adequadas de restauração de imagem38. No entanto, geralmente quando uma célula se move, a membrana celular também se deforma, e a deformação da estrutura, produzindo grande ...

Descrevemos uma abordagem de imagem total de reflexão interna fluorescência-número e brilho (TIRF-N&B) para determinar o estado oligomérico médio das moléculas receptoras na membrana plasmática das células vivas, com o objetivo de vincular a montagem do receptor dinâmica para a função biológica das proteínas (Figura 1).
Após a ligação extracelular do ligand, os receptores iniciam a transdução de sinal intracelular dependendo de sua conformação, oligomerização, potenciais co-receptores e composição da membrana. Apesar da importância e ubiquidade da oligomerização do receptor, reconhecida como um evento-chave na sinalização celular1,2,3,4,5,6, 7,poucos métodos podem detectar eventos de agrupamento e medir o grau de agrupamento experimentalmente8,9. O volume confocal (x, y - 300 nm, z 900 nm) é insuficientemente resolvido para provar a interação molecular e stoichiometria, mesmo após a otimização por algoritmos de restauração de imagem10. A composição sub-unitária de oligomeros proteicos não pode ser resolvida de forma puramente espacial, mesmo por métodos de super-resolução em x,y resolução de 20-70 nm, como PALM11, STORM12,e STED13. Além disso, sua resolução temporal (na ordem dos minutos por imagem) não pode seguir a cinética na faixa de segundos. Único molécula passo-branqueamento resolve a stoichiometria de oligomeros de proteína apenas se eles são imóvel14.
Um dos métodos mais versáteis para medir a densidade e o oligomerização de proteínas fluorescentes marcadas dentro de imagens individuais é a análise de distribuição de intensidade espacial (SpIDA), que depende da amostragem espacial. É aplicável a células quimicamente fixas e vivas, e permite a análise de várias regiões de interesse da célula simultaneamente usando microscopia fluorescência padrão15. Alternativamente, métodos momentâneos, como espectroscopia fluorescência-correlação (FCS)16,fótons contando histograma (PCH)17, e Número e Brilho (N&B)18,19, são adequados para oligomer quantitativo Medidas. Esses métodos analisam as flutuações de intensidade da fluorescência que podem ser observadas no tempo em que os fluorofforas se difundem dentro e fora de um volume de iluminação. As amplitudes das flutuações de intensidade podem ser descritas exclusivamente pelo brilho molecular do fluorofforre (ε) e pelo número médio de fluorofônicos (n) dentro do volume de iluminação17 (Figura 2). Normalmente, o coeficiente de difusão dos fluorofforos e o número médio de moléculas (inversamente relacionadas ao valor G(0) dentro do volume de iluminação podem ser obtidos pela FCS20. No entanto, uma vez que o tempo de difusão apenas escalas com a raiz cúbica da massa, FCS não é suficientemente sensível para detectar alterações na massa molecular21. Na prática, a FCS de cor única não consegue detectar a dimerização dos receptores de membrana. PCH resolve misturas de diferentes oligomeros com precisão. Usando mais de dois momentos da distribuição da amplitude, detecta moléculas do brilho diferente que ocupam o mesmo volume da iluminação. Digitalização FCS22 e desenvolvimentos, como a interessante par-correlação de brilho molecular (pCOMB) abordagem23, introduzido para estender a gama de aplicabilidade dos métodos de correlação fluorescência em sistemas biológicos24 , permanecem métodos de ponto único sem a capacidade de medições rápidas em uma grande área de uma célula, exigindo muitas observações consecutivas em cada pixel e aquisição de dados na ordem de segundos.
A N&B é uma versão simplificada do PCH que considera apenas o primeiro e segundo momentos da amplitude da distribuição de fluorescência, ou seja, a intensidade média, e a variação, σ2 (Figura 2)18,19 e, por causa disso, não pode determinar a fração molar de oligomeros desconhecidos em uma mistura, mas estima somente o estado médio do oligomerization da mistura. No entanto, a N&B tem a vantagem de trabalhar com uma série de imagens de imagens de células vivas relativamente menores do que a PCH em uma base pixel-a-pixel, simplesmente monitorando as flutuações no tempo da intensidade da fluorescência. Como a N&B reduz o tempo por pixel para alguns microssegundos, ela pode seguir cinética de oligomerização rápida sobre grandes áreas celulares, permitindo a aquisição de imagem em uma escala de tempo de segundos em microscopia de varredura de raster (por exemplo, confocal, 2 fótons) e milissegundos em microscopia baseada em câmera (por exemplo, TIRFM).
