Name: lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00
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Diese Forschung wurde durch das Basic Science Research Program (2016R1D1A1B03934418) und das Bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) des NRF und finanziert von der koreanischen Regierung MSIT unterstützt.

1. Zentrifugal mikrofluidische Basis Sphäroid (CMS) Kultur Chip Herstellung
<ol><li>Machen Sie PC-Formen für die oberen und unteren Schichten des CMS-Kulturchips durch CNC-Bearbeitung. Detaillierte Abmessungen des Chips sind in Abbildung 1angegeben.</li>
	<li>Mischen Sie PDMS-Basis und PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 (w/w) für 5 min und legen Sie sie in einen Trockengrund für 1 h, um Luftblasen zu entfernen.</li>
	<li>Nachdem Sie das PDMS-Gemisch in die Formen des CMS-Kulturch...

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+Advantages+and+applications.">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Tung, Y. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies.">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li><li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering.">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance.">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li><li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential.">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).</li><li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin.">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li><li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics.">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li><li>Park, Y. -. 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(110), e1 (2016).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity.">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li><li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications.">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li><li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform.">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li><li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts.">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li><li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation.">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li></ol>

Das CMS ist ein geschlossenes System, bei dem alle injizierten Zellen ohne Abfall in den Mikrobrunnen gelangen, was es effizienter und wirtschaftlicher macht als herkömmliche mikrowellbasierte Sphäroid-Erzeugungsmethoden. Im CMS-System wird das Medium alle 12–24 h durch ein Saugloch ersetzt, das entwickelt wurde, um die Medien im Chip zu entfernen (Abbildung 3A). Während des Mediensaugvorgangs entweicht kaum ein Medium aus dem Inneren des Mikrobrunnens aufgrund der Oberflächenspannung ...

Es ist einfacher, biologische In-vivo-Mikroumgebungen mit dreidimensionaler (3D) Sphäroid-Zellkultur zu simulieren als mit zweidimensionaler (2D) Zellkultur (z. B. konventionelle Petrischalenzellkultur), um physiologisch realistischere experimentelle Ergebnisse1. Derzeit verfügbare Sphäroid-Bildungsmethoden umfassen die Hängetropfentechnik2, Flüssigkeits-Overlay-Technik3, Carboxymethyl-Zellulose-Technik4, magnetische kraftbasierte mikrofluidische Technik5, und die Verwendung von Bioreaktoren6. Obwohl jede Methode ihre eigenen Vorteile hat, ist eine weitere Verbesserung der Reproduzierbarkeit, Produktivität und Erzeugung von Cokultursphäroiden erforderlich. Während beispielsweise die magnetkraftbasierte mikrofluidische Technik5 relativ kostengünstig ist, müssen die Auswirkungen starker Magnetfelder auf lebende Zellen sorgfältig geprüft werden. Die Vorteile der Sphäroidkultur, insbesondere bei der Untersuchung der mesenchymalen Stammzelldifferenzierung und -proliferation, wurden in mehreren Studien7,8,9berichtet.
Das zentrifugale mikrofluidische System, auch Lab-on-a-CD (Compact Disc) genannt, ist nützlich, um die Flüssigkeit im Inneren leicht zu steuern und die Rotation des Substrats zu nutzen und wurde daher in biomedizinischen Anwendungen wie Immunoassays10eingesetzt. kolorimetrische Assays zum Nachweis biochemischer Marker11, Nukleinsäure-Amplifikation (PCR) Assays, automatisierte Blutanalysesysteme12und All-in-One-Zentrifugal-Mikrofluidika13. Die treibende Kraft, die die Flüssigkeit steuert, ist die Zentripetalkraft, die durch Rotation entsteht. Darüber hinaus können mehrere Funktionen des Mischens, Valvings und Sample-Splittings einfach in dieser einzigen CD-Plattform durchgeführt werden. Im Vergleich zu den oben genannten biochemischen Analysemethoden gab es jedoch weniger Versuche, CD-Plattformen auf Kulturzellen anzuwenden, insbesondere Sphäroide14.
In dieser Studie zeigen wir die Leistungsfähigkeit des zentrifugalen mikrofluidischen Sphäroid-basierten Sphäroid-Systems (CMS) durch Monokultur oder Kokultur von humanen Adipose-abgeleiteten Stammzellen (hASC) und menschlichen Lungenfibroblasten (MRC-5). In diesem Beitrag wird die Forschungsmethodik unserer Gruppe ausführlich beschrieben15. So kann die Sphäroid-Kultur-Lab-on-a-CD-Plattform einfach reproduziert werden. Ein CMS-Erzeugungssystem bestehend aus einem CMS-Kulturchip, einem Chiphalter, einem Gleichstrommotor, einer Motorhalterung und einer rotierenden Plattform wird vorgestellt. Die Motorhalterung ist 3D mit Acrylnitril Butadien-Styrol (ABS) bedruckt. Der Chiphalter und die rotierende Plattform sind CNC (Computer numerische Steuerung) mit dem PC (Polycarbonat) bearbeitet. Die Drehzahl des Motors wird von 200 bis 4.500 Umdrehungen pro Minute durch Kodierung eines PID-Algorithmus (proportional-integral-derivative) auf Basis der Pulsweitenmodulation gesteuert. Seine Abmessungen sind 100 mm x 100 mm x 150 mm und wiegt 860 g, so dass es einfach zu handhaben. Mit dem CMS-System können Sphäroide unter verschiedenen Schwerkraftbedingungen von 1 x g bis 521 x gerzeugt werden, so dass die Untersuchung der Zelldifferenzierungsförderung unter hoher Schwerkraft von den 2D-Zellen16,17 bis 3D erweitert werden kann. Sphäroid. Kokultur verschiedener Zelltypen ist auch eine Schlüsseltechnologie, um die in vivo-Umgebung effektiv nachzuahmen18. Das CMS-System kann problemlos Monokultur-Sphäroide sowie Cokultur-Sphäroide verschiedener Strukturtypen (z. B. konzentrisch, Janus und Sandwich) erzeugen. Das CMS-System kann nicht nur in einfachen Sphäroidstudien, sondern auch in 3D-Organoidstudien genutzt werden, um menschliche Organstrukturen zu berücksichtigen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1056px;" width="1056">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">3D printer</td>
			<td style="width:171px;">Cubicon</td>
			<td style="width:124px;">3DP-210F</td>
			<td style="width:416px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15240-062</td>
			<td>Contained 1% of completed medium and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Green CMFDA</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C2925</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C34552</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Computer numerical control (CNC) rotary engraver</td>
			<td style="width:171px;">Roland DGA</td>
			<td style="width:124px;">EGX-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DC motor</td>
			<td style="width:171px;">Nurielectricity Inc.</td>
			<td style="width:124px;">MB-4385E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s modified eaggle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2020</td>
			<td>Contained 10% of completed medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">human lung fibroblasts (MRC-5)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Inventor 2019</td>
			<td style="width:171px;">Autodesk</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td>3D computer-aided design program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Petri dish &#934; 150 mm</td>
			<td style="width:171px;">JetBiofill</td>
			<td style="width:124px;">CAD010150</td>
			<td>Surface Treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:171px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:124px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">11/6/9003</td>
			<td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polycarbonate (PC)</td>
			<td style="width:171px;">Acrylmall</td>
			<td style="width:124px;">AC15PC</td>
			<td>200 x 200 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:171px;">Dowcorning</td>
			<td style="width:124px;">Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids

Eine dreidimensionale sphäroide Zellkultur kann in Zellexperimenten nützlichere Ergebnisse erzielen, da sie Zellmikroumgebungen des lebenden Körpers besser simulieren kann als zweidimensionale Zellkulturen. In dieser Studie haben wir eine elektrische motorgesteuerte Lab-on-a-CD-Plattform (Compact Disc) hergestellt, ein so genanntes zentrifugales mikrofluidisches Sphäroid-basiertesphärisches Sphäroid (CMS)-Kultursystem, um dreidimensionale (3D) Zellsphäride zu erstellen, die eine hohe Zentrifugalkraft implementieren. Dieses Gerät kann die Drehzahlen variieren, um Schwerkraftbedingungen von 1 x g bis 521 x gzu erzeugen. Das CMS-System hat einen Durchmesser von 6 cm, hat hundert 400 m Mikroschäbe und wird durch Formen mit Polydimethylsiloxan in einer Polycarbonatform hergestellt, die von einer numerischen Computersteuerungsmaschine vorgefertigt wurde. Eine Barrierewand am Kanaleingang des CMS-Systems nutzt Fliehkraft, um Zellen gleichmäßig im Chip zu verteilen. Am Ende des Kanals befindet sich ein Diabereich, der es den Zellen ermöglicht, in die Mikrobrunnen einzudringen. Als Demonstration wurden Sphäroide durch Monokultur und Kokultur menschlicher, aus Fettgewonnener Stammzellen und menschlicher Lungenfibroblasten unter Hochgravitationsbedingungen mit Hilfe des Systems erzeugt. Das CMS-System verwendete ein einfaches Betriebsschema, um Cokultur-Sphäroide verschiedener Strukturen von Konzentrisch, Janus und Sandwich zu produzieren. Das CMS-System wird in Zellbiologie- und Gewebe-Engineering-Studien nützlich sein, die Sphäroide und organoide Kultur von einzelnen oder mehreren Zelltypen erfordern.

Der CMS-Kulturchip mit einem Durchmesser von 6 cm (Abbildung 2) wurde erfolgreich nach dem obigen Protokoll hergestellt. Zunächst wurde der Chip getrennt von einer oberen und einer unteren Schicht hergestellt und dann durch Plasmabindung miteinander verbunden. Die resultierenden Sphäroide können leicht durch Lösen des Chips gesammelt werden. Der Kanal des CMS-Kulturchips besteht aus einem Einlassanschluss und zentralen, gleitenden und Microwell-Regionen (Abbildung 3<...

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Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Wir präsentieren ein motorbetriebenes zentrifugales mikrofluidisches Gerät, das Zellsphäride kultivieren kann. Mit diesem Gerät können Sphäroide von einzelnen oder mehreren Zelltypen leicht unter hohen Schwerkraftbedingungen kokultiviert werden.

Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Diese Technik kann verwendet werden, um Zellsphäride aus einzelnen und mehreren Zelltypen mit einer Lab-on-a-CD-Plattform zu erzeugen, einem wegweisenden System für die schnelle Erzeugung von Sphäroiden. Die Technik verwendet Zentrifugalkraft, um Zellen in ausgewiesenen Mikrobrunnen abzulagern, was die sequentielle Elation mehrerer Zelltypen für die Produktion verschiedener Sphäroide ermöglicht. Für die CMS-Kulturchip-Herstellung, machen sie zuerst Polycarbonat-Formen für die obere und untere Schicht des Kulturchips durch Computer-Numerische Steuerungsbearbeitung.Nächste Mischen PDMS-Basis und PDMS-Härtungsmittel in einem Verhältnis von 10 zu 1 für fünf Minuten, bevor Sie die Mischung in einem Trockengerät für eine Stunde, um Luftblasen zu entfernen. Gießen Sie die entgaste PDMS-Mischung in die CMS-Kultur-Chip-Formen, und legen Sie die Formen in den Trockenbau für eine weitere Stunde, um alle Luftblasen zu entfernen. Am Ende der zweiten Entgasung das Gemisch in einer Wärmekammer bei 80 Grad Celsius zwei Stunden lang aushärten, bevor die Späne in einen vakuumierten Plasmareiniger mit den zu verklebenden Oberflächen nach oben gegeben werden.Setzen Sie die Kulturchips 30 Sekunden lang mit einer Leistung von 18 Watt dem luftunterstützten Plasma aus und kleben Sie die beiden Schichten des Chips in der Wärmekammer 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius, um die Haftfestigkeit zu erhöhen. Dann sterilisieren Sie den CMS-Kulturchip in einem Autoklaven bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Um die Zellen auf die Sphäroidbildung vorzubereiten, tauen Sie eine Ein-Milliliter-Durchstechflasche auf, die fünf bis zehn mal 10 auf die fünf von Interesse sindden Zellen in einem 36,5 Grad Celsius Wasserbad zwei Minuten lang enthält, bevor Sie den Zellen mit sanftem Mischen einen Milliliter DMEM hinzufügen.Als nächstes fügen Sie die Zellen zu einer Petrischale mit einem Durchmesser von 150 Millimetern hinzu, die 15 Milliliter 36,5-Grad-Celsius-Medium enthält, und legen Sie die Schale 24 Stunden lang in einen Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Überstand durch 15 Milliliter frisches DMEM, und geben Sie die Zellen an den Inkubator zurück. Um die Zellen zu lösen, erstellen Sie die Kultur mit vier Milliliter Trypsin für vier Minuten bei 36,5 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, stoppen Sie die Reaktion mit frischem Medium, wenn die Zellen von der Unterseite der Schale angehoben haben.Um die Zellen zu kennzeichnen, erwärmen Sie einen geeigneten Zellfluoreszenzfarbstoff auf Raumtemperatur, bevor Sie 20 Mikroliter wasserfreies Dimethylsulfoxid in die Durchstechflasche geben, um eine einmillimolarige Lösung zu erhalten. Verdünnen Sie die Fluoreszenz auf eine endende Arbeitskonzentration von einem Mikromolaren in DMEM, und fügen Sie den Farbstoff mit sanftem Mischen in die zellgefederte Suspension von Interesse. Legen Sie dann die Zellen 20 Minuten lang in den Zellkultur-Inkubator.Für die Monokultur-Sphäroidbildung, fügen Sie zuerst 2,5 Milliliter 4%Pluronic F-127 Lösung, um das Einlassloch des CMS-Kulturchips, während drehen Sie den Chip bei 500 bis 1.000 Umdrehungen pro Minute. Wenn die gesamte Lösung hinzugefügt wurde, drehen Sie den Chip mit dem CMS-System drei Minuten lang mit 4.000 Umdrehungen pro Minute. Am Ende der Rotation, inkubieren Sie den Kulturchip über Nacht bei 36,5 Grad Celsius bei 5% Kohlendioxid.Entfernen Sie am nächsten Morgen die Pluronic-Lösung und waschen Sie den Kulturchip mit DMEM. Nach dem Trocknen des Chips für 12 Stunden auf einer sauberen Bank, fügen Sie 2,5 Milliliter des Mediums an den Einlassanschluss, und drehen Sie den Chip bei 4.000 Umdrehungen pro Minute für drei Minuten. Ersetzen Sie am Ende der Drehung 100 Mikroliter des Mediums im Einlassanschluss durch 100 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension, während sich der Chip bei 500 bis 1 000 Umdrehungen pro Minute dreht.Drehen Sie den Chip dann drei Minuten lang mit 3.000 Umdrehungen pro Minute, um die Zellen in jedem Mikrobrunnen durch Zentrifugalkraft einzufangen, bevor Sie den Chip drei Tage lang im Zellkultur-Inkubator platzieren, und erfrischen Sie das Medium, wie jeden Tag gezeigt wird. Für die Erzeugung konzentrischer Sphäroid-Kokultur fügen Sie die erste Population von Zellen in 100 Mikroliter n. Medium in den Einlassanschluss des Chips ein, während sich der Chip mit 500 bis 1.000 Umdrehungen pro Minute dreht, gefolgt von drei Minuten Rotation bei 3.000 Rotationen pro Minute. Fügen Sie am Ende der Drehung 100 Mikroliter der zweiten Zellpopulation hinzu, während sich der Chip mit 500 bis 1 000 Umdrehungen pro Minute dreht, und drehen Sie den Chip weitere drei Minuten bei 3.000 Umdrehungen pro Minute.Wenn beide Zellvolumen injiziert wurden, legen Sie den Chip 24 Stunden lang bei 1 000 bis 2 000 Umdrehungen pro Minute in den Zellkultur-Inkubator. Für die Janus Sphäroidbildung fügen Sie 100 Mikroliter der ersten Zellpopulation hinzu, während sich der Chip mit 500 bis 1 000 Umdrehungen pro Minute dreht, gefolgt von drei Minuten bei 3.000 Umdrehungen pro Minute. Platzieren Sie den Chip am Ende der Drehung drei Stunden lang im Zellkultur-Inkubator für die Rotation bei 1 000 bis 2 000 Umdrehungen pro Minute.Am Ende der Inkubation 100 Mikroliter der zweiten Zellpopulation hinzufügen, während sich der Chip mit 500 bis 1 000 Umdrehungen pro Minute dreht, bevor der Chip drei Minuten lang bei 3.000 Umdrehungen pro Minute gedreht wird. Platzieren Sie dann die Zellen im Zellkultur-Inkubator 24 Stunden lang bei 1 000 bis 2 000 Umdrehungen pro Minute. Für die Sandwich-Sphäroidbildung fügen Sie zunächst 100 Mikroliter der ersten Zellpopulation hinzu, während sich der Chip mit 500 bis 1 000 Umdrehungen pro Minute dreht, gefolgt von drei Minuten Drehung bei 3.000 Umdrehungen pro Minute.Platzieren Sie den Chip am Ende der Drehung zwei Stunden lang auf einem Rotator im Zellkultur-Inkubator bei 1.000 bis 2 000 Umdrehungen pro Minute, bevor Sie 100 Mikroliter der zweiten Zellpopulation hinzufügen, während sich der Chip mit 500 bis 1 000 Umdrehungen pro Minute dreht. Drehen Sie den Chip drei Minuten lang bei 3.000 Umdrehungen, und legen Sie den Chip für eine dreistündige Inkubation mit Drehung wieder in den Inkubator. Fügen Sie dann weitere 100 Mikroliter der ersten Zellpopulation hinzu, während sich der Chip mit 500 bis 1.000 Umdrehungen pro Minute dreht, und drehen und kultiieren Sie die Zellen, wie gerade für 12 Stunden demonstriert.Nach dem Protokoll, wie gezeigt, kann ein CMS-Kulturchip mit sechs Zentimetern Durchmesser erfolgreich hergestellt werden. Der Kanal des CMS-Kulturchips besteht aus einem Einlassanschluss sowie zentralen, slide- und microwell-Regionen. Zeitrafferbilder von zwei Arten von Zellkulturen, die in den ersten 24 Stunden der Kultur innerhalb einzelner CMS-Chips mit 2 000 Umdrehungen pro Minute aufgenommen wurden, zeigen die erfolgreiche Bildung von Sphäroiden.Die Bildgebung der Mikrobrunnen nach drei Tagen Kultur zeigt, dass die Sphäroide eine ausgezeichnete Gleichförmigkeit und Sphärizität aufweisen. Cokultivierte Sphäroide mit konentric,Janus- und Sandwichstrukturen können ebenfalls erzeugt werden. Darüber hinaus zeigen Zellkulturen, die sieben Tage lang hoher Schwerkraft ausgesetzt sind, gefolgt von Leben/Toten-Färbung, dass die meisten Zellen die langfristige Kultur innerhalb der Chips überleben.Die obere und untere Schicht des CMS-Kulturchips sollten sorgfältig ausgerichtet werden, wenn sie gebunden sind, da andernfalls die Anzahl der Zellen in jedem Mikrobrunnen möglicherweise nicht gleich ist. Diese Studie kann die Eintrittsbarriere für die Cokultur-Sphäroidforschung senken und kann in Kokulturstudien weit verbreitet sein, beispielsweise für das Screening neuer Medikamente von Interesse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar-und Drei-Dimensional Printing von Leitfähige Druckfarben

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Die Herstellung von Inverted Kolloid-Kristallen Poly (Ethylenglycol) Scaffold: Eine dreidimensionale Zellkultur-Plattform für Leber-Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Herstellung von dreidimensionalen Papierbasis Microfluidic Devices für Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...