Name: lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af den grundlæggende videnskab forskning program (2016R1D1A1B03934418) og bio & medicinsk teknologiudvikling program (2018M3A9H1023141) af NRF, og finansieret af den koreanske regering, MSIT.

1. centrifugal microfluidic-baseret sfæroide (CMS) kultur chip fabrikation
<ol><li>Lav PC forme til de øverste og nederste lag af CMS kultur chip ved CNC bearbejdning. De detaljerede dimensioner af chippen er angivet i figur 1.</li>
	<li>Bland PDMS base og PDMS Hærdningsmiddel i et forhold på 10:1 (w/w) i 5 min og Placer i en ekssikkator i 1 time for at fjerne luftbobler.</li>
	<li>Efter hælde PDMS blandingen i forme af CMS kultur chip, fjerne luftbobler for 1 h mere og helbrede i et ...

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+Advantages+and+applications.">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array.">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li><li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroids+in+Cancer+Research.">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li><li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies.">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li><li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering.">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance.">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li><li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential.">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).</li><li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin.">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li><li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics.">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li><li>Park, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood.">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity.">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li><li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications.">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li><li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform.">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li><li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts.">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li><li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation.">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li></ol>

CMS er et lukket system, hvor alle injicerede celler ind i mikrobrønden uden affald, hvilket gør det mere effektivt og økonomisk end konventionelle strips med mikrobrønde-baserede sfæroide generation metoder. I CMS-systemet udskiftes medierne hver 12 – 24 timer gennem et sugehul, der er designet til at fjerne mediet i chippen (figur 3a). Under medierne suge proces, næppe nogen medier undslipper inde i mikrobrønden på grund af overfladen spændinger mellem medierne og væggen af str...

Det er lettere at simulere biologiske in vivo-mikromiljøer med tredimensionel (3D) sfærisk cellekultur end med todimensionel (2D) cellekultur (f. eks. konventionel Petri skål cellekultur) for at producere mere fysiologisk realistiske eksperimentelle resultater1. I øjeblikket tilgængelige sfæroide formation metoder omfatter hængende dråbe teknik2, væske-overlay teknik3, natriumcarboxymethylcellulose cellulose teknik4, magnetisk kraft-baseret mikrofluidisk teknik5, og brugen af bioreaktorer6. Selv om hver metode har sine egne fordele, yderligere forbedring i reproducerbarhed, produktivitet, og generere coculture sfæroider er nødvendig. For eksempel, mens den magnetiske kraft-baserede mikrofluidisk teknik5 er relativt billig, skal virkningerne af stærke magnetiske felter på levende celler nøje overvejes. Fordelene ved sfæriske kultur, især i studiet af mesenchymal stamcelle differentiering og spredning, er blevet rapporteret i flere undersøgelser7,8,9.
Den centrifugal mikrofluidic system, også kendt som Lab-on-a-CD (Compact Disc), er nyttig til let at styre væsken inde og udnytte rotation af substratet og er således blevet udnyttet i biomedicinske applikationer såsom immunassays10, kolorimetriske assays til påvisning af biokemiske markører11, nukleinsyre amplifikation (PCR) assays, automatiserede blod analysesystemer12, og alt-i-en centrifugal mikrofluidic enheder13. Den drivende kraft, der styrer væsken er den centripetale kraft skabt af rotation. Derudover kan flere funktioner i blanding, valving og prøve opdeling gøres simpelthen i denne enkelt CD-platform. Men i forhold til ovennævnte biokemiske analysemetoder, har der været færre forsøg med at anvende CD-platforme til kultur celler, især sfæroider14.
I denne undersøgelse viser vi ydeevnen af det centrifugal mikrofluidic-baserede sfæroide (CMS) system ved monokultur eller coculture af humane Adipose afledte stamceller (HASC) og humane lunge fibroblaster (MRC-5). Dette dokument beskriver i detaljer vores gruppes Forskningsmetode15. Således kan sfæroide Culture Lab-on-a-CD-platformen let gengives. Et CMS-produktionssystem bestående af en CMS-kultur chip, en chip holder, en jævnstrømsmotor, en motormontering og en roterende platform præsenteres. Motor holderen er 3D-printet med acrylonitrilbutadien styren (ABS). Chip holderen og den roterende platform er CNC (computer numerisk styring) bearbejdet med pc'en (polycarbonat). Motorens rotationshastighed styres fra 200 til 4.500 rpm ved at indkode en PID (proportional-Integral-afledt) algoritme baseret på puls-bredde modulation. Dens dimensioner er 100 mm x 100 mm x 150 mm og den vejer 860 g, hvilket gør den nem at håndtere. Ved hjælp af CMS-systemet, kan sfæroider genereres under forskellige tyngdekraften betingelser fra 1 x g til 521 x g, så studiet af Celledifferentiering fremme under høj tyngdekraft kan forlænges fra 2D-celler16,17 til 3D sfæroide. Coculture af forskellige typer af celler er også en vigtig teknologi til effektivt at efterligne in vivo miljø18. CMS-systemet kan nemt generere monokultur sfæroider, samt coculture sfæroider af forskellige struktur typer (f. eks koncentrisk, Janus, og sandwich). CMS-systemet kan udnyttes ikke kun i simple sfæroide undersøgelser, men også i 3D organoid undersøgelser, at overveje menneskelige organ strukturer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1056px;" width="1056">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">3D printer</td>
			<td style="width:171px;">Cubicon</td>
			<td style="width:124px;">3DP-210F</td>
			<td style="width:416px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15240-062</td>
			<td>Contained 1% of completed medium and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Green CMFDA</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C2925</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C34552</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Computer numerical control (CNC) rotary engraver</td>
			<td style="width:171px;">Roland DGA</td>
			<td style="width:124px;">EGX-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DC motor</td>
			<td style="width:171px;">Nurielectricity Inc.</td>
			<td style="width:124px;">MB-4385E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s modified eaggle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2020</td>
			<td>Contained 10% of completed medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">human lung fibroblasts (MRC-5)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Inventor 2019</td>
			<td style="width:171px;">Autodesk</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td>3D computer-aided design program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Petri dish &#934; 150 mm</td>
			<td style="width:171px;">JetBiofill</td>
			<td style="width:124px;">CAD010150</td>
			<td>Surface Treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:171px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:124px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">11/6/9003</td>
			<td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polycarbonate (PC)</td>
			<td style="width:171px;">Acrylmall</td>
			<td style="width:124px;">AC15PC</td>
			<td>200 x 200 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:171px;">Dowcorning</td>
			<td style="width:124px;">Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids

En tredimensionel sfærisk cellekultur kan opnå mere brugbare resultater i celle eksperimenter, fordi det bedre kan simulere celle mikromiljøer i den levende krop end to-dimensionelle cellekultur. I denne undersøgelse, vi fabrikerede en elektrisk motordrevet Lab-on-a-CD (Compact Disc) platform, kaldet en centrifugal microfluidic-baseret sfæroide (CMS) kultur system, at skabe tredimensionelle (3D) celle sfæroider gennemføre høj centrifugalkraft. Denne enhed kan variere rotationshastigheder til at generere tyngdekraften betingelser fra 1 x g til 521 x g. CMS-systemet er 6 cm i diameter, har 500 μm mikrobrønde, og er lavet ved støbning med Polydimethylsiloxan i en polycarbonat skimmel premade af en computer numerisk kontrol maskine. En barriere væg ved kanal indgangen til CMS-systemet bruger centrifugalkraft til at sprede cellerne jævnt inde i chippen. I slutningen af kanalen er der et diasområde, der gør det muligt for cellerne at komme ind i mikrobrøndene. Som en demonstration, sfæroider blev genereret af monokultur og coculture af menneskelige Adipose-afledte stamceller og menneskelige lunge fibroblaster under høj tyngdekraften betingelser ved hjælp af systemet. CMS-systemet brugte en simpel operation ordning til at producere coculture sfæroider af forskellige strukturer af koncentrisk, Janus og sandwich. CMS-systemet vil være nyttigt i cellebiologi og vævsteknik undersøgelser, der kræver sfæroider og organoid kultur af enkelt eller flere celletyper.

Den 6 cm diameter CMS kultur chip (figur 2) blev udført med succes efter ovenstående protokol. Først blev chippen lavet separat fra et toplag og et bund lag og derefter bundet sammen af plasma binding. Resulterende sfæroider kan let samles ved at løsne chippen. Kanalen af CMS kultur chip omfatter en indsugnings port og centrale, slide, og strips med mikrobrønde regioner (figur 3). Celle-, medium-og pluroniske opløsninger injiceres gennem et indløbs hul m...

Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Vi præsenterer en motordrevet centrifugal mikrofluidic enhed, der kan dyrke celle sfæroider. Ved hjælp af denne enhed, sfæroider af enkelt eller flere celletyper kunne let cocultureres under høj tyngdekraft betingelser.

Lab-on-a-CD-platform til generering af flercellede tredimensionelle Sfæroider

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Denne teknik kan bruges til at generere celle sfæroider fra individuelle og flere celletyper ved hjælp af en lab-on-a-CD platform, et banebrydende system til den hurtige generation af sfæroider. Teknikken bruger centrifugalkraft til at deponere celler i udpegede mikroboer, hvilket giver mulighed for sekventiel opstemthed af flere celletyper til produktion af forskellige sfæroider. Til CMS kultur chip fabrikation, først gøre polycarbonat forme til toppen og nederste lag af kulturchippen ved computer numerisk kontrol bearbejdning.Næste mix PDMS base og PDMS hærdningsmiddel på en 10 til et forhold i fem minutter, før du placerer blandingen i en eksiccator i en time for at fjerne luftbobler. Hæld de afgasset PDMS blandingen i CMS kultur chip forme, og læg forme i ekssiccatoren i endnu en time for at fjerne eventuelle luftbobler. I slutningen af den anden afgasning hærdes blandingen i et varmekammer ved 80 grader Celsius i to timer, før spånerne anbringes i en støvsuget plasmarenser med de overflader, der skal bindes opad.Udsæt kulturchipsene for luftassisteret plasma ved en effekt på 18 watt i 30 sekunder, og lim de to lag af chippen i varmekammeret ved 80 grader Celsius i 30 minutter for at øge vedhæftningsstyrken. Derefter steriliseres CMS-kulturchippen i en autoklave ved 121 grader Celsius i 15 minutter. For at forberede cellerne til sfæroide dannelse, tø en en-milliliter hætteglas indeholdende fem til 10 gange 10 til de fem celler af interesse i en 36,5 grader Celsius vandbad i to minutter, før du tilføjer en milliliter DMEM til cellerne med blid blanding.Næste tilføje cellerne til en 150-millimeter diameter Petriskål, der indeholder 15 milliliter 36,5-graders-Celsius medium, og læg skålen i en cellekultur inkubator i 24 timer. Den næste dag, erstatte supernatant med 15 milliliter frisk DMEM, og returnere cellerne til inkubatoren. For at løsne cellerne, skal du skabe kulturen med fire milliliter trypsin i fire minutter ved 36,5 grader Celsius og 5% kuldioxid, stoppe reaktionen med frisk medium, når cellerne er løftet fra bunden af skålen.Cellerne skal mærkes ved at opvarme et passende cellefluorescensfarvestof til stuetemperatur, før der tilsættes 20 mikroliter af vandfri dimethylsulfoxid til hætteglasset for at opnå en millimolaropløsning. Fluorescensen fortyndes til en endelig arbejdskoncentration af en mikromolar i DMEM, og farvestoffet til cellesuspensionen af interesse med skånsom blanding. Placer derefter cellerne i cellekulturskuvøsen i 20 minutter.For monokultur sfærisk dannelse, først tilføje 2,5 milliliter 4%Pluronic F-127 løsning til indløb hul i CMS kultur chip, mens dreje chippen ved 500 til 1, 000 rotationer i minuttet. Når hele opløsningen er tilsat, skal du dreje chippen ved 4.000 rotationer i minuttet i tre minutter ved hjælp af CMS-systemet. Ved rotationens afslutning inkuberes kulturchippen natten over ved 36,5 grader Celsius ved 5 % kuldioxid.Næste morgen skal du fjerne Pluronic-opløsningen og vaske kulturchippen med DMEM. Efter tørring af chippen i 12 timer på en ren bænk tilsættes 2,5 milliliter af mediet til indløbsporten, og chippen drejes ved 4.000 rotationer i minuttet i tre minutter. Ved rotationens afslutning erstattes 100 mikroliter af mediet i indløbsporten med 100 mikroliter af den forberedte cellesuspension, mens spånen roterer ved 500 til 1.000 rotationer i minuttet.Drej derefter chippen ved 3.000 rotationer i minuttet i tre minutter for at fange cellerne i hver mikrobrønd med centrifugalkraft, før du placerer chippen i cellekulturkubvøsen i tre dage, hvilket forfrisker mediet som påvist hver dag. Til generering af koncentrisk spheroid coculture, tilsæt den første population af celler i 100 mikroliter af medium til indløbsporten af chippen, mens chippen roterer ved 500 til 1.000 rotationer i minuttet efterfulgt af tre minutters rotation ved 3.000 rotationer i minuttet. Ved rotationens afslutning tilsættes 100 mikroliter af den anden cellepopulation, mens chippen roterer ved 500 til 1.000 rotationer i minuttet, og der drejes chippen ved 3.000 rotationer i minuttet i yderligere tre minutter.Når begge mængder celler er blevet injiceret, skal du placere chippen i cellekulturinkubatoren ved 1.000 til 2.000 rotationer i minuttet i 24 timer. For Janus sfæroide formation, tilsæt 100 mikroliter af den første population af celler, mens chippen roterer ved 500 til 1.000 rotationer i minuttet efterfulgt af tre minutter ved 3.000 rotationer i minuttet. Ved rotationens afslutning skal chippen i cellekulturinkubatoren vendes ved 1.000 til 2.000 rotationer i minuttet i tre timer.Ved slutningen af inkubationen tilsættes 100 mikroliter af den anden population af celler, mens chippen roterer ved 500 til 1.000 rotationer i minuttet, før chippen roteres ved 3.000 rotationer i minuttet i tre minutter. Placer derefter cellerne i cellekulturinkubatoren ved 1.000 til 2.000 rotationer pr. minut i 24 timer. For sandwich sfæroide formation, først tilføje 100 mikroliter af den første celle population, mens chippen roterer ved 500 til 1, 000 rotationer i minuttet efterfulgt af tre minutters rotation ved 3, 000 rotationer i minuttet.Ved rotationens afslutning skal spånnen på en rotator i cellekulturinkubatoren i to timer ved 1.000 til 2.000 rotationer pr. minut, før der tilføjes 100 mikroliter af den anden population af celler, mens chippen roterer ved 500 til 1.000 rotationer i minuttet. Drej chippen ved 3.000 omdr./min. i tre minutter, og sæt spånen tilbage i inkubatoren i en tre timers inkubation med rotation. Tilsæt derefter yderligere 100 mikroliter af den første cellepopulation, mens chippen roterer ved 500 til 1.000 rotationer i minuttet, og roter og kultur cellerne som netop påvist i 12 timer.Efter protokollen som vist, en seks-centimeter diameter CMS kultur chip kan med held fabrikeres. Cms-kulturchippens kanal består af en indløbsport og centrale, glide- og mikroopgangsregioner. Time-lapse billeder af to typer af cellekultur taget på 2,000 rotationer i minuttet for de første 24 timers kultur inden for de enkelte CMS chips, som påvist, viser den vellykkede dannelse af sfæroider.Billeddannelse af mikroboerne efter tre dages kultur viser, at sfæroiderne udviser en fremragende ensartethed og sfæriskhed. Cocultured sfæroider med konentrisk, Janus, og sandwich strukturer kan også genereres. Desuden viser cellekulturer, der er udsat for høj tyngdekraft i syv dage, efterfulgt af levende/døde pletter, at de fleste celler overlever langsigtet kultur i spånerne.De øverste og nederste lag af CMS kultur chip bør nøje justeres, når de er bundet, ellers antallet af celler i hver mikrowell kan ikke være lige. Denne undersøgelse kan sænke adgangsbarrieren for coculture sfærisk forskning og kan i vid udstrækning anvendes i coculture undersøgelser, for eksempel til screening af nye lægemidler af interesse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar-og tredimensionelle Udskrivning af ledende blæk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelige bruskvæv Fabrication Brug Tre-dimensionel Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse af Cell Migration inden for en tre-dimensionel kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Udvikling af en flercellet Tre-dimensionel organotypisk Model af menneskelige tarmslimhinden Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensionale epitelvæv indlejret i ekstracellulær matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrikation af Inverted Kolloid Crystal Poly (ethylenglycol) Stillads: En Tre-dimensionel Cell Culture Platform for levervæv Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Fremstilling af Tre-dimensionel papir-baserede mikrofluidenheder for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...