Vários relatos demonstraram a capacidade da N&B de quantificar o número de subunidades em aglomerados de proteínas por meio de imagens de regiões celulares estendidas. Os clusters Paxillin-EGFP foram detectados nos locais de adesão nas células CHO-K125,e a agregação intracelular do peptídeo httex1p patogênico foi descrita nas células COS-726. A N&B foi aplicada para seguir a oligomerização ativa da ligand do receptorErbB 27,e o efeito do ligand FGF21 em Klothob (KLB) e fgfr1c em célulasHeLa 28. A combinação de imagens tirf e análise de N&B foi usada para mostrar que a dinamina-2 é principalmente tetramérica em toda a membrana celular29. Aplicamos a N&B a imagens de varredura de raster e TIRF para provar a dimerização conduzida por ligand dos receptores de membrana celular uPAR e FGFR130,31.
Métodos de correlação de fluorescência, como N&B, FCS e PCH, são baseados na noção de que, em um volume aberto, o número de bolhas de partículas segue uma distribuição de Poisson. Como somente os fótons que os fluorofônicos emitem podem ser detectados, o valor médio para uma intensidade <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> </img>de fluorescência medida versus o tempo em um pixel da imagem, é o produto do número médio de fluorofosforas no volume de iluminação, n, e sua brilho molecular, ε17:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
onde o ε é expresso como o número de fótons emitidos por unidade de tempo (convencionalmente por segundo) por molécula quando a molécula está no centro do volume de iluminação.
O brilho é propriedade de cada fluorofofóbico em uma determinada aquisição criada, enquanto a intensidade é a soma de todas as contribuições de todos os fluorofos. Em competições biológicas, o brilho aumentará com o aumento do número de fluorofos que flutuam junto, dando a informação no estado do oligomerization da proteína fluorescente-etiquetada. As amplitudes de flutuação em um determinado pixel é medido a partir da variação do sinal de fluorescência, σ2:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
Onde a média do quadrado <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> </img>de intensidade, e o quadrado <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> </img>da média de intensidade, são computados a partir dos valores de intensidade individual em cada pixel de cada quadro:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
onde K é o número de quadros totais na série de tempo. Experimentalmente, é necessário calcular para toda a série de imagens a variação que descreve a dispersão dos valores de intensidade individual em cada pixel de uma única imagem em torno do valor de intensidade média. A variação inclui todas as flutuações de diferentes origens. Em uma primeira aproximação, a variação devido às partículas de difusão no volume de iluminação, σ20,pode ser separada da variância devido ao ruído do tiro do detector, σ2d. As duas variações são independentes; assim, a variação total é dada por sua soma:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
A variação, devido a flutuações moleculares dentro e fora do volume de detecção, é linearmente dependente do brilho e intensidade moleculares:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
Reorganizando eq. 6 de acordo com o eq. 1:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
De acordo com o conceito típico de espectroscopia de correlação de fluorescência, a equação 7 afirma que a variação devido ao número de flutuações depende do quadrado do brilho das partículas.
Em seguida, a variação devido às flutuações do detector é uma função linear da intensidade detectada, a suposição de que o detector é operado abaixo de seu limite de saturação19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
No caso dos detectores de contagem de fótons =1e c=0, assim a variação do detector é igual à intensidade média:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
Para aplicar esses conceitos a medições reais em células vivas, Gratton e colegas18 definem o brilho aparente, B, para cada pixel como a proporção da variação sobre a intensidade média:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B é o parâmetro que é medido experimentalmente. Neste trabalho, imagens de séries de tempo de receptores FGFR1 na membrana plasmática das células HeLa são capturadas pela microscopia TIRF e o brilho aparente médio, B, é determinado pela análise de N&B. Então, após a adição de FGF2, séries de tempo consecutivos são capturadas para acompanhar as mudanças na auto-montagem das moléculas receptoras na superfície da membrana após a estimulação do receptor com o ligand canônico.
