Name: oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
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1. Preparación de muestras
<ol><li>Día 1. Células HeLa de semillaen en medio completo a una concentración de 100,000-200,000 células / ml en platos con fondo de vidrio. Semilla 6-8 replicar platos. NOTA: En este ejemplo, el medio se complementa con 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor, piruvato sódico de 1 mM, 100 U/100 g de penicilina/estreptomicina. Se preparan varios platos replicados.</li>
	<li>Día 2-3. Cuando las células están en subconfluencia, transfectar la mitad de ...

<ol>
	<li>Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+insights+into+gonadotropin+hormone+receptor+dimerization+and+oligomerization.">Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization.</a> Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).</li><li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited:+functional+and+pharmacological+perspectives.">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).</li><li>Marsango, S., Ward, R. 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(142), (2018).</li></ol>

N&B requiere varias precauciones en la elección del modelo celular y la estrategia de etiquetado. Solo se puede aplicar a las celdas vivas que permanecen establemente adheridas durante el tiempo de captura de imágenes. Las fluctuaciones adicionales debidas al desplazamiento rígido de toda la celda podrían manejarse con los enfoques adecuados de restauración de imágenes38. Sin embargo, generalmente cuando una célula se mueve, la membrana celular también se deforma, y la deformación de la e...

Describimos un enfoque de imagen de Fluorescencia-Número de Fluorescencia Y Brillo de Reflexión Interna Total (TIRF-N&B) para determinar el estado oligomérico promedio de las moléculas receptoras en la membrana plasmática de las células vivas, con el objetivo de vincular el conjunto del receptor dinámica a la función biológica de las proteínas (Figura 1).
Tras la unión de ligandoextra extracelular, los receptores inician la transducción de la señal intracelular dependiendo de su conformación, oligomerización, posibles coreceptores y composición de la membrana. A pesar de la importancia y ubicuidad de la oligomerización de receptores, reconocido como un evento clave en la señalización celular1,2,3,4,5,6, 7, pocos métodos pueden detectar eventos de agrupación en clústeres y medir el grado de agrupación en clústeres experimentalmente8,9. El volumen confocal (x,y a 300 nm, z a 900 nm) no está suficientemente resuelto para probar la interacción molecular y la estequiometría, incluso después de la optimización por algoritmos de restauración de imágenes10. La composición de la subunidad de los oligómeros proteicos no puede resolverse sobre una base puramente espacial incluso mediante métodos de superresolución a resolución x,y de 20-70 nm como PALM11,STORM12y STED13. Además, su resolución temporal (en el orden de minutos por imagen) no puede seguir la cinética en el rango de segundos. El blanqueamiento escalonado de una sola molécula resuelve la estequiometría de los oligómeros proteicos sólo si están inmóviles14.
Uno de los métodos más versátiles para medir la densidad y el oligomerización de proteínas etiquetadas fluorescentes dentro de imágenes individuales es el análisis de distribución de intensidad espacial (SpIDA), que se basa en el muestreo espacial. Es aplicable tanto a células químicamente fijas como vivas, y permite el análisis de varias regiones de interés de la célula simultáneamente utilizando la microscopía de fluorescencia estándar15. Alternativamente, los métodos de momento, tales como espectroscopia de fluorescencia-correlación (FCS)16, histograma de recuento de fotones (PCH)17,y Número y brillo (N&B)18,19, son adecuados para el oligomer cuantitativo Medidas. Estos métodos analizan las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia que se pueden observar en el tiempo cuando los fluoróforos se difunden dentro y fuera de un volumen de iluminación. Las amplitudes de las fluctuaciones de intensidad pueden describirse de forma única por el brillo molecular del fluoróforo y el número medio de fluoróforos (n) dentro del volumen de iluminación17 (Figura 2). Típicamente, el coeficiente de difusión de los fluoróforos y el número medio de moléculas (inversamente relacionadas con el valor G(0)) dentro del volumen de iluminación se pueden obtener por FCS20. Sin embargo, dado que el tiempo de difusión sólo se escala con la raíz cúbica de la masa, el FCS no es lo suficientemente sensible para detectar cambios en la masa molecular21. En la práctica, fcS de un solo color no puede detectar la dimerización de los receptores de membrana. PCH resuelve mezclas de diferentes oligómeros con precisión. Utilizando más de dos momentos de la distribución de amplitud, detecta moléculas de diferente brillo que ocupan el mismo volumen de iluminación. Escaneando FCS22 y desarrollos, como la interesante correlación par del enfoque23del brillo molecular (pCOMB), introducido para ampliar el rango de aplicabilidad de los métodos de correlación de fluorescencia en los sistemas biológicos24 , siguen siendo métodos de un solo punto que carecen de la capacidad de mediciones rápidas en un área grande de una celda, lo que requiere muchas observaciones consecutivas en cada píxel y la adquisición de datos en el orden de segundos.
N&B es una versión simplificada de PCH que considera sólo el primer y segundo momento de la amplitud de la distribución de la fluorescencia, a saber, la intensidad media, , y la varianza, n.o2 (Figura 2)18,19 y, debido a eso, no puede determinar la fracción molar de los oligómeros desconocidos en una mezcla, pero sólo estima el estado medio de oligomerización de la mezcla. Sin embargo, N&B tiene la ventaja de trabajar con series temporales relativamente más pequeñas de imágenes de células en vivo que PCH en una base de píxel a píxel, simplemente monitoreando las fluctuaciones en el tiempo de la intensidad de la fluorescencia. Debido a que N&B reduce el tiempo por píxel a unos pocos microsegundos, puede seguir la cinética de oligomerización rápida en áreas de celdas grandes, lo que permite la adquisición de imágenes en una escala de tiempo de segundos en microscopía de escaneo ráster (por ejemplo, confocal, 2 fotones) y milisegundos de milisegundos microscopía basada en cámara (por ejemplo, TIRFM).
Varios informes han demostrado la capacidad de N&B para cuantificar el número de subunidades en los grupos de proteínas mediante imágenes de regiones celulares extendidas. Se detectaron grupos de Paxillin-EGFP en los sitios de adhesión en las células CHO-K125,y la agregación intracelular del péptido patógeno Httex1p se describió en las células COS-726. N&B se aplicó para seguir la oligomerización impulsada por ligando sorda del receptor ErbB27, y el efecto del ligando FGF21 en Klothob (KLB) y FGFR1c en las células De LaLa28. La combinación de imágenes TIRF y análisis N&B se utilizó para mostrar que el dinamina-2 es principalmente tetramírico en toda la membrana celular29. Aplicamos N&B tanto a las imágenes de escaneo ráster como a las imágenes TIRF para probar la dimerización impulsada por ligando sin efecto de los receptores de membrana celular uPAR y FGFR130,31.
