Name: lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche en sciences fondamentales (2016R1D1A1B03934418) et le Programme de développement des technologies bio et médicales (2018M3A9H1023141) de la NRF, et financé par le gouvernement coréen, MSIT.

1. Fabrication de puces de culture à base de microfluoïdes centrifuges (CMS)
<ol><li>Faire des moules PC pour les couches supérieures et inférieures de la puce de culture CMS par l'usinage CNC. Les dimensions détaillées de la puce sont indiquées à la figure 1.</li>
	<li>Mélanger la base PDMS et l'agent de durcissement PDMS à un rapport de 10:1 (w/w) pendant 5 min et placer dans un dessiccateur pendant 1 h pour enlever les bulles d'air.</li>
	<li>Après avoir versé le mélange De...

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+Advantages+and+applications.">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Tung, Y. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation.">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li></ol>

Le CMS est un système fermé dans lequel toutes les cellules injectées pénètrent dans le micropuits sans déchets, ce qui le rend plus efficace et économique que les méthodes conventionnelles de production de sphéroïdes à base de micropuits. Dans le système CMS, les supports sont remplacés tous les 12 à 24 h par un trou d'aspiration conçu pour enlever les supports de la puce (Figure 3A). Pendant le processus d'aspiration des médias, presque aucun média s'échappe de l'intérie...

Il est plus facile de simuler des microenvironnements biologiques in vivo avec une culture tridimensionnelle (3D) de cellules sphéroïdes qu'avec la culture cellulaire bidimensionnelle (2D) (p. ex., la culture conventionnelle des cellules de plat Petri) pour produire une culture expérimentale plus réaliste sur le plan physiologique résultats1. Actuellement disponibles méthodes de formation sphéroïde comprennent la technique de chute de suspension2, technique de superpose use liquide3, technique de cellulose carboxymethyl4, technique microfluidique à base de force magnétique5, et l'utilisation de bioréacteurs6. Bien que chaque méthode ait ses propres avantages, une amélioration supplémentaire de la reproductibilité, de la productivité et de la production de sphéroïdes de coculture est nécessaire. Par exemple, alors que la technique microfluidique à base de force magnétique5 est relativement peu coûteuse, les effets des champs magnétiques forts sur les cellules vivantes doivent être soigneusement examinés. Les avantages de la culture sphéroïde, en particulier dans l'étude de la différenciation et de la prolifération des cellules souches mésenchymales, ont été rapportés dans plusieurs études7,8,9.
Le système microfluidique centrifuge, également connu sous le nom de laboratoire-sur-un-CD (disque compact), est utile pour contrôler facilement le fluide à l'intérieur et exploiter la rotation du substrat et a donc été utilisé dans des applications biomédicales telles que les immunossays10, essais colorimétriques pour détecter les marqueurs biochimiques11, amplification de l'acide nucléique (PCR), systèmes automatisés d'analyse sanguine12, et tout-en-un dispositifs microfluidiques centrifuges13. La force motrice contrôlant le fluide est la force centripète créée par la rotation. En outre, plusieurs fonctions de mixage, de valorisation et de fractionnement d'échantillons peuvent être effectuées simplement dans cette plate-forme CD unique. Cependant, par rapport aux méthodes d'analyse biochimique mentionnées ci-dessus, il y a eu moins d'essais appliquant des plates-formes de CD aux cellules de culture, en particulier les sphéroïdes14.
Dans cette étude, nous montrons la performance du système sphéroïde microfluidique centrifuge (CMS) par monoculture ou coculture de cellules souches d'adipose humaine (hASC) et de fibroblastes pulmonaires humains (MRC-5). Cet article décrit en détail la méthodologie de recherche de notre groupe15. Ainsi, la plate-forme de laboratoire de culture sphéroïde sur un CD peut être facilement reproduite. Un système de génération CMS comprenant une puce de culture CMS, un support de puce, un moteur DC, une monture de moteur, et une plate-forme tournante, est présenté. La monture moteur est imprimée en 3D avec du styrène butadéin acrylonitrile (ABS). Le support de puce et la plate-forme rotative sont CNC (contrôle numérique de l'ordinateur) usiné avec le PC (polycarbonate). La vitesse de rotation du moteur est contrôlée de 200 à 4 500 tr/min en codant un algorithme PID (proportionnel-dérivé-dérivé) basé sur la modulation de la largeur des impulsions. Ses dimensions sont 100 mm x 100 mm x 150 mm et il pèse 860 g, ce qui le rend facile à manipuler. En utilisant le système CMS, les sphéroïdes peuvent être générés dans diverses conditions de gravité de 1 x g à 521 x g, de sorte que l'étude de la promotion de la différenciation cellulaire sous haute gravité peut être étendue à partir de cellules 2D16,17 à 3D Sphéroïde. La coculture de divers types de cellules est également une technologie clé pour imiter efficacement l'environnement in vivo18. Le système CMS peut facilement générer des sphéroïdes monoculturels, ainsi que des sphéroïdes de coculture de différents types de structures (p. ex. concentrique, Janus et sandwich). Le système CMS peut être utilisé non seulement dans de simples études sphéroïdes, mais aussi dans des études d'organoïdes 3D, pour tenir compte des structures des organes humains.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1056px;" width="1056">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">3D printer</td>
			<td style="width:171px;">Cubicon</td>
			<td style="width:124px;">3DP-210F</td>
			<td style="width:416px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15240-062</td>
			<td>Contained 1% of completed medium and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Green CMFDA</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C2925</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C34552</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Computer numerical control (CNC) rotary engraver</td>
			<td style="width:171px;">Roland DGA</td>
			<td style="width:124px;">EGX-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DC motor</td>
			<td style="width:171px;">Nurielectricity Inc.</td>
			<td style="width:124px;">MB-4385E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s modified eaggle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2020</td>
			<td>Contained 10% of completed medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">human lung fibroblasts (MRC-5)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Inventor 2019</td>
			<td style="width:171px;">Autodesk</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td>3D computer-aided design program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Petri dish &#934; 150 mm</td>
			<td style="width:171px;">JetBiofill</td>
			<td style="width:124px;">CAD010150</td>
			<td>Surface Treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:171px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:124px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">11/6/9003</td>
			<td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polycarbonate (PC)</td>
			<td style="width:171px;">Acrylmall</td>
			<td style="width:124px;">AC15PC</td>
			<td>200 x 200 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:171px;">Dowcorning</td>
			<td style="width:124px;">Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids

Une culture tridimensionnelle de cellules sphéroïdes peut obtenir des résultats plus utiles dans les expériences cellulaires parce qu'elle peut mieux simuler les microenvironnements cellulaires du corps vivant que la culture cellulaire bidimensionnelle. Dans cette étude, nous avons fabriqué une plate-forme de culture de laboratoire sur un CD (disque compact) à moteur électrique, appelée système de culture sphéroïde microfluidique centrifuge (CMS), pour créer des sphéroïdes cellulaires tridimensionnels (3D) mettant en œuvre une force centrifuge élevée. Cet appareil peut varier les vitesses de rotation pour générer des conditions de gravité de 1 x g à 521 x g. Le système CMS est de 6 cm de diamètre, a cent 400 micropuits m, et est fait en moulage avec du polydiméthylsiloxane dans un moule en polycarbonate préfabriqué par une machine de contrôle numérique de l'ordinateur. Un mur de barrière à l'entrée du canal du système CMS utilise la force centrifuge pour répartir les cellules uniformément à l'intérieur de la puce. À l'extrémité du chenal, il y a une région de glissement qui permet aux cellules d'entrer dans les micropuits. Comme démonstration, les sphéroïdes ont été générés par la monoculture et la coculture des cellules souches adipeuses humaines et des fibroblastes pulmonaires humains dans des conditions de haute gravité utilisant le système. Le système CMS a utilisé un schéma d'opération simple pour produire des sphéroïdes de coculture de diverses structures de concentrique, Janus, et sandwich. Le système CMS sera utile dans les études de biologie cellulaire et d'ingénierie tissulaire qui nécessitent des sphéroïdes et la culture organoïde de types de cellules simples ou multiples.

La puce de culture CMS de 6 cm de diamètre (figure 2) a été réalisée avec succès selon le protocole ci-dessus. Tout d'abord, la puce a été faite séparément à partir d'une couche supérieure et une couche inférieure, puis colléensemble par liaison plasmatique. Les sphéroïdes qui en résultent peuvent être facilement recueillis en détachant la puce. Le canal de la puce de culture CMS comprend un port d'entrée et des régions centrales, de glissement et de micropuits (<strong ...

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Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Nous présentons un dispositif microfluidique centrifuge à moteur qui peut cultiver des sphéroïdes cellulaires. À l'aide de cet appareil, les sphéroïdes de types de cellules simples ou multiples pourraient être facilement cocultivés dans des conditions de haute gravité.

Plateforme Lab-on-a-CD pour générer des sphéroïdes multicellulaires tridimensionnels

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Cette technique peut être utilisée pour générer des sphéroïdes cellulaires à partir de types de cellules individuelles et multiples à l’aide d’une plate-forme lab-on-a-CD, un système pionnier pour la génération rapide de sphéroïdes. La technique utilise la force centrifuge pour déposer les cellules dans des microwells désignés, permettant l’exaltation séquentielle de plusieurs types de cellules pour la production de divers sphéroïdes. Pour la fabrication de copeaux de culture CMS, faites d’abord des moules en polycarbonate pour les couches supérieures et inférieures de la puce de culture par usinage numérique de commande d’ordinateur.Mélanger ensuite la base PDMS et l’agent curatif PDMS à un rapport de 10 pour un pendant cinq minutes avant de placer le mélange dans un dessiccateur pendant une heure pour enlever les bulles d’air. Verser le mélange PDMS dégazé dans les moules à copeaux de culture CMS, et placer les moules dans le dessiccator pendant une heure de plus pour enlever les bulles d’air. À la fin du deuxième dégazage, guérir le mélange dans une chambre chauffante à 80 degrés Celsius pendant deux heures avant de placer les copeaux dans un aspirateur plasma avec les surfaces à collé face vers le haut.Exposez les puces de culture au plasma assisté par air à une puissance de 18 watts pendant 30 secondes, et lier les deux couches de la puce dans la chambre de chaleur à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes pour augmenter la force d’adhérence. Ensuite, stérilisez la puce de culture CMS dans un autoclave à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pour préparer les cellules à la formation de sphéroïdes, décongeler un flacon d’un millilitre contenant cinq à dix fois 10 aux cinq cellules d’intérêt dans un bain d’eau de 36,5 degrés Celsius pendant deux minutes avant d’ajouter un millilitre de DMEM aux cellules avec un mélange doux.Ajoutez ensuite les cellules à une boîte petri de 150 millimètres de diamètre contenant 15 millilitres de milieu de 36,5 degrés Celsius, et placez le plat dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez le supernatant par 15 millilitres de DMEM frais et retournez les cellules à l’incubateur. Pour détacher les cellules, créer la culture avec quatre millilitres de trypsine pendant quatre minutes à 36,5 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, arrêter la réaction avec un milieu frais lorsque les cellules se sont levées du fond du plat.Pour étiqueter les cellules, réchauffer un colorant de fluorescence cellulaire approprié à température ambiante avant d’ajouter 20 microlitres de sulfure de diméthyle anhydre au flacon pour obtenir une solution millimolaire. Diluer la fluorescence à une concentration de travail finale d’un micromolaire dans le DMEM, et ajouter le colorant à la suspension cellulaire d’intérêt avec mélange doux. Ensuite, placez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 20 minutes.Pour la formation de sphéroïdes en monoculture, ajoutez d’abord 2,5 millilitres de solution F-127 pluronique de 4 % au trou d’entrée de la puce de culture CMS tout en faisant pivoter la puce à 500 à 1 000 rotations par minute. Quand toute la solution a été ajoutée, faites pivoter la puce à 4000 rotations par minute pendant trois minutes à l’aide du système CMS. À la fin de la rotation, incuber la puce de culture pendant la nuit à 36,5 degrés Celsius à 5% de dioxyde de carbone.Le lendemain matin, retirez la solution pluronique et lavez la puce de culture avec du DMEM. Après avoir sécher la puce pendant 12 heures sur un banc propre, ajouter 2,5 millilitres du milieu au port d’entrée, et faire pivoter la puce à 4000 rotations par minute pendant trois minutes. À la fin de la rotation, remplacer 100 microlitres du milieu dans le port d’entrée par 100 microlitres de la suspension cellulaire préparée pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute.Puis faites pivoter la puce à 3000 rotations par minute pendant trois minutes pour piéger les cellules de chaque microwell par force centrifuge avant de placer la puce dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois jours, rafraichissant le milieu comme démontré tous les jours. Pour la généra tion de coculture sphéroïde concentrique, ajoutez la première population de cellules dans 100 microlitres de milieu au port d’entrée de la puce pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute suivie de trois minutes de rotation à 3000 rotations par minute. À la fin de la rotation, ajouter 100 microlitres de la population de la deuxième cellule pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute, et faire pivoter la puce à 3000 rotations par minute pendant encore trois minutes.Quand les deux volumes de cellules ont été injectés, placez la puce dans l’incubateur de culture cellulaire à 1000 à 2000 rotations par minute pendant 24 heures. Pour la formation sphéroïde de Janus, ajouter 100 microlitres de la première population de cellules pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute suivie de trois minutes à 3000 rotations par minute. À la fin de la rotation, placez la puce dans l’incubateur de culture cellulaire pour une rotation de 1000 à 2000 rotations par minute pendant trois heures.À la fin de l’incubation, ajouter 100 microlitres de la deuxième population de cellules pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute avant de faire pivoter la puce à 3000 rotations par minute pendant trois minutes. Ensuite, placez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire à 1000 à 2000 rotations par minute pendant 24 heures. Pour la formation de sphéroïdes sandwich, ajoutez d’abord 100 microlitres de la première population cellulaire pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute suivies de trois minutes de rotation à 3000 rotations par minute.À la fin de la rotation, placez la puce sur un rotateur dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux heures à 1000 à 2000 rotations par minute avant d’ajouter 100 microlitres de la deuxième population de cellules pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute. Faites pivoter la puce à 3000 RPM pendant trois minutes, et placez la puce dans l’incubateur pour une incubation de trois heures avec rotation. Ajoutez ensuite 100 microlitres supplémentaires de la première population cellulaire pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute, et faites pivoter et culturer les cellules comme cela vient de le démontrer pendant 12 heures.Suivant le protocole tel que démontré, une puce de culture CMS de six centimètres de diamètre peut être fabriquée avec succès. Le chenal de la puce de culture CMS comprend un port d’entrée, et des régions centrales, slide et microwell. Les images en accéléré de deux types de culture cellulaire prises à 2000 rotations par minute pendant les 24 premières heures de culture au sein des puces CMS individuelles, comme démontré, montrent la formation réussie de sphéroïdes.L’imagerie des microwells après trois jours de culture montre que les sphéroïdes démontrent une excellente uniformité et sphérique. Des sphéroïdes cocultureux avec des structures conentriques, janus et sandwichs peuvent également être générés. En outre, les cultures cellulaires exposées à une gravité élevée pendant sept jours, suivies de taches vivantes ou mortes, démontrent que la plupart des cellules survivent à la culture à long terme dans les puces.Les couches supérieures et inférieures de la puce de culture CMS doivent être soigneusement alignées lorsqu’elles sont collées, sinon le nombre de cellules dans chaque microwell peut ne pas être égal. Cette étude peut abaisser la barrière d’entrée pour la recherche sphéroïde de coculture et peut être employée couramment dans des études de coculture, par exemple, pour criblage de nouveaux drogues d’intérêt.

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