No entanto, uma vez que o detector do microscópio TIRF é uma câmera EMCCD, a expressão para o brilho aparente precisa ser modificada como19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
onde o deslocamento é o deslocamento da intensidade da eletrônica da deteção que é uma característica das ajustes do detetor. A variação e a intensidade média de um detector analógico são, respectivamente, dadas por:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
onde G é o ganho analógico em níveis digitais (DL/fótons), S, os níveis digitais por fóton19, é dado pela inclinação de uma intensidade versus variação parcela para uma fonte de luz com intensidade constante (sem flutuações temporais). O fator γ está relacionado à forma do volume de detecção de pixels. De acordo com Hassler et al.32,o fator γ é igual a 0,3 para imagens TIRF trabalhando no ganho máximo da câmera de detecção19. Os parâmetros de deslocamento, S e G são características da câmera e do microscópio. O brilho aparente, B, é obtido reorganizando eq. 11 de acordo com eq. 12 e 13:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
Experimentalmente, o ε é uma função complexa da intensidade do laser e da eficiência de detecção do sistema. No entanto, uma vez que B / S é linearmente dependente de ε, só é importante determinar o valor relativo do ε para um determinado modo de detecção:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
onde o ε' é proporcional ao ε. Ainda assim, uma calibração é realizada usando uma referência interna.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum 98% minimun</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>21063029</td>
			<td>Used serum free for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high-glucose GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>Used for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0515-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitting system Photometrics DV2</td>
			<td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td>10% inactivated supplement for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes</td>
			<td>MatTek, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>uncoated, glass thickness 0.17 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells</td>
			<td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CB_08011102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software</td>
			<td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td>
			<td></td>
			<td>This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&#38;B time series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Executable N&#38;B routine</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab v.2018b</td>
			<td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x</td>
			<td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td>
			<td>LONZA 17-602E</td>
			<td>supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100&#181;g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector</td>
			<td>Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td>Zamai et al., 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGF2</td>
			<td>PeproTech EC, Ltd., London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate GIBCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>1mM supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIt-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid 10 mL</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513 859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM2618</td>
			<td>0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis

Apesar da importância e ubiquidade da oligomerização do receptor, poucos métodos são aplicáveis para detectar eventos de agrupamento e medir o grau de agrupamento. Aqui, descrevemos uma abordagem de imagem para determinar o estado oligomérico médio de homocomplexos do receptor marcado pelo mEGFP na membrana das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&B). A N&B é um método semelhante à espectroscopia fluorescência-correlação (FCS) e fótons contando histograma (PCH), que são baseados na análise estatística das flutuações da intensidade da fluorescência da fluorofia difundindo dentro e fora de uma iluminação volume durante um tempo de observação. Em particular, a N&B é uma simplificação da PCH para obter informações sobre o número médio de proteínas em misturas oligoméricas. As amplitudes da flutuação da intensidade são descritas pelo brilho molecular do fluorophore e pelo número médio de fluorophores dentro do volume da iluminação. Assim, a N&B considera apenas o primeiro e segundo momentos da distribuição de amplitude, ou seja, a intensidade média e a variação. Esta é, ao mesmo tempo, a força e a fraqueza do método. Como apenas dois momentos são considerados, a N&B não pode determinar a fração molar de oligomeros desconhecidos em uma mistura, mas estima apenas o estado médio de oligomerização da mistura. No entanto, ele pode ser aplicado a séries de tempo relativamente pequenas (em comparação com outros métodos de momento) de imagens de células vivas em uma base pixel-a-pixel, simplesmente monitorando as flutuações de tempo da intensidade da fluorescência. Ele reduz o tempo eficaz por pixel para alguns microssegundos, permitindo a aquisição no intervalo de tempo de segundos a milissegundos, o que é necessário para cinética de oligomerização rápida. Finalmente, grandes áreas celulares, bem como compartimentos subcelulares podem ser explorados.

Os resultados de duas células representativas HeLa-mEGFP-FGFR1 semeadas no mesmo prato cultural são mostrados na Figura 5 e na Tabela Suplementar 1. As duas células foram capturadas no tempo 0 min(Figura 5A, superior) e 7 min(Figura 5A, inferior) após a adição do ligand FGF2.