Los métodos de correlación de fluorescencia, como N&B, FCS y PCH, se basan en la noción de que en un volumen abierto el número de ocupación de partículas sigue una distribución de Poisson. Debido a que sólo se pueden detectar los fotones que emiten los fluoróforos, el valor <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> </img>medio de una intensidad de fluorescencia medida frente al tiempo en un píxel de la imagen, , es el producto del número medio de fluoróforos en el volumen de iluminación, n, y su brillo molecular,17:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
donde se expresa como el número de fotones emitidos por unidad de tiempo (convencionalmente por segundo) por molécula cuando la molécula está en el centro del volumen de iluminación.
El brillo es una propiedad de cada fluoróforo en una adquisición determinada establecida, mientras que la intensidad es la suma de todas las contribuciones de todos los fluoróforos. En los concursos biológicos, el brillo aumentará con el aumento del número de fluoróforos que fluctúan juntos, dando información sobre el estado de oligomerización de la proteína etiquetada fluorescentemente. Las amplitudes de fluctuación en un píxel dado se miden a partir de la varianza de la señal de fluorescencia,n.o 2:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
Donde la media del cuadrado <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> </img>de intensidad, , y el <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> </img>cuadrado de la media de intensidad, , se calculan a partir de los valores de intensidad individuales en cada píxel de cada fotograma:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
donde K es el número total de fotogramas de la serie temporal. Experimentalmente, es necesario calcular para toda la serie de imágenes la varianza que describe la dispersión de los valores de intensidad individuales en cada píxel de una sola imagen alrededor del valor de intensidad media. La varianza incluye todas las fluctuaciones de diferentes orígenes. En una primera aproximación, la varianza debida a las partículas difusoras en el volumen de iluminación,20, se puede separar de la varianza debido al ruido de disparo del detector,2d. Las dos varianzas son independientes; por lo tanto, la desviación total se da por su suma:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
La varianza, debido a las fluctuaciones moleculares dentro y fuera del volumen de detección, depende linealmente del brillo molecular y la intensidad:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
Reorganización eq. 6 según eq. 1:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
Según el concepto típico en espectroscopía de correlación de fluorescencia, la ecuación 7 establece que la varianza debida al número de fluctuaciones depende del cuadrado del brillo de las partículas.
Entonces, la varianza debida a las fluctuaciones del detector es una función lineal de la intensidad detectada, bajo el supuesto de que el detector se opera por debajo de su límite de saturación19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
En el caso de los detectores de recuento de fotones a unnúmero 1 y ca 0, por lo tanto, la varianza del detector es igual a la intensidad media:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
Para aplicar estos conceptos a mediciones reales en celdas vivas, Gratton y sus colegas18 definen el brillo aparente, B, para cada píxel como la proporción de la varianza sobre la intensidad media:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B es el parámetro que se mide experimentalmente. En este trabajo, las imágenes de series temporales de receptores FGFR1 en la membrana plasmática de las células HeLa son capturadas por la microscopía TIRF y el brillo aparente promedio, B, está determinado por el análisis N&B. Luego, después de la adición de FGF2, series temporales consecutivas se capturan para seguir los cambios en el autoensamblaje de las moléculas receptoras en la superficie de la membrana después de la estimulación del receptor con el ligando canónico.
Sin embargo, dado que el detector del microscopio TIRF es una cámara EMCCD, la expresión para el brillo aparente debe modificarse como19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
donde el desplazamiento es el desplazamiento de intensidad de la electrónica de detección que es una característica de la configuración del detector. La varianza y la intensidad media de un detector analógico se dan respectivamente por:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
donde G es la ganancia analógica en niveles digitales (DL/fotones), S, los niveles digitales por foton19,se da por la pendiente de una intensidad frente a la varianza de la gráfica para una fuente de luz con intensidad constante (sin fluctuaciones temporales). El factor de la unidad está relacionado con la forma del volumen de detección de píxeles. Según Hassler et al.32, el factor de á es igual a 0,3 para las imágenes TIRF que funcionan con la ganancia máxima de la cámara de detección19. Los parámetros offset, S y G son características de la cámara y del microscopio. El brillo aparente, B, se obtiene reorganizando eq. 11 según eq. 12 y 13:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
Experimentalmente, es una función compleja de la intensidad del láser y la eficiencia de detección del sistema. Sin embargo, puesto que B/S depende linealmente de la variable, sólo es importante determinar el valor relativo de la opción para un modo de detección determinado:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
donde es proporcional a . Aún así, una calibración se realiza utilizando una referencia interna.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum 98% minimun</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>21063029</td>
			<td>Used serum free for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high-glucose GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>Used for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0515-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitting system Photometrics DV2</td>
			<td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td>10% inactivated supplement for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes</td>
			<td>MatTek, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>uncoated, glass thickness 0.17 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells</td>
			<td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CB_08011102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software</td>
			<td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td>
			<td></td>
			<td>This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&#38;B time series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Executable N&#38;B routine</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab v.2018b</td>
			<td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x</td>
			<td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td>
			<td>LONZA 17-602E</td>
			<td>supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100&#181;g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector</td>
			<td>Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td>Zamai et al., 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGF2</td>
			<td>PeproTech EC, Ltd., London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate GIBCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>1mM supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIt-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid 10 mL</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513 859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM2618</td>
			<td>0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis

A pesar de la importancia y la ubicuidad de la oligomerización de receptores, pocos métodos son aplicables para detectar eventos de agrupación en clústeres y medir el grado de agrupación en clústeres. Aquí, describimos un enfoque de imagen para determinar el estado oligomérico promedio de los homocomplejos de receptores etiquetados con mEGFP en la membrana de las células vivas. El protocolo se basa en la microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF) combinada con el análisis Número y Brillo (N&B). N&B es un método similar a la espectroscopia de fluorescencia-correlación (FCS) y el histograma de recuento de fotones (PCH), que se basan en el análisis estadístico de las fluctuaciones de la intensidad de fluorescencia de los fluoróforos que se difunden dentro y fuera de una iluminación volumen durante un tiempo de observación. En particular, N&B es una simplificación de PCH para obtener información sobre el número medio de proteínas en mezclas oligoméricas. Las amplitudes de fluctuación de intensidad se describen por el brillo molecular del fluoróforo y el número medio de fluoróforos dentro del volumen de iluminación. Por lo tanto, N&B considera sólo el primer y segundo momento de la distribución de amplitud, a saber, la intensidad media y la varianza. Esta es, al mismo tiempo, la fuerza y la debilidad del método. Debido a que sólo se consideran dos momentos, N&B no puede determinar la fracción molar de los oligómeros desconocidos en una mezcla, pero sólo estima el estado medio de oligomerización de la mezcla. Sin embargo, se puede aplicar a series temporales relativamente pequeñas (en comparación con otros métodos de momento) de imágenes de células en vivo píxel por píxel, simplemente monitoreando las fluctuaciones de tiempo de la intensidad de la fluorescencia. Reduce el tiempo efectivo por píxel a unos pocos microsegundos, lo que permite la adquisición en el intervalo de tiempo de segundos a milisegundos, lo que es necesario para la cinética de oligomerización rápida. Por último, se pueden explorar grandes áreas celulares, así como compartimentos subcelulares.

Los resultados de dos células representativas de HeLa-mEGFP-FGFR1 sembradas en el mismo plato de cultivo se muestran en la Figura 5 y en la Tabla Suplementaria 1. Las dos celdas fueron capturadas en el tiempo 0 min(Figura 5A, superior) y 7 min(Figura 5A,inferior) después de la adición del ligando FGF2.
<p class="jove_content" fo:keep-together....

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Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Describimos un enfoque de imagen para la determinación del estado oligomérico promedio de los oligómeros receptores etiquetados con mEGFP inducidos por la unión de ligandos en la membrana plasmática de las células vivas. El protocolo se basa en la microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF) combinada con el análisis Número y Brillo (N&B).

Dinámica de oligomerización de receptores de superficie celular en células vivas mediante la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total combinada con análisis de número y brillo

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

La agrupación en clústeres de receptores es omnipresente y a menudo necesaria para la señalización de una activación en cascada. Sin embargo, hay pocos métodos disponibles para medir el grado de agrupación en clústeres. Utilizamos fluorescencia de reflexión interna total, microscopía TIRF, para seguir la difusión de moléculas FGFR1-mEGFP en la membrana plasmática de células vivas.Luego aplicamos el brillo numérico, el análisis N&B, para describir la dinámica de la agrupación en clústeres de receptores estimulado. TIRF es ideal para imágenes temporales rápidas de eventos moleculares que ocurren cerca de la superficie celular, mientras que N&B determina el estado oligomérico promedio de las moléculas fluorescentes en función de dónde se difuercen el volumen de iluminación del microscopio. De hecho, esta es una herramienta para conectar la organización temporal espacial de los receptores en la superficie celular donde están señalando.N&B solo necesita el acceso a un microscopio con un módulo de adquisición rápida. Puede analizar grandes áreas de células vivas con solo el conocimiento básico de los métodos de fluctuación de fluorescencia. Este método se puede aplicar a proteínas que forman dimers o racimos y se puede etiquetar estequiométricamente con el tinte fluorescente.Si las proteínas están en compartimentos intracelulares, se utilizan otros tipos de microscopios para adquirir las imágenes. Es importante preparar una construcción que exprese la forma monomérica del fluoróforo para medir en condiciones experimentales el brillo monomérico puro como control. El primer día, las células heLa de semilla en 1,5 mililitros de medio completo a una concentración de 100.000 a 200 000 células por mililitro en platos de fondo de vidrio.Las semillas de seis a ocho replican los platos, e incuban en una incubadora a 37 grados centígrados. En el segundo o tercer día, las células han alcanzado la subconfluencia. Añadir medio libre de suero con plásmido proteico a la mitad de los platos, y añadir plásmidos de referencia con el monómero y dimer a la segunda mitad de los platos para transfecar las células.Después de un día, compruebe que las células trans infectadas están adherentes a la parte inferior de los platos y la membrana celular es fluorescente. Deseche los platos con células desbordados o con muy baja fluorescencia. Cuatro horas antes del experimento, active la incubadora de temperatura del microscopio a 37 grados centígrados.Encienda el microscopio, las computadoras y las cámaras, y espere a que las cámaras alcancen la temperatura de trabajo adecuada de menos 75 grados centígrados. Coloque una pequeña gota de aceite en la lente objetivo. Poner un plato de muestra en la incubadora del microscopio, y cerrar las puertas de la incubadora para dejar que la temperatura del plato se equilibre durante 10 minutos.Encienda la lámpara de epifluorescencia y el láser de 488 nanómetros. Seleccione el modo de contraste de epifluorescencia para explorar la muestra, buscando una celda para enfocar desde la lente ocular. Seleccione el filtro adecuado para recoger la emisión verde a través de la cámara del microscopio con el paso de banda Ex 490/20 500 y el paso de banda Em 525/50 o similar.Cambie del informe del ocular al informe de la leva en modo de epifluorescencia. Refine el enfoque y cambie al modo TIRF. A continuación, active la alineación automática siguiendo las instrucciones del microscopio TIRF.Elija una profundidad de iluminación adecuada y optimice la dirección del campo evanescente. Cambie a una segunda cámara. Defina una región de interés de al menos 256 por 256 píxeles.Establezca la exposición en un milisegundo y la ganancia EM en 1.000. Ajuste la potencia del láser a 0,5 milivatios. Es necesario tener cierta información sobre el coeficiente de difusión de la proteína porque el tiempo de exposición debe ser menor que el tiempo medio empleado por las moléculas fluorescentes en el volumen lumminado.Ejecute una primera secuencia de prueba en condiciones iniciales y estime aproximadamente el valor de señal a ruido. Las condiciones son aceptables en señal-ruido igual a dos a tres o superior como se mide en la primera serie de tiempo. A continuación, utilice el control deslizante del sistema de división de emisiones que conecta la cámara número dos al microscopio para enmascarar un lado de la imagen.Seleccione la opción de guardado automático del archivo de cámara. Inicie la adquisición de la serie de imágenes para un mínimo de 700 fotogramas con una relación señal-ruido mínima de dos. Sin sacar el plato del microscopio, agregue el ligando.Seleccione una célula con una membrana de fluorescencia brillante e inicie rápidamente la primera serie de la carrera cinética. Busque una segunda celda y adquiera el segundo punto de tiempo de la cinética. Capture una nueva celda para cada punto de tiempo de la carrera cinética.Para cada nuevo plato, repita la alineación de la línea láser y la optimización de la iluminación TIRF. Ahora convierta y guarde los archivos de imagen adquiridos con el software de la cámara como archivos tif. Importe archivos tif en la rutina de software de análisis activando el usuario gráfico N&B interfasa MATLAB.Serie de descartes para las que el perfil de intensidad media muestra más del 10% de fotoblanqueo y series en las que ha habido una evidente distorsión o traducción de la membrana celular durante la adquisición. Recortar marcos que evidentemente están fuera de foco. Conservar para el análisis sólo series con al menos 500 marcos de tiempo.Primero determine los parámetros de la cámara. Active la cámara de calibración de rutina. Seleccione un área de al menos 20 por 50 píxeles en la región de ruido del detector.En la gráfica de frecuencia de registro frente a nivel digital, mueva el cursor rojo lineal para delimitar el gaussiano en la parte lineal de la curva. Active la tecla B. Aplique un binning mínimo de 2.2 para reducir la dispersión de los datos y para generar el histograma B-I.Utilice el cursor cuadrado iterativo para inspeccionar el histograma B-I. Seleccione un ROI cuadrado para el análisis y genere el mapa B del ROI seleccionado. A continuación, guarde el archivo ASCII de los valores B asociados a la selección.Importe el ASCII en un software gráfico para calcular la distribución de frecuencia de los datos y obtener el valor B promedio más o menos S.E.Aplique la ecuación de épsilon para derivar el brillo promedio para cada celda en cada punto de tiempo de la ejecución cinética. Normalice los datos de acuerdo con la ecuación de normalización, donde B't es el valor B promedio medido en el tiempo t después de la adición del ligando y B'0 es el valor B promedio medido en el momento t es igual a cero, que es 10 a 20 segundos después del ligando additino. Trazar el brillo medio normalizado frente al tiempo de adquisición para construir la ejecución cinética.En este estudio, los resultados representativos de dos células HeLa en el mismo plato que expresa mEGFP-FGR1 capturados en el momento cero y siete, después de la adición de 20 nanogramos por mililitro de FGF2, se muestran aquí. En comparación con las construcciones de referencia, GPI-mEGFP y GPI-mEGFP-mEGFP dimer, toda la secuencia de análisis muestra la intensidad media de la serie temporal. Trazado de todos los valores B.Histograma B-I. B-mapa del ROI elegido. Y el histograma de distribución B asociado.Después de la estimulación con 20 nanogramos por mililitro de FGF2, las corridas cinéticas representativas que muestran el brillo promedio como función del tiempo describe el lento proceso de dimerización que persiste durante varios minutos en la superficie celular. Cuando se estimula con 50 microgramos por mililitro de NCAM-Fc, el perfil cinético revela transiciones rápidas y cíclicas del receptor en mezclas oligoméricas, que también alcanza valores de brillo superiores a los del dimer. Se observa repetidamente un valor medio normalizado de tres.Es importante minimizar las variantes adicionales debido a que no hay fluctuaciones moleculares y blanqueo. Y las células deben estar bien adheridas al plato de fondo de vidrio, no cubierto, y no apilados. Si estamos interesados en una proteína que se difunde más rápido dentro de los compartimentos intracelulares, podemos aplicar tiempos cero más rápidos y usar escaneo en microscopios focales o multifoto para la imagen dentro de la célula.Con nuestro enfoque, minimizamos los efectos perjudiciales del fotoblanqueo cuando queremos explorar la dinámica de eventos como la dimerización. Estos eventos controlan una variedad de respuestas celulares y son muy difíciles de probar en células vivas con otras técnicas.

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Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

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Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...