Name: oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

CNIC stöds av ministeriet för Ciencia, Innovacion y Universidades och Pro CNIC Foundation, och är en Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Vi stöds också av Europeiska regionala utvecklingsfonden (FEDER) "Una Manera de hacer Europa". UC erkänner stödet från Associazione Italiana ricerca Sul Cancro, föreningen för internationell cancerforskning (numera känd som global cancer Research), och det italienska hälsoministeriet. At erkänner "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" för att delvis stödja hans arbete med PV Fellowship "Progetto Professionalità Ivano Becchi" 2011-2012.

1. provberedning
<ol><li>Dag 1. Utsäde HeLa celler i komplett medium vid en koncentration av 100000-200000 cell/mL i glas-botten rätter. Utsäde 6-8 replikera rätter. Anmärkning: I detta exempel, mediet kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS), 1 mM natrium pyruvat, 100 U/100 μg penicillin/streptomycin. Flera replikaträtter tillagas.</li>
	<li>Dag 2-3. När celler är på sub-confluency, transfect hälften av rätterna med proteinet plasmid och andra halvan med referen...

<ol>
	<li>Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+insights+into+gonadotropin+hormone+receptor+dimerization+and+oligomerization.">Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization.</a> Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).</li><li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited:+functional+and+pharmacological+perspectives.">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).</li><li>Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+receptor+oligomerization.">Muscarinic receptor oligomerization.</a> Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).</li><li>Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+Receptor+Signaling:+Impact+of+Receptor+Oligomerization+on+Receptor+Function.">Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).</li><li>Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+oligomerization:+functional+considerations.">Chemokine receptor oligomerization: functional considerations.</a> Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).</li><li>Van Craenenbroeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+oligomerization:+contribution+to+receptor+biogenesis.">GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis.</a> Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).</li><li>Wnorowski, A., Jozwiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homo-+and+hetero-oligomerization+of+beta2-adrenergic+receptor+in+receptor+trafficking,+signaling+pathways+and+receptor+pharmacology.">Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology.</a> Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).</li><li>Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+methods+to+study+membrane+receptor+oligomerization.">Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization.</a> Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).</li><li>Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+complementation+assays:+new+tools+to+study+G+protein-coupled+receptor+oligomerization+and+GPCR-mediated+signaling.">Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).</li><li>Trussell, H. J., et al., Trussell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Academic Press Library in Signal Processing. 4, 3-9 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+dendritic+spines+by+STED+microscopy.">Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).</li><li>Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+accurately+locate+and+count+large+numbers+of+steps+by+photobleaching.">A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).</li><li>Godin, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+protein+oligomerization+and+densities+in+situ+using+spatial+intensity+distribution+analysis.">Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).</li><li>Qian, H., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+molecular+aggregation+by+analysis+of+fluctuation+moments.">Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).</li><li>Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photon+counting+histogram+in+fluorescence+fluctuation+spectroscopy.">The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).</li><li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode.">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).</li><li>Unruh, J. R., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+concentration+and+brightness+from+fluorescence+fluctuation+data+with+an+electron+multiplied+CCD+camera.">Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera.</a> Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).</li><li>Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+chemical+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+review.">Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review.</a> Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).</li><li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy.">Fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li><li>Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+FCS,+a+novel+method+for+three-dimensional+particle+tracking.">Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking.</a> Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).</li><li>Hinde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+dynamics+of+the+oligomeric+transcription+factor+STAT3+by+pair+correlation+of+molecular+brightness.">Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness.</a> Nature Communications. 7, 11047 (2016).</li><li>Waithe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+processing+and+analysis+of+conventional+confocal+microscopy+generated+scanning+FCS+data.">Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data.</a> Methods. 140-141, 62-73 (2018).</li><li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope.">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li><li>Ossato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+path+to+inclusion+formation+of+huntingtin+peptides+revealed+by+number+and+brightness+analysis.">A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).</li><li>Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+resting+and+ligand-bound+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases+in+living+cells+using+number+and+brightness+analysis.">Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).</li><li>Ming, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Distribution+of+Klothobeta+(KLB)+and+fibroblast+growth+factor+receptor-1+(FGFR1)+in+living+cells+reveal+the+fibroblast+growth+factor-21+(FGF21)-induced+receptor+complex.">Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).</li><li>Ross, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+state+of+dynamin+2+in+cell+membranes+using+TIRF+and+number+and+brightness+analysis.">Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).</li><li>Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+brightness+image+analysis+reveals+ATF-induced+dimerization+kinetics+of+uPAR+in+the+cell+membrane.">Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane.</a> FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).</li><li>Zamai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+brightness+analysis+reveals+that+NCAM+and+FGF2+elicit+different+assembly+and+dynamics+of+FGFR1+in+live+cells.">Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells.</a> Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).</li><li>Hassler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+correlation+spectroscopy+(TIR-FCS)+with+low+background+and+high+count-rate+per+molecule.">Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule.</a> Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).</li><li>Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fast+fluorescence+imaging+to+molecular+diffusion+law+on+live+cell+membranes+in+a+commercial+microscope.">From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).</li><li>Beenken, A., Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FGF+family:+biology,+pathophysiology+and+therapy.">The FGF family: biology, pathophysiology and therapy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).</li><li>Joubert, J., Sharma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+digital+imaging.">Light microscopy digital imaging.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2011).</li><li>Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIRF+microscopy+evanescent+field+calibration+using+tilted+fluorescent+microtubules.">TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules.</a> Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).</li><li>Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+incidence+angle+for+through-the-objective+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).</li><li>Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+limits+and+data+correction+in+number+of+molecules+and+brightness+analysis.">Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis.</a> Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).</li><li>Caiolfa, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomer-dimer+dynamics+and+distribution+of+GPI-anchored+uPAR+are+determined+by+cell+surface+protein+assemblies.">Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies.</a> Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).</li><li>Campbell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+red+fluorescent+protein.">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).</li><li>Cutrale, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+enhanced+number+and+brightness+to+measure+protein+oligomerization+dynamics+in+live+cells.">Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells.</a> Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).</li><li>Dunsing, V., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence+Fluctuation+Spectroscopy+Assay+of+Protein-Protein+Interactions+at+Cell-Cell+Contacts.">A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li></ol>

N & B kräver flera försiktighetsåtgärder vid valet av cell modell och märknings strategi. Den kan endast tillämpas på levande celler som förblir stabilt under bildfångst tiden. Extra svängningar på grund av hela cellen stel förskjutning kan hanteras med lämpliga bildrestaurering metoder38. Men i allmänhet när en cell rör sig, cellmembranet också deformeras, och struktur deformation, producerar stor extra varians, introducerar allvarlig begränsning till analysen av membranproteine...

Vi beskriver en total intern reflektion fluorescens-antal och ljusstyrka (TIRF-N & B) avbildning metod för att bestämma den genomsnittliga oligomeriska tillstånd av receptor molekyler vid plasmamembranet i levande celler, som syftar till att länka receptorn församlingen dynamiken till proteiners biologiska funktion (figur 1).
Vid extracellulära ligand bindning, receptorer initiera intracellulära signaltransduktion beroende på deras konformation, oligomerisering, potentiella Co-receptorer och membran sammansättning. Trots betydelsen och ubiquity av receptor oligomerization, erkänd som en viktig händelse i cellulära signalering1,2,3,4,5,6, 7, få metoder kan upptäcka klusterhändelser och mäta graden av kluster experimentellt8,9. Den konfokalvolym (x, y ≈ 300 nm, z ≈ 900 nm) är otillräckligt löst för att bevisa molekylär interaktion och stökiometri, även efter optimering av bildrestaurering algoritmer10. Den sub-Unit sammansättningen av protein oligomerer kan inte lösas på en rent rumslig grund även av super-upplösning metoder på x, y upplösning på 20-70 nm som PALM11, Storm12, och sted13. Dessutom kan deras temporala upplösning (i storleksordningen minuter per bild) inte följa kinetik i intervallet sekunder. Single molekyl Step-blekning löser stoichiometri av protein oligomerer endast om de är orörbara14.
En av de mest mångsidiga metoderna för att mäta densitet och oligomerisering av fluorescerande märkta proteiner inom enstaka bilder är den rumsliga intensiteten fördelning analys (SpIDA), som förlitar sig på rumsliga provtagning. Den är tillämplig på både kemiskt fasta och levande celler, och gör det möjligt att analysera flera regioner av intresse i cellen samtidigt med hjälp av standardfluorescens mikroskopi15. Alternativt moment metoder, såsom fluorescens-korrelationsspektroskopi (FCS)16, Photon Counting histogram (PCH)17, och antal och ljusstyrka (N & B)18,19, är lämpliga för kvantitativa Oligomer Mätningar. Dessa metoder analyserar variationer i fluorescensintensiteten som kan observeras i tid när fluoroforerna sprids in och ut ur en belysnings volym. Amplituderna i intensiteten kan beskrivas unikt genom den molekylära ljusstyrkan hos fluorophore (ε) och det genomsnittliga antalet fluoroforer (n) inom belysnings volymen17 (figur 2). Normalt kan diffusions koefficienten för fluoroforer och det genomsnittliga antalet molekyler (omvänt besläktade med G (0)-värdet) inom belysnings volymen erhållas genom FCS20. Men eftersom diffusions tiden bara skalas med kubisk roten av massan, är FCS inte tillräckligt känslig för att upptäcka förändringar i molekylmassa21. I praktiken kan enfärgade FCS inte detektera Dimerization av membran receptorer. PCH löser blandningar av olika oligomerer noggrant. Med mer än två moment av amplitudfördelningen upptäcker den molekyler med olika ljusstyrka som upptar samma belysnings volym. Scanning FCS22 och utveckling, såsom intressant par-korrelation av molekylär ljusstyrka (pcomb) Approach23, infördes för att utvidga räckvidden för tillämpligheten av fluorescenskorrelations metoder i biologiska system24 , förbli Single Point-metoder som saknar förmåga att snabba mätningar i ett stort område av en cell, som kräver många på varandra följande observationer vid varje pixel och datainsamling i storleksordningen sekunder.
N & B är en förenklad version av pch som endast beaktar den första och andra ögonblicken av amplituden för fluorescensfördelningen, nämligen Medelintensiteten, och varians, σ2 (figur 2)18,19 och på grund av detta, kan den inte bestämma molar fraktion av okända oligomerer i en blandning, men bara uppskattar den genomsnittliga oligomerisering tillstånd av blandningen. N & B har dock fördelen av att arbeta med relativt mindre tidsserier av bilder av levande celler än PCH på en pixel-för-pixel-basis, helt enkelt genom att övervaka fluktuationerna i tiden för fluorescensintensiteten. Eftersom N & B minskar tiden per pixel till några mikrosekunder, kan det följa snabbt oligomerisering kinetik över stora cellområden, vilket gör att bild förvärv på en tidsskala av sekunder i raster skanning mikroskopi (t. ex., konfokal, 2-Photon) och millisekunder i kamerabasbaserad mikroskopi (t. ex. TIRFM).
Flera rapporter har visat förmåga N & B att kvantifiera antalet subenheter i protein kluster genom att avbilda utökade cell regioner. Paxillin-EGFP-kluster upptäcktes vid vidhäftnings platserna i CHO-K1-cellerna25, och den intracellulära aggregeringen av patogenen Httex1p peptid BESKREVS i cos-7-celler26. N & B applicerades för att följa den ligand-drivna oligomeriseringen av ErbB-receptorn27, och effekten av LIGAND FGF21 på Klothob (KLB) och FGFR1c i hela cells28. Kombinationen av tirf Imaging och N & B-analys användes för att visa att dynamin-2 i första hand är tetrameriska genom hela cellmembranet29. Vi tillämpade N & B till både raster skanning och tirf bilder för att bevisa ligand-driven Dimerization av uPAR och FGFR1 cellmembran receptorer30,31.
Fluorescenskorrelations metoder, såsom N & B, FCS och PCH, bygger på föreställningen att ockupationen av partiklar i en öppen volym följer en Poissonfördelning. Eftersom endast fotoner som avger fluoroforer kan upptäckas, är medelvärdet för en uppmätt fluorescensintensitet kontra tid i en bildpunkt i bilden <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg"> </img>, produkten av det genomsnittliga antalet fluorofomedel i belysnings volymen, n, och deras Molekylär ljusstyrka, ε17:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg">
där ε uttrycks som det antal fotoner som avges per tidsenhet (konventionellt per sekund) per molekyl när molekylen står i centrum för belysnings volymen.
Ljusstyrka är en egenskap hos varje fluorophore i en given förvärvs uppsättning, medan intensiteten är summan av alla bidrag från alla fluoroforer. I biologiska tävlingar kommer ljusstyrkan att öka med ökningen av antalet fluoroforer som fluktuerar tillsammans, vilket ger information om oligomeriseringstillståndet hos det fluorescerande-märkta proteinet. Fluktuationsamplituderna vid en given pixel mäts från variansen för fluorescenssignalen, σ2:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg">
Om medelvärdet av kvadraten på intensitet, <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg"> </img>och kvadraten på medelvärdet av intensiteten, <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg"> </img>beräknas utifrån de individuella intensitetsvärdena i varje pixel i varje ram:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg">
där K är antalet totala bildrutor i tidsserierna. Experimentellt är det nödvändigt att beräkna för hela bildserien variansen som beskriver scattern för de enskilda intensitetsvärdena vid varje pixel i en enskild bild runt medelintensitetsvärdet. Avvikelsen inkluderar alla variationer av olika ursprung. I en första närhet, variancen som de diffusa partiklarna i belysnings volymen, σ20, kan AVS kil ras från variancen tack vare som avkännaren sköt stojar, σ2d. De två varianserna är oberoende; således ges total avvikelsen av summan:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg">
Variationen, på grund av molekylära variationer in och ut ur detekterings volymen, är linjärt beroende av den molekylära ljusstyrkan och intensiteten:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg">
Omdisponering av EQ. 6 enligt EQ. 1:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg">
Enligt det typiska konceptet i fluorescenskorrelationspektroskopi, anger ekvation 7 att variationen på grund av antalet variationer beror på kvadraten på partikel ljusstyrkan.
Därefter är variansen på grund av detektor svängningar en linjär funktion av den upptäckta intensiteten, under antagandet att detektorn drivs under dess mättnadsgräns19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg">
I fallet av fotonen som räknar avkännare a= 1 och c= 0, således är detektor avvikelsen jämbördig till den genomsnittliga styrkan:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg">
För att tillämpa dessa begrepp på verkliga mätningar i Live-celler, Gratton och kollegor18 definiera skenbar ljusstyrka, B, för varje pixel som förhållandet mellan variansen över den genomsnittliga intensiteten:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg">
B är den parameter som mäts experimentellt. I detta arbete, tidsserie bilder av FGFR1-receptorer vid plasmamembranet av HeLa celler fångas upp av TIRF mikroskopi och den genomsnittliga skenbara ljusstyrkan, B, bestäms av N & B-analys. Sedan, efter tillsats av FGF2, på varandra följande tidsserier fångas för att följa förändringarna i själv-församlingen av receptorn molekyler i membranet ytan efter stimulering av receptorn med den kanoniska ligand.
Men eftersom detektorn i TIRF-mikroskopet är en EMCCD-kamera måste uttrycket för den skenbara ljusstyrkan ändras till19:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg">
där offset är intensitetsförskjutningen av detekterings elektroniken som är kännetecknande för detektor inställningarna. Varians och medelintensitet för en analog detektor ges respektive av:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg">
där G är den analoga förstärkningen i digitala nivåer (DL/fotoner), S, de digitala nivåerna per foton19, ges av lutningen på en intensitet kontra var Ians tomt för en ljuskälla med konstant intensitet (inga temporala fluktuationer). Γ-faktorn är relaterad till pixel detekterings volymens form. Enligt Hassler et al.32, den γ faktorn är lika med 0,3 för tirf Imaging arbetar vid maximal vinst på detekterings kameran19. Offset-, S-och G-parametrarna är kamerans och mikroskopens egenskaper. Den skenbara ljusstyrkan, B, erhålls genom omdisponering av EQ. 11 enligt EQ. 12 och 13:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg">
Experimentellt är ε en komplex funktion av laserintensitet och detekterings effektiviteten i systemet. Eftersom B/S är linjärt beroende av ε är det dock endast viktigt att fastställa det relativa värdet av ε för ett givet detektions läge:
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg">
där ε står i proportion till ε. En kalibrering utförs fortfarande med en intern referens.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum 98% minimun</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>21063029</td>
			<td>Used serum free for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high-glucose GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>Used for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>X0515-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitting system Photometrics DV2</td>
			<td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td>10% inactivated supplement for complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes</td>
			<td>MatTek, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>uncoated, glass thickness 0.17 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells</td>
			<td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CB_08011102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software</td>
			<td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td>
			<td></td>
			<td>This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&#38;B time series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Executable N&#38;B routine</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab v.2018b</td>
			<td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x</td>
			<td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td>
			<td>LONZA 17-602E</td>
			<td>supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100&#181;g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector</td>
			<td>Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td>Zamai et al., 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector</td>
			<td>Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Hellriegel et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGF2</td>
			<td>PeproTech EC, Ltd., London, UK</td>
			<td></td>
			<td>Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate GIBCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>1mM supplement for medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIt-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid 10 mL</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513 859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure BSA (50 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM2618</td>
			<td>0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligomerization dynamics of cell surface receptors in living cells by total internal reflection fluorescence microscopy combined with number and brightness analysis

Trots betydelsen och ubiquity av receptor oligomerization, är få metoder som gäller för att upptäcka klusterhändelser och mäta graden av klustring. Här beskriver vi en avbildning metod för att bestämma den genomsnittliga oligomeriska tillstånd av mEGFP-märkta-receptorn homokomplex i membranet av levande celler. Protokollet är baserat på den totala inre reflektions fluorescens (TIRF) mikroskopi kombinerat med antal och ljusstyrka (N & B) analys. N & B är en metod som liknar fluorescens-korrelationsspektroskopi (FCS) och Photon Counting histogram (PCH), som är baserade på den statistiska analysen av fluktuationerna i fluorescensintensiteten hos fluoroforer som sprider sig in och ut ur en belysnings volym under en observationstid. I synnerhet är N & B en förenkling av PCH för att få information om det genomsnittliga antalet proteiner i oligomeriska blandningar. Intensiteten fluktuation amplituder beskrivs av den molekylära ljusstyrkan hos fluorophore och det genomsnittliga antalet fluorofoder inom belysnings volymen. Således anser N & B endast den första och andra ögonblicken av amplitudfördelningen, nämligen den genomsnittliga intensiteten och variansen. Detta är, på samma gång, styrkan och svagheten i metoden. Eftersom endast två moment anses, N & B kan inte bestämma molar fraktion av okända oligomerer i en blandning, men det bara uppskattar den genomsnittliga oligomerisering tillstånd av blandningen. Det kan dock tillämpas på relativt små tidsserier (jämfört med andra moment metoder) av bilder av levande celler på en pixel-för-pixel-basis, helt enkelt genom att övervaka tids variationer av fluorescensintensiteten. Det minskar den effektiva tiden per pixel till några mikrosekunder, vilket gör att förvärv inom tidsintervallet sekunder till millisekunder, vilket är nödvändigt för snabb oligomerisering kinetik. Slutligen kan stora cellområden och subcellulära fack utforskas.

Resultaten för två representativa HeLa-mEGFP-FGFR1-celler som är seedade i samma odlings fat visas i figur 5 och kompletterande tabell 1. De två cellerna fångades vid tiden 0 min (figur 5a, topp) och 7 min (figur 5a, botten) efter tillsats av FGF2 ligand.
Figur 5</...

Watch this Scientific Journal Video about Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness An

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Vi beskriver en avbildning metod för bestämning av den genomsnittliga oligomeriska tillstånd av mEGFP-märkta-receptor oligomerer induceras av ligand bindning i plasmamembranet av levande celler. Protokollet är baserat på den totala inre reflektions fluorescens (TIRF) mikroskopi kombinerat med antal och ljusstyrka (N & B) analys.

Oligomerisering dynamik cellytan receptorer i levande celler av total inre reflektion fluorescens mikroskopi kombinerat med antal och ljusstyrka analys

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Receptor klustring är allestädes närvarande och ofta nödvändigt för signalering en kaskad aktivering. Få metoder finns dock tillgängliga för att mäta graden av klustring. Vi använder totala inre reflektion fluorescens, TIRF mikroskopi, att följa diffusion av FGFR1-mEGFP molekyler i plasmamembranet av levande celler.Sedan tillämpar vi nummerljusstyrka, N&B-analysen, för att beskriva dynamiken i stimulerad receptorklustering. TIRF är idealiskt för snabb temporal avbildning av molekylära händelser som inträffar nära cellytan, medan N&B bestämmer det genomsnittliga oligomeriska tillståndet hos fluorescerande molekyler baserat på var diffusion in och ut belysningsvolymen i mikroskopet. I själva verket är detta ett verktyg för att ansluta den rumsliga tidsmässiga organisationen av receptorerna vid cellytan där de signalerar.N&B behöver bara tillgång till ett mikroskop med en snabb förvärvsmodul. Du kan analysera stort område av levande celler som har just den grundläggande kunskapen om fluorescens fluktuation metoder. Denna metod kan tillämpas på proteiner som bildar dimerer eller kluster och kan stökiometriskt märkas med fluorescerande färgämne.Om proteinerna finns i intracellulära fack används andra typer av mikroskop för att förvärva bilderna. Det är viktigt att förbereda en konstruktion som uttrycker den monomeriska formen av fluorofore för mätning under experimentella förhållanden den rena monomeriska ljusstyrkan som en kontroll. Den första dagen, utsäde HeLa celler i 1,5 milliliter komplett medium vid en koncentration av 100, 000 till 200, 000 celler per milliliter i glas-botten rätter.Frö sex till åtta replikera rätter, och inkubera i en inkubator vid 37 grader Celsius. På andra eller tredje dagen har celler nått subkonfluens. Tillsätt serumfritt medium med proteinplasmid till hälften av disken, och tillsätt referensplasmider med monomeren och dimer till den andra halvan av disken för att transfekta cellerna.Efter en dag, kontrollera att de transfekterade cellerna är vidhäftande till diskens botten och cellmembranet är fluorescerande. Kassera rätter med övervuxna celler eller med mycket låg fluorescens. Fyra timmar före experimentet, aktivera temperaturinkubatorn av mikroskopet vid 37 grader Celsius.Slå på mikroskopet, datorer och kameror, och vänta på att kamerorna når rätt arbetstemperatur på minus 75 grader Celsius. Placera en liten droppe olja på objektivet linsen. Sätt ett provfat i inkubatorn av mikroskopet, och stäng dörrarna till inkubatorn för att låta temperaturen i skålen jämvikt i 10 minuter.Sätt på epifluorescenslampan och 488-nanometerlasern. Välj epifluorescenskontrastläget för att utforska provet, söka en cell för att fokusera från okulär linsen. Välj rätt filter för insamling av den gröna emissionen genom mikroskopkameran med bandpass Ex 490/20 500 och bandpass Em 525/50 eller liknande.Växla från okulär till cam rapporten i epifluorescens läge. Förfina fokus, och ändra till TIRF-läge. Aktivera sedan auto-inriktningen efter instruktionerna från TIRF-mikroskopet.Välj ett lämpligt belysningsdjup, och optimera riktningen på det evanescent fältet. Byt till en andra kamera. Definiera en intresseregion på minst 256 gånger 256 pixlar.Ställ in exponeringen på en millisekkunder och EM-förstärkningen till 1, 000. Justera lasereffekten till 0,5 milliwatt. Det är nödvändigt att ha viss information om proteinets diffusionskoefficient eftersom exponeringstiden måste vara kortare än den genomsnittliga tid som de fluorescerande molekylerna i den självlysande volymen spenderar.Kör en första testsekvens under inledande förhållanden, och uppskatta ungefär signal-till-brus-värdet. Förhållandena är godtagbara vid signal-till-brus lika med två till tre eller högre mätt i första gången serien. Använd sedan skjutreglaget för utsläppsdelningssystemet som förbinder kamera nummer två till mikroskopet för att maskera en sida av bilden.Välj alternativet för automatiska sparalternativ för kamerafilen. Starta förvärvet av bildserien för minst 700 bildrutor vid ett lägsta signal-brusförhållande på två. Utan att ta skålen ur mikroskopet, tillsätt liganden.Välj en cell med ett ljust fluorescensmembran, och starta snabbt den första tidsserien av den kinetiska körningen. Sök en andra cell, och förvärva andra gången i kinetiken. Fånga en ny cell för varje tidspunkt på den kinetiska körningen.För varje ny maträtt, upprepa inriktningen av laserlinjen och optimering av TIRF belysning. Nu konvertera och spara bilden filer som förvärvats med kamerans programvara som tif-filer. Importera tif-filer i analysprogram rutin genom att aktivera N & B grafiska användaren interphase MATLAB.Kassera serier för vilka den genomsnittliga intensitetsprofilen visar mer än 10 %fotobleaching och serier där det har funnits en uppenbar cellmembrandistorsion eller översättning under förvärvet. Beskära ramar som uppenbarligen är ur fokus. Håll för analysen endast serier med minst 500 tidsramar.Först bestämma kameran parametrar. Aktivera den rutinmässiga kalibrera kameran. Välj ett område på minst 20 gånger 50 pixlar i detektorbrusregionen.I loggfrekvensen kontra digital nivå plot, flytta linjär röd markören att avgränsa Gaussian i den linjära delen av kurvan. Aktivera B-tangenten. Tillämpa en minsta binning på 2,2 för att minska spridningen av data och för att generera B-I histogrammet.Använd den iterativa fyrkantiga markören för att inspektera B-I-histogrammet. Välj en kvadratisk ROI för analysen, och generera B-kartan över den valda avkastningen på investeringen. Spara sedan ASCII-filen för de B-värden som är associerade till markeringen.Importera ASCII i en grafikprogramvara för att beräkna datas frekvensfördelning och få fram det genomsnittliga B-värdet plus eller minus S.E.Apply epsilonekvationen för att härleda den genomsnittliga ljusstyrkan för varje cell vid varje tidpunkt på den kinetiska körningen. Normalisera data enligt normaliseringsekvationen, där B't är det genomsnittliga B-värdet mätt vid tiden t efter ligand addition och B'0 är det genomsnittliga B-värde som mättes vid tidpunkten t motsvarar noll, vilket är 10 till 20 sekunder efter ligand additino. Rita den normaliserade genomsnittliga ljusstyrkan kontra förvärvstiden för att bygga den kinetiska körningen.I denna studie, representativa resultat från två HeLa celler i samma maträtt uttrycker mEGFP-FGR1 fångas vid tiden noll och sju, efter tillägg av 20 nanogram per milliliter av FGF2, visas här. Jämfört med referenskonstruktionerna, GPI-mEGFP och GPI-mEGFP-dimer visar hela analyssekvensen tidsseriens genomsnittliga intensitet. Tomt på alla B-värden.B-I histogram. B-karta över den valda ROI. Och tillhörande B-distributionshistogram.Efter stimulering med 20 nanogram per milliliter av FGF2, representativa kinetiska körningar som visar den genomsnittliga ljusstyrkan som funktion av tid beskriver den långsamma processen för dimerisering som kvarstår i flera minuter vid cellytan. När den stimuleras med 50 mikrogram per milliliter av NCAM-Fc, avslöjar den kinetiska profilen snabba och cykliska övergångar av receptorn i oligomeriska blandningar, som också når ljusstyrkevärden över den hos dimer. Ett normaliserat genomsnittsvärde på tre observeras upprepade gånger.Det är viktigt att minimera de extra varianterna på grund av inga molekylära fluktuationer och blekning. Och celler måste väl vidhäftas till glas-botten skålen, inte övervuxen, och inte staplas upp. Om vi är intresserade av ett protein som sprider snabbare inuti intracellulära fack, kan vi tillämpa snabbare noll gånger och använda skanning på fokala eller multifoto mikroskop till bild inne i cellen.Med vår strategi minimerar vi de skadliga effekterna av fotoblekning när vi vill utforska dynamiken i händelser som dimerisering. Dessa händelser styr en mängd olika cellulära svar och är mycket svårt att bevisa i levande celler med andra tekniker.

Research

JoVE Journal

Biology

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell elektrosvetsade visualiseras med fluorescensmikroskopi

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitativa levande celler fluorescens-mikroskopi Analys av fissionsjäst

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorescens Imaging med One-nanometer Noggrannhet (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analys av Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Med hjälp Svält Pads i kombination med fluorescensmikroskopi

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Realtid avbildning av växtcellytan Dynamisk med variabel vinkel epifluorescensmikroskopi

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Ljus Sheet fluorescensmikroskopi av växtrötter som växer på ytan av en gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersökning av mitotiska och Meiotic fission jäst nukleär dynamik genom fluorescens Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...