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Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Descrevemos uma abordagem de imagem para a determinação do estado oligomérico médio de oligomeros de receptores marcados por mEGFP induzidos pela ligação de ligand na membrana plasmática das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&B).

Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

O agrupamento de receptores é onipresente e muitas vezes necessário para a sinalização de uma ativação em cascata. No entanto, poucos métodos estão disponíveis para medir o grau de agrupamento. Usamos fluorescência de reflexão interna total, microscopia DE TIRF, para acompanhar a difusão de moléculas FGFR1-mEGFP na membrana plasmática das células vivas.Em seguida, aplicamos brilho numérico, a análise de N&B, para descrever a dinâmica do agrupamento estimulado do receptor. O TIRF é ideal para imagens temporais rápidas de eventos moleculares que ocorrem perto da superfície celular, enquanto n&B determina o estado oligomerico médio de moléculas fluorescentes com base em onde a difusão entra e sai do volume de iluminação do microscópio. Na verdade, esta é uma ferramenta para conectar a organização temporal espacial dos receptores na superfície celular onde eles estão sinalizando.A N&B só precisa do acesso a um microscópio com um módulo de aquisição rápida. Você pode analisar grandes áreas de células vivas tendo apenas o conhecimento básico dos métodos de flutuação da fluorescência. Este método pode ser aplicado a proteínas que formam dimers ou clusters e podem ser rotulados estequiometricamente com o corante fluorescente.Se as proteínas estiverem em compartimentos intracelulares, outros tipos de microscópios são usados para a aquisição das imagens. É importante preparar uma construção que expresse a forma monomérica do fluoróforo para medir em condições experimentais o brilho monomérico puro como controle. No primeiro dia, as células HeLa sementes em 1,5 mililitros de meio completo a uma concentração de 100.000 a 200.000 células por mililitro em pratos de fundo de vidro.Sementes de seis a oito replicam pratos, e incubam em uma incubadora a 37 graus Celsius. No segundo ou terceiro dia, as células atingiram a subconfluência. Adicione meio sem soro com plasmídeo de proteína a metade dos pratos, e adicione plasmídeos de referência com o monômero e mais escuro à segunda metade dos pratos para transfetar as células.Depois de um dia, verifique se as células transfeinadas são aderentes ao fundo dos pratos e a membrana celular é fluorescente. Descarte pratos com células crescidas ou com fluorescência muito baixa. Quatro horas antes do experimento, ative a incubadora de temperatura do microscópio a 37 graus Celsius.Ligue o microscópio, computadores e câmeras, e espere que as câmeras atinjam a temperatura de trabalho adequada de menos 75 graus Celsius. Coloque uma pequena gota de óleo na lente objetiva. Coloque um prato de amostra na incubadora do microscópio, e feche as portas da incubadora para deixar a temperatura do prato equilibrar por 10 minutos.Ligue a lâmpada de epifluorescência e o laser de 488 nanômetros. Selecione o modo de contraste de epifluorescência para explorar a amostra, procurando uma célula para se concentrar a partir da lente ocular. Selecione o filtro adequado para coletar a emissão verde através da câmera de microscópio com bandpass Ex 490/20 500 e bandpass Em 525/50 ou similar.Mude do ocular para o relatório da câmera no modo de epifluorescência. Refine o foco e mude para o modo TIRF. Em seguida, ative o alinhamento automático seguindo as instruções do microscópio TIRF.Escolha uma profundidade de iluminação adequada e otimize a direção do campo evanescente. Mude para uma segunda câmera. Defina uma região de interesse de pelo menos 256 por 256 pixels.Ajuste a exposição a um milissegundo e o ganho em EM para 1.000. Ajuste a potência do laser para 0,5 miliwatts. É necessário ter algumas informações sobre o coeficiente de difusão da proteína, pois o tempo de exposição deve ser menor do que o tempo médio gasto pelas moléculas fluorescentes no volume luminado.Execute uma primeira sequência de ensaios em condições iniciais, e aproximadamente estime o valor de sinal para ruído. As condições são aceitáveis em sinal-a-ruído igual a dois a três ou mais, conforme medido na primeira série. Em seguida, use o controle deslizante do sistema de divisão de emissões conectando a câmera número dois ao microscópio para mascarar um lado da imagem.Selecione a opção de salvamento automático do arquivo da câmera. Inicie a aquisição da série de imagens por um mínimo de 700 quadros a uma relação sinal-ruído mínima de dois. Sem tirar o prato do microscópio, adicione o ligante.Selecione uma célula com uma membrana de fluorescência brilhante e inicie rapidamente a primeira série da corrida cinética. Procure uma segunda célula, e adquira o segundo ponto de tempo da cinética. Capture uma nova célula para cada ponto de tempo da corrida cinética.Para cada novo prato, repita o alinhamento da linha laser e a otimização da iluminação TIRF. Agora converta e salve os arquivos de imagem adquiridos com o software da câmera como arquivos tif. Importe arquivos tif na rotina do software de análise ativando o usuário gráfico de N&B interfase MATLAB.Série de descarte para a qual o perfil médio de intensidade mostra mais de 10% fotobleaching e séries em que houve uma evidente distorção ou tradução da membrana celular durante a aquisição. Quadros de corte que estão evidentemente fora de foco. Mantenha para a análise apenas séries com pelo menos 500 prazos.Primeiro determine os parâmetros da câmera. Ative a câmera de calibração de rotina. Selecione uma área de pelo menos 20 por 50 pixels na região de ruído do detector.Na frequência de log versus gráfico de nível digital, mova o cursor vermelho linear para delimitar o gaussiano na parte linear da curva. Ative a tecla B. Aplique um binning mínimo de 2,2 para reduzir a dispersão dos dados e gerar o histograma B-I.Use o cursor quadrado iterativo para inspecionar o histograma B-I. Selecione um ROI quadrado para a análise e gere o mapa B do ROI selecionado. Em seguida, salve o arquivo ASCII dos valores B associados à seleção.Importe o ASCII em um software gráfico para calcular a distribuição de frequência dos dados e obter o valor B médio mais ou menos S.E.Aplique a equação epsilon para derivar o brilho médio de cada célula em cada ponto de tempo da corrida cinética. Normalize os dados de acordo com a equação de normalização, onde B't é o valor B médio medido no momento t após a adição de ligante e B'0 é o valor B médio medido no momento em que t é igual a zero, que é de 10 a 20 segundos após ligante additino. Plote o brilho médio normalizado versus o tempo de aquisição para construir a corrida cinética.Neste estudo, resultados representativos de duas células HeLa no mesmo prato expressando mEGFP-FGR1 capturado no tempo zero e sete, após a adição de 20 nanogramas por mililitro de FGF2, são mostrados aqui. Em comparação com os construtos de referência, GPI-mEGFP e dimer GPI-mEGFP-mEGFP, toda a sequência de análise mostra a intensidade média da série temporal. Enredo de todos os valores B.B-I histograma. Mapa B do ROI escolhido. E o histograma de distribuição B associado.Após a estimulação com 20 nanogramas por mililitro de FGF2, as corridas cinéticas representativas mostrando o brilho médio em função do tempo descrevem o lento processo de dimerização que persiste por vários minutos na superfície celular. Quando estimulado com 50 microgramas por mililitro de NCAM-Fc, o perfil cinético revela transições rápidas e cíclicas do receptor em misturas oligomeméricas, que também atinge valores de brilho acima do mais fraco. Um valor médio normalizado de três é repetidamente observado.É importante minimizar as variantes extras devido a não flutuações moleculares e branqueamento. E as células devem ser bem aderidas ao prato de fundo de vidro, não sobre-crescido, e não empilhados. Se estivermos interessados em uma proteína que difunde mais rápido dentro de compartimentos intracelulares, podemos aplicar zero vezes mais rápido e usar a varredura em microscópios focais ou multifotons para imagem dentro da célula.Com nossa abordagem, minimizamos os efeitos prejudiciais do fotobleaching quando queremos explorar a dinâmica de eventos como a dimerização. Esses eventos controlam uma variedade de respostas celulares e são muito difíceis de provar em células vivas com outras técnicas.

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