Name: lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

מחקר זה היה נתמך על ידי התוכנית הבסיסית לחקר המדע (2016R1D1A03934418) ותוכנית ביו & טכנולוגיה רפואית (2018M3A9H1023141) של ה-NRF, וממומן על ידי הממשלה הקוריאנית, MSIT.

1. הייצור המבוסס על שבב התרבות של מיקרופלוטואידים (CMS)
<ol><li>הפוך את תבניות המחשב לשכבות העליונות והתחתונות של שבב התרבות של CMS על ידי עיבוד שבבי CNC. מידות מפורטות של השבב ניתנות באיור 1.</li>
	<li>מערבבים בסיס PDMS ו PDMS לריפוי הסוכן ביחס של 10:1 (w/w) עבור 5 דקות ומקום desiccator עבור 1 h כדי להס?...

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+Advantages+and+applications.">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array.">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li><li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroids+in+Cancer+Research.">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li><li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies.">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li><li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering.">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance.">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li><li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential.">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).</li><li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin.">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li><li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics.">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li><li>Park, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood.">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity.">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li><li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications.">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li><li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform.">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li><li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts.">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li><li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation.">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li></ol>

CMS הוא מערכת סגורה שבה כל התאים המוזרקים להיכנס למיקרוגל ללא בזבוז, מה שהופך אותו יעיל יותר וחסכוני יותר מאשר שיטות הדור המבוסס על מבוססי המיקרוגל. במערכת CMS, התקשורת מוחלפת מדי 12-24 שעות דרך חור יניקה שנועד להסיר את המדיה בשבב (איור 3A). במהלך השאיבה מדיה, בקושי כל אמצעי התקשור?...

קל יותר לדמות ביולוגי בvivo מיקרו-סביבות עם תלת מימדי (3D) תרבות תא ספרואיד מאשר עם 2-מימדי (2D) תרבות התא (g., המקובלת בצלחת פטרי התרבות תאים) כדי לייצר ניסוי מציאותי יותר מבחינה פיזיולוגית תוצאות1. שיטות היווצרות הספרואיד הזמינות כוללות את טכניקת השחרור התלויה2, טכניקת כיסוי נוזלי3, טכניקה תאית מגנטית4, טכניקת microfluidic מגנטי מבוסס כוח5, והשימוש ב שחקני המשך6. למרות שלכל שיטה יש יתרונות משלה, שיפור נוסף באופן הנקרא, פרודוקטיביות ויצירת הספרואידים מניבים הכרחי. לדוגמה, בעוד טכניקת microflu, מבוססי כוח מגנטית5 היא זולה יחסית, ההשפעות של שדות מגנטיים חזקים על תאי החיים חייבים להיחשב בזהירות. היתרונות של תרבות ספרואיד, במיוחד בחקר תא גזע mesenchymal והתפשטות, דווחו במספר מחקרים7,8,9.
מערכת מיקרופלואידיג צנטריפוגלי, הידוע גם בשם lab-על-a-CD (קומפקט דיסק), הוא שימושי עבור בקלות שליטה על הנוזל הפנימי וניצול הסיבוב של המצע, ובכך מנוצל יישומים ביו כגון חיסוני10, מטרי הצביעה בחני לזיהוי סמנים ביוכימיים11, הגברה חומצות גרעין (PCR) בחני, מערכות ניתוח דם אוטומטי12, ו-all-in-one צנטריפוגלי מיקרופלואידיc מכשירים13. הכוח המניע השולט בנוזל הוא כוח הצנטריות שנוצר בסיבוב. בנוסף, פונקציות מרובות של ערבוב, ולינג, פיצול לדוגמה ניתן לעשות פשוט בפלטפורמה זו תקליטור יחיד. עם זאת, בהשוואה לשיטות הניתוח הנ ל, היו פחות ניסיונות להחיל פלטפורמות תקליטור לתאי תרבות, במיוחד spheroids14.
במחקר זה, אנו מראים את הביצועים של מערכת ספרואיד מבוססי מיקרופלוטואידים (CMS) על ידי המערכת המבוססת על בסיס חד-תרבותי או התרבות של תאי הגזע האנושי הנגזר של אדיפוז (hASC) ופיברוהכדורים לריאות האדם (MRC-5). המאמר מתאר בפרוטרוט את מתודולוגיית המחקר של הקבוצה שלנו15. כך ניתן לשכפל בקלות את התרבות הספרואידית המעבדת על-גבי התקליטור. מערכת להפקת CMS הכוללת שבב תרבות CMS, מחזיק שבב, מנוע DC, הר מוטורי, ופלטפורמה מסתובבת, מוצג. הר המנוע הוא 3D מודפס עם יריעות אקריניטריל בוטטירן (ABS). מחזיק שבב ופלטפורמה מסתובבת הם CNC (שליטה מספרית המחשב) מחובר עם המחשב (פוליקרבונט). המהירות המסתובבת של המנוע נשלטת מ 200 כדי 4,500 סל ד על ידי קידוד (PID-אינטגרלי-נגזרים) אלגוריתם מבוסס על אפנון רוחב הדופק. הממדים שלה הם 100 mm x 100 mm x 150 mm וזה שוקל 860 g, מה שהופך אותו קל לטפל. באמצעות מערכת CMS, spheroids ניתן לייצר בתנאי כבידה שונים מ 1 x g כדי 521 x g, כך המחקר של בידול התא קידום תחת כבידה גבוהה ניתן להאריך מ 2d תאים16,17 כדי 3d ספרואיד. Coculture של סוגים שונים של תאים היא גם טכנולוגיה מרכזית לחיקוי יעיל של הסביבה vivo18. מערכת ה-CMS יכולה בקלות לייצר מונורואידים, כמו גם הספרואידים של מבנים מסוגים שונים (למשל, קונצנטריים, יאנוס וכריכים). מערכת CMS יכול להיות מנוצל לא רק במחקרים ספרואיד פשוט אלא גם במחקרים אורגאיד 3D, כדי לשקול מבנים איברים אנושיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1056px;" width="1056">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">3D printer</td>
			<td style="width:171px;">Cubicon</td>
			<td style="width:124px;">3DP-210F</td>
			<td style="width:416px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15240-062</td>
			<td>Contained 1% of completed medium and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Green CMFDA</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C2925</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C34552</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Computer numerical control (CNC) rotary engraver</td>
			<td style="width:171px;">Roland DGA</td>
			<td style="width:124px;">EGX-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DC motor</td>
			<td style="width:171px;">Nurielectricity Inc.</td>
			<td style="width:124px;">MB-4385E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s modified eaggle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2020</td>
			<td>Contained 10% of completed medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">human lung fibroblasts (MRC-5)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Inventor 2019</td>
			<td style="width:171px;">Autodesk</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td>3D computer-aided design program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Petri dish &#934; 150 mm</td>
			<td style="width:171px;">JetBiofill</td>
			<td style="width:124px;">CAD010150</td>
			<td>Surface Treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:171px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:124px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">11/6/9003</td>
			<td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polycarbonate (PC)</td>
			<td style="width:171px;">Acrylmall</td>
			<td style="width:124px;">AC15PC</td>
			<td>200 x 200 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:171px;">Dowcorning</td>
			<td style="width:124px;">Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids

תרבות תא ספרואיד תלת מימדי יכולה להשיג תוצאות שימושיות יותר בניסויים בתאים, משום שהוא יכול לדמות טוב יותר מיקרוסביבות תאים של הגוף החי מאשר תרבות תא דו-ממדית. במחקר זה, אנו מפוברק מנוע חשמלי מונחה מעבדה-on-a-CD (קומפקט דיסק) פלטפורמה, המכונה מערכת מבוססי מיקרופלואידיג צנטריפוגלי (CMS) התרבות, כדי ליצור תלת מימדי (3D) מספרי טלפון של תאים המיישמים כוח צנטריפוגלי גבוה. התקן זה יכול לשנות את מהירויות הסיבוב כדי ליצור תנאי הכבידה מ 1 x g כדי 521 x g. מערכת CMS היא 6 ס מ קוטר, יש 500 יקרומטר המיקרוגל, והוא נעשה על ידי דפוס עם polydiמתיל siloxane בתבנית פוליקרבונט מראש על ידי מחשב בקרה מספרית. חומת מחסום בכניסה לערוץ של מערכת CMS משתמשת בכוח צנטריפוגלי כדי לפזר תאים באופן שווה בתוך השבב. בסוף הערוץ, יש אזור שקופית המאפשר לתאים להיכנס למיקרוגל. כהדגמה, נוצרו הספרואידים על ידי תרבות חד-תרבותית ומקודת של תאי גזע האדם הנגזר של אדיפוז והריאות האנושית בתנאי כבידה גבוהה באמצעות המערכת. מערכת ה-CMS השתמשה בתוכנית פעולה פשוטה כדי לייצר מספרי התרבות של מבנים שונים של קונצנטריים, יאנוס וכריכים. מערכת CMS יהיה שימושי בביולוגיה התא ולימודי הנדסת רקמות הדורשות spheroids ותרבות אורגאידית של סוגי תא יחיד או מרובים.

שבב התרבות CMS בקוטר 6 ס מ (איור 2) נעשה בהצלחה בעקבות הפרוטוקול הנ ל. ראשית, השבב נעשה בנפרד משכבה עליונה ושכבה תחתונה ולאחר מכן התחברה יחד על ידי התחברות פלזמה. ניתן לאסוף בקלות spheroids על-ידי ניתוק השבב. הערוץ של שבב התרבות של CMS כולל יציאת מפרץ ואזורי מרכז, שקופית ולמיקרוגל (<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

אנחנו מציגים מכשיר מיקרופלואידיסי צנטריפוגלי מנוע שיכול לטפח את התאים הניידים. באמצעות התקן זה, הספרואידים של סוגי תא יחיד או מרובים יכול להיות בקלות מתורבת בתנאי כבידה גבוהה.

פלטפורמת מעבדה-על-CD ליצירת רב-תאיים תלת מימדי

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

טכניקה זו יכולה לשמש ליצירת כדוריות תאים מסוגים בודדים ומרובים של תאים באמצעות פלטפורמת מעבדה על תקליטור, מערכת חלוצית לדור המהיר של כדוריות. הטכניקה משתמשת בכוח צנטריפוגלי כדי להפקיד תאים למיקרווולים ייעודיים, ומאפשרת התרומות מתמשך של סוגי תאים מרובים לייצור כדוריות מגוונות. עבור ייצור שבב תרבות CMS, תחילה להפוך תבניות פוליקרבונט עבור השכבות העליונות והתחתונות של שבב התרבות על ידי עיבוד שליטה מספרית במחשב.הבא לערבב בסיס PDMS וסוכן ריפוי PDMS ביחס של 10 לאחד במשך חמש דקות לפני הצבת התערובת ב desiccator במשך שעה אחת כדי להסיר בועות אוויר. יוצקים את תערובת PDMS degassed לתוך תבניות שבב תרבות CMS, וממקמים את התבניות לתוך desiccator במשך שעה אחת נוספת כדי להסיר את כל בועות האוויר. בסוף degassing השני, לרפא את התערובת בתא חום ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לפני הצבת השבבים בשואב פלזמה שואב עם המשטחים להיות מלוכדים מול למעלה.חשוף את שבבי התרבות לפלזמה בסיוע אוויר בעוצמה של 18 וואט למשך 30 שניות, וקשר את שתי השכבות של השבב בתא החום ב-80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להגדיל את עוצמת ההיתוך. לאחר מכן לעקר את שבב תרבות CMS autoclave ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. כדי להכין את התאים להיווצרות כדורית, להפשיר בקבוקון אחד מיליליטר המכיל חמש עד 10 פעמים 10 לחמשת התאים של עניין באמבט מים 36.5 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות לפני הוספת מיליליטר אחד של DMEM לתאים עם ערבוב עדין.לאחר מכן מוסיפים את התאים לצלחת פטרי בקוטר 150 מ"מ המכילה 15 מיליליטר של מדיום 36.5 מעלות צלזיוס, ומ מניחים את המנה בחממה של תרבות התאים למשך 24 שעות. למחרת, החלף את העל-טבעי ב-15 מיליליטר של DMEM טרי, והחזר את התאים לחממה. כדי לנתק את התאים, ליצור את התרבות עם ארבעה מיליליטר של טריפסין במשך ארבע דקות ב 36.5 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, לעצור את התגובה עם מדיום טרי כאשר התאים הרימו מתחתית המנה.כדי לתייג את התאים, לחמם צבע פלואורסצנטי התא המתאים לטמפרטורת החדר לפני הוספת 20 microliters של דימתיל סולפוקסיד נטול מים לבקבוקון כדי להשיג פתרון מילימולרי אחד. מדללים את הפלואורסצנטיות לריכוז עבודה סופי של מיקרומולר אחד ב- DMEM, ומוסיפים את הצבע להשעיית התא המעניינים עם ערבוב עדין. לאחר מכן מניחים את התאים באינקובטור תרבות התא במשך 20 דקות.עבור היווצרות כדורית מונוקולטורה, תחילה להוסיף 2.5 מיליליטר של 4%Pluronic F-127 פתרון חור inlet של שבב תרבות CMS תוך סיבוב השבב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה. לאחר הוספת כל הפתרון, סובב את השבב במהירות של 4,000 סיבובים בדקה למשך שלוש דקות באמצעות מערכת CMS. בסוף הסיבוב, הדגירה שבב התרבות לילה ב 36.5 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני.למחרת בבוקר, להסיר את הפתרון הפלורוני, ולשטוף את שבב התרבות עם DMEM. לאחר ייבוש השבב במשך 12 שעות על ספסל נקי, מוסיפים 2.5 מיליליטר של המדיום ליציאת היציאה הקדמית, ומסובבים את השבב ב-4,000 סיבובים בדקה למשך שלוש דקות. בסוף הסיבוב, החלף 100 microliters של המדיום בנמל inlet עם 100 microliters של המתלה התא מוכן בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה.לאחר מכן לסובב את השבב ב 3, 000 סיבובים לדקה במשך שלוש דקות כדי ללכוד את התאים בכל microwell על ידי כוח צנטריפוגלי לפני הצבת השבב באינקובטור תרבות התא במשך שלושה ימים, מרענן את המדיום כפי שהוכח כל יום. עבור הדור של coculture spheroid קונצנטרי, להוסיף את האוכלוסייה הראשונה של תאים ב 100 microliters של בינוני ליציאת התוך של השבב בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1, 000 סיבובים לדקה ואחריו שלוש דקות של סיבוב ב 3, 000 סיבובים לדקה. בסוף הסיבוב, להוסיף 100 microliters של אוכלוסיית התא השני בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה, ולסובב את השבב ב 3, 000 סיבובים לדקה במשך שלוש דקות נוספות.כאשר שני כרכים של תאים הוזרקו, למקם את השבב לתוך החממה תרבות התא ב 1, 000 כדי 2, 000 סיבובים לדקה במשך 24 שעות. עבור היווצרות spheroid יאנוס, להוסיף 100 microliters של האוכלוסייה הראשונה של תאים בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1, 000 סיבובים לדקה ואחריו שלוש דקות ב 3, 000 סיבובים לדקה. בסוף הסיבוב, מניחים את השבב ב חממת תרבות התא לסיבוב ב 1, 000 עד 2, 000 סיבובים לדקה במשך שלוש שעות.בסוף הדגירה, להוסיף 100 microliters של האוכלוסייה השנייה של תאים בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה לפני סיבוב השבב ב 3, 000 סיבובים לדקה במשך שלוש דקות. לאחר מכן מניחים את התאים ב חממת תרבות התא ב 1, 000 כדי 2, 000 סיבובים לדקה במשך 24 שעות. עבור היווצרות spheroid כריך, תחילה להוסיף 100 microliters של אוכלוסיית התא הראשון בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה ואחריו שלוש דקות של סיבוב ב 3, 000 סיבובים לדקה.בסוף הסיבוב, מניחים את השבב על מסובב באינקובטור תרבות התא במשך שעתיים ב 1, 000 עד 2, 000 סיבובים לדקה לפני הוספת 100 microliters של האוכלוסייה השנייה של תאים בעוד השבב מסתובב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה. סובבו את השבב ב-3,000 סל"ד למשך שלוש דקות, והחזרו את השבב לאנקובטור לאגירה של שלוש שעות עם סיבוב. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטרים נוספים של אוכלוסיית התאים הראשונה בזמן השבב מסתובב ב 500 כדי 1,000 סיבובים לדקה, ולסובב ולתרבת את התאים כפי שהוכח רק במשך 12 שעות.בעקבות הפרוטוקול כפי שהוכח, שבב תרבות CMS בקוטר שישה סנטימטרים יכול להיות מפוברק בהצלחה. הערוץ של שבב התרבות CMS כולל יציאת יציאה, ואזורים מרכזיים, שקופיות ומיקרווולים. תמונות זמן לשגות של שני סוגים של תרבות התא נלקח ב 2, 000 סיבובים לדקה במשך 24 השעות הראשונות של תרבות בתוך שבבי CMS בודדים, כפי שהוכח, להראות היווצרות מוצלחת של כדוריות.הדