Name: lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث العلمية الاساسيه (2016R1D1A1B03934418) وبرنامج تطوير التكنولوجيا الطبية & البيولوجية (2018M3A9H1023141) من الحكومة الكورية الجنوبية ، والتي تمول من قبل وزاره الدولة ، MSIT.

1. الطرد المركزي microfluidic القائم علي كروي (CMS) ثقافة تصنيع رقاقه
<ol><li>جعل قوالب الكمبيوتر للطبقات العلوية والسفلية من رقاقه ثقافة CMS عن طريق التصنيع باستخدام الحاسب الألى. وترد الابعاد التفصيلية للشريحة في الشكل 1.</li>
	<li>مزيج PDMS قاعده وعامل معالجه PDMS بنسبه 10:1 (ث/ث) لمده 5 دقائق و?...

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+Advantages+and+applications.">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array.">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li><li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroids+in+Cancer+Research.">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li><li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies.">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li><li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering.">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance.">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li><li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential.">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).</li><li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin.">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li><li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics.">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li><li>Park, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood.">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity.">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li><li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications.">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li><li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform.">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li><li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts.">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li><li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation.">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li></ol>

و CMS هو نظام مغلقه فيها جميع الخلايا المحقونة دخول microwell دون النفايات ، مما يجعلها أكثر كفاءه واقتصادا من الأساليب التقليدية الكروية الجيل الصغرى. في نظام CMS ، يتم استبدال وسائل الاعلام كل 12-24 ساعة من خلال ثقب شفط مصممه لأزاله وسائل الاعلام في رقاقه (الشكل 3A). خلال عمليه شفط و?...

فمن الأسهل لمحاكاة البيولوجية في البيئات المجهرية المجرية مع ثلاثي الابعاد (3D) ثقافة الخلية كروي من مع ثقافة الخلية ثنائي الابعاد (2D) (علي سبيل المثال ، التقليدية الثقافة الخلية طبق بيتري) لإنتاج التجريبية أكثر واقعيه من الناحية الفسيولوجية النتائج1. وتشمل الأساليب المتاحة حاليا كروي تشكيل الشنق تقنيه قطره2، تقنيه تراكب السائل3، تقنيه الكربوكسيل ميثيل السليلوز4، المغناطيسية المستندة إلى القوه ميكروفلويديك تقنيه5، واستخدام المفاعلات الحيوية6. علي الرغم من ان كل أسلوب له فوائده الخاصة ، والمزيد من التحسن في استنساخ ، والانتاجيه ، وتوليد خزان الزراعة ضروري. علي سبيل المثال ، في حين ان تقنيه ميكروفلويديك المستندة إلى القوه المغناطيسية5 غير مكلفه نسبيا ، يجب النظر بعناية في اثار المجالات المغناطيسية القوية علي الخلايا الحية. وقد تم الإبلاغ عن فوائد الثقافة الكروية ، ولا سيما في دراسة تمايز الخلايا الجذعية وانتشارها في العديد من الدراسات7و8و9.
نظام ميكروفلويديك الطرد المركزي ، والمعروف أيضا باسم مختبر علي a-CD (القرص المضغوط) ، مفيد للسيطرة بسهوله داخل السائل واستغلال دوران الركيزة ، التالي تم استخدامها في التطبيقات الطبية الحيوية مثل الاختبارات المناعية10، الاختبارات اللونية للكشف عن علامات البيوكيميائية11، تضخيم الحمض النووي (PCR) المقايسات ، ونظم تحليل الدم الألى12، والكل في واحد الطرد المركزي الاجهزه ميكروفلويديك13. القوه الدافعة للسيطرة علي السائل هي قوه الجاذبية التي تم إنشاؤها بواسطة التناوب. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن القيام بوظائف متعددة للخلط ، والاختلاط ، وتقسيم العينات ببساطه في هذا النظام الأساسي لقرص مضغوط واحد. ومع ذلك ، بالمقارنة مع أساليب التحليل البيوكيميائية المذكورة أعلاه ، كان هناك عدد اقل من التجارب التي تطبق منصات القرص المضغوط علي خلايا الثقافة ، وخاصه خزان14.
في هذه الدراسة ، ونحن نظهر أداء نظام الطرد المركزي القائم علي microfluidic كروي (CMS) من الزراعة الاحاديه أو زراعه الخلايا الجذعية المستمدة من الدهون البشرية (hASC) والورم الليفي الرئوي البشري (مومباسا-5). تصف هذه الورقة بالتفصيل المنهجية البحثية لمجموعتنا15. التالي ، فان الثقافة الكروية علي منصة مختبر علي a-CD يمكن بسهوله استنساخها. ويعرض نظام لتوليد CMS يضم رقاقه ثقافة CMS ، حامل رقاقه ، محرك DC ، جبل المحرك ، ومنصة الدورية. المحرك جبل 3D المطبوعة مع اكريلونيتريل البيوتادين (ABS). حامل رقاقه ومنصة الدورية هي CNC (الكمبيوتر التحكم العددي) تشكيله مع جهاز الكمبيوتر (البولي). يتم التحكم في سرعه دوران المحرك من 200 إلى 4,500 لفه في الدقيقة عن طريق ترميز خوارزميه PID (التناسبية المتكاملة) استنادا إلى تعديل عرض النبض. ابعادها هي 100 مم × 100 مم × 150 ملم ويزن 860 غرام ، مما يجعل من السهل التعامل معها. باستخدام نظام CMS ، يمكن ان تتولد خزان تحت ظروف الجاذبية المختلفة من 1 × ز إلى 521 x ز، التالي فان دراسة تعزيز التمايز الخلية تحت الجاذبية العالية يمكن تمديدها من الخلايا 2d16،17 إلى 3d كروي. الزراعة من أنواع مختلفه من الخلايا هو أيضا التكنولوجيا الرئيسية لمحاكاة بشكل فعال في بيئة الجسم الحيوي18. نظام CMS يمكن بسهوله توليد خزان الزراعة الاحاديه ، فضلا عن خزان الزراعة من أنواع مختلفه من الهيكل (علي سبيل المثال ، المتمركزة ، يانوس ، وساندويتش). ويمكن استخدام نظام CMS ليس فقط في دراسات كروي بسيطه ولكن أيضا في دراسات organoid 3D ، للنظر في هياكل الجهاز البشري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1056px;" width="1056">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">3D printer</td>
			<td style="width:171px;">Cubicon</td>
			<td style="width:124px;">3DP-210F</td>
			<td style="width:416px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15240-062</td>
			<td>Contained 1% of completed medium and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Green CMFDA</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C2925</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C34552</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Computer numerical control (CNC) rotary engraver</td>
			<td style="width:171px;">Roland DGA</td>
			<td style="width:124px;">EGX-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DC motor</td>
			<td style="width:171px;">Nurielectricity Inc.</td>
			<td style="width:124px;">MB-4385E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s modified eaggle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2020</td>
			<td>Contained 10% of completed medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">human lung fibroblasts (MRC-5)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Inventor 2019</td>
			<td style="width:171px;">Autodesk</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td>3D computer-aided design program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Petri dish &#934; 150 mm</td>
			<td style="width:171px;">JetBiofill</td>
			<td style="width:124px;">CAD010150</td>
			<td>Surface Treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:171px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:124px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">11/6/9003</td>
			<td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polycarbonate (PC)</td>
			<td style="width:171px;">Acrylmall</td>
			<td style="width:124px;">AC15PC</td>
			<td>200 x 200 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:171px;">Dowcorning</td>
			<td style="width:124px;">Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids

ثقافة خليه كروي ثلاثية الابعاد يمكن الحصول علي نتائج أكثر فائده في تجارب الخلايا لأنها يمكن ان تحاكي أفضل البيئات المجهرية الخلية من الجسم الحي من ثقافة الخلية ثنائيه الابعاد. في هذه الدراسة ، ونحن ملفقه الكهربائية يحركها المحرك مختبر علي a-CD (القرص المضغوط) منصة ، ودعا الطرد المركزي القائم علي كروي (CMS) نظام الثقافة ، لخلق ثلاثي الابعاد (3D) خليه خزان تنفيذ قوه الطرد المركزي عاليه. هذا الجهاز يمكن ان تختلف سرعات الدوران لتوليد ظروف الجاذبية من 1 × g إلى 521 x g. نظام CMS هو 6 سم في القطر ، لديه 500 μm ميكروويلس ، ويرصد من قبل صب مع polydimethylsiloxane في قالب البولي التي premade جهاز الكمبيوتر الرقمية التحكم. جدار حاجز عند مدخل القناة لنظام CMS يستخدم قوه الطرد المركزي لنشر الخلايا بالتساوي داخل رقاقه. في نهاية القناة ، توجد منطقه منزلقه تسمح للخلايا بدخول الميكروويلس. وكمظاهره ، تولدت خزان بالزراعة الاحاديه وزراعه الخلايا الجذعية المستمدة من الدهون البشرية والورم الليفي بالرئة البشرية تحت ظروف الجاذبية العالية باستخدام النظام. استخدم نظام CMS عمليه بسيطه لإنتاج خزان الزراعة من مختلف الهياكل المتمركزة ، يانوس ، وساندويتش. سيكون نظام CMS مفيدا في البيولوجيا الخلوية ودراسات هندسه الانسجه التي تتطلب خزان والثقافة العضوية لأنواع الخلايا المفردة أو المتعددة.

تمت بنجاح الشريحة الثقافة CMS قطرها 6 سم (الشكل 2) بعد البروتوكول المذكور أعلاه. أولا ، تم صنع الرقاقة بشكل منفصل عن طبقه علويه وطبقه سفليه ومن ثم المستعبدين معا عن طريق الترابط البلازما. الخزان الناتجة يمكن جمعها بسهوله عن طريق فصل الرقاقة. وتتالف قناه الشريحة الثقافية CMS من م...

Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

نقدم جهاز ميكروفلويديك الطرد المركزي التي تعمل بالمحركات التي يمكن ان تزرع الخلايا خزان. باستخدام هذا الجهاز ، يمكن لخزان من أنواع الخلايا المفردة أو المتعددة ان تكون بسهوله الخياطة تحت ظروف الجاذبية العالية.

منصة مختبر علي القرص المضغوط لتوليد خزان ثلاثي الابعاد متعدد الخلايا

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

يمكن استخدام هذه التقنية لتوليد الخلايا من الخلايا الفردية وأنواع متعددة من الخلايا باستخدام نظام أساسي مختبر على قرص مضغوط ، وهو نظام رائد للجيل السريع من الزفيرويدات. تستخدم هذه التقنية قوة الطرد المركزي لإيداع الخلايا في الwell الدقيقة المعينة ، مما يسمح بالغبطة المتتالية لأنواع الخلايا المتعددة لإنتاج الcroheroids المتنوعة. لCMS الثقافة رقاقة التصنيع ، أولا جعل قوالب البولي لطبقات أعلى وأسفل من رقاقة الثقافة عن طريق الكمبيوتر التحكم العددي الآلات.المقبل مزيج قاعدة PDMS وعامل علاج PDMS بنسبة 10 إلى واحد لمدة خمس دقائق قبل وضع الخليط في مجفف لمدة ساعة واحدة لإزالة فقاعات الهواء. صب خليط دياوسد بي إم اس في قوالب رقاقة ثقافة CMS، ووضع القوالب في مجفف لمدة ساعة واحدة أكثر لإزالة أي فقاعات الهواء. في نهاية إزالة الغاز الثاني ، علاج الخليط في غرفة الحرارة في 80 درجة مئوية لمدة ساعتين قبل وضع رقائق في مكنسة البلازما المكنسى مع الأسطح التي يتعين المستعبدين التي تواجه ما يصل.يعرض رقائق الثقافة إلى البلازما بمساعدة الهواء بقوة 18 واط لمدة 30 ثانية ، وسندات طبقتين من الرقاقة في غرفة الحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لزيادة قوة التصاق. ثم تعقيم شريحة ثقافة CMS في الأوتوكلاف عند درجة 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لتحضير الخلايا لتشكيل الزفير، اذيب قارورة من ملليلتر تحتوي على خمس إلى 10 مرات 10 إلى الخلايا الخمس ذات الأهمية في حمام مائي 36.5 درجة مئوية لمدة دقيقتين قبل إضافة ملليلتر واحد من DMEM إلى الخلايا مع خلط لطيف.بعد ذلك إضافة الخلايا إلى طبق بيتري قطره 150 ملليمترًا يحتوي على 15 ملليلترًا من متوسط 36.5 درجة مئوية ، ووضع الطبق في حاضنة لثقافة الخلية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استبدل المابير بـ 15 ملليلتر من DMEM الطازجة، ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة. لفصل الخلايا، وخلق ثقافة مع أربعة ملليلتر من التربسين لمدة أربع دقائق في 36.5 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، ووقف التفاعل مع المتوسطة الطازجة عندما رفعت الخلايا من الجزء السفلي من الطبق.لتسمية الخلايا، تسخين صبغة فلورية الخلايا المناسبة لدرجة حرارة الغرفة قبل إضافة 20 ميكرولترات من أكسيد ثنائي الفينيل اللاهيدروين إلى القارورة للحصول على محلول ملليمتر واحد. تخفيف الفلور إلى تركيز العمل النهائي من مجهر واحد في DMEM، وإضافة صبغة إلى تعليق الخلية من الفائدة مع خلط لطيف. ثم ضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 20 دقيقة.لتكوين أحادية الزراعة spheroid، أولا إضافة 2.5 ملليلتر من 4٪ بلورونيك F-127 حل لثقب مدخل شريحة ثقافة CMS أثناء تدوير الشريحة في 500 إلى 1، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة. عندما تم إضافة كل من الحل، تدوير رقاقة في 4، 000 دوران في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق باستخدام نظام CMS. في نهاية التناوب، احتضان رقاقة الثقافة بين عشية وضحاها في 36.5 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في صباح اليوم التالي، وإزالة حل Pluronic، وغسل رقاقة الثقافة مع DMEM. بعد تجفيف الشريحة لمدة 12 ساعة على مقعد نظيف، أضف 2.5 ملليلتر من المتوسط إلى منفذ المدخل، وتناوب الشريحة على 4000 دوران في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. في نهاية التناوب، استبدال 100 ميكرولترات من المتوسطة في منفذ مدخل مع 100 ميكرولترات من تعليق الخلية المعدة في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة.ثم تدوير رقاقة في 3،000 التناوب في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق لاعتراض الخلايا في كل microwell بالقوة الطرد المركزي قبل وضع رقاقة في خلية الحاضنة ثقافة لمدة ثلاثة أيام، منعش المتوسطة كما هو موضح كل يوم. لتوليد coheroid coheroid متحدة المركز، إضافة السكان الأولى من الخلايا في 100 ميكرولتردات المتوسطة إلى منفذ مدخل من رقاقة في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1، 000 التناوب في الدقيقة تليها ثلاث دقائق من التناوب في 3، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة. في نهاية التناوب، إضافة 100 ميكرولترات من السكان الخلية الثانية في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة، وتدوير رقاقة في 3، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة لمدة ثلاث دقائق أخرى.عندما تم حقن كل من وحدات التخزين من الخلايا، ضع الرقاقة في حاضنة ثقافة الخلية في 1، 000 إلى 2، 000 تناوب في الدقيقة لمدة 24 ساعة. لتشكيل يانوس spheroid، إضافة 100 ميكرولترات من السكان الأولى من الخلايا في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1،000 التناوب في الدقيقة تليها ثلاث دقائق في 3،000 التناوب في الدقيقة الواحدة. في نهاية التناوب، ضع الرقاقة في حاضنة ثقافة الخلية للتناوب عند 1000 إلى 2000 دوران في الدقيقة لمدة ثلاث ساعات.في نهاية الحضانة، إضافة 100 ميكرولترات من السكان الثاني من الخلايا في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1، 000 التناوب في الدقيقة قبل تدوير رقاقة في 3، 000 التناوب في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. ثم ضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية في 1، 000 إلى 2، 000 دوران في الدقيقة لمدة 24 ساعة. لتشكيل spheroid شطيرة، أولا إضافة 100 ميكرولترات من السكان الخلية الأولى في حين أن رقاقة هو الدورية في 500 إلى 1، 000 التناوب في الدقيقة تليها ثلاث دقائق من التناوب في 3، 000 التناوب في الدقيقة الواحدة.في نهاية التناوب، ضع الرقاقة على دوار في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعتين في 1،000 إلى 2،000 التناوب في الدقيقة الواحدة قبل إضافة 100 ميكرولترات من السكان الثاني من الخلايا في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1،000 التناوب في الدقيقة الواحدة. قم بتدوير الشريحة في 3000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق، ثم ضع الرقاقة مرة أخرى في الحاضنة لمدة ثلاث ساعات مع التناوب. ثم إضافة 100 ميكرولترات إضافية من السكان الخلية الأولى في حين أن رقاقة تدور في 500 إلى 1،000 التناوب في الدقيقة الواحدة، وتدوير والثقافة الخلايا كما أظهرت فقط لمدة 12 ساعة.بعد البروتوكول كما هو موضح، يمكن أن تكون رقاقة ثقافة CMS قطرها ستة سنتيمترات ملفقة بنجاح. قناة شريحة ثقافة CMS تضم منفذ مدخل، والمناطق المركزية، والشرائح، وmicrowell. صور الفاصل الزمني من نوعين من ثقافة الخلية التي اتخذت في 2، 000 التناوب في الدقيقة الأولى 24 ساعة من الثقافة داخل شرائح CMS الفردية، كما هو مبين، تظهر التكوين الناجح للpheroids.التصوير من microwells بعد ثلاثة أيام من الثقافة تبين أن الزفيرويدات تظهر التوحيد ممتازة والزخرة. يمكن أيضاً إنشاء الـ"ثرثرة" مع بنيات الخنتريك و Janus وساندويتش. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الثقافات الخلية المعرضة لجاذبية عالية لمدة سبعة أيام، تليها تلطيخ حية / ميتة، تثبت أن معظم الخلايا البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل الثقافة داخل رقائق.يجب أن تكون الطبقات العليا والسفلى من شريحة ثقافة CMS محاذية بعناية عندما تكون مستعبدة ، وإلا فإن عدد الخلايا في كل ميكروويل قد لا يكون متساويا. يمكن لهذه الدراسة أن تخفض حاجز الدخول لأبحاث الاستزراع النخاعي ويمكن استخدامها على نطاق واسع في دراسات الاستزراع المشترك ، على سبيل المثال ، لفحص الأدوية الجديدة ذات الاهتمام.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

ألجينات الهلاميات المائية للثقافة الجهاز ثلاثي الأبعاد من المبيضين وناقلة البيضات

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

مستو وثلاثي الابعاد من أحبار الطباعة موصل

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

الغضروف الإنسان الأنسجة التصنيع باستخدام ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا الطباعة النافثة للحبر

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

تطوير عضوي نموذج متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد من الأمعاء الغشاء المخاطي الإنسان نمت في ظل الجاذبية

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

تصنيع مقلوب الغروية كريستال بولي (جلايكول الإثيلين) سقالة: وثلاثي الأبعاد منصة الثقافة خلية للهندسة الأنسجة الكبد

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

تصنيع أجهزة ميكروفلويديك ثلاثي الأبعاد على الورق ليمونواسايس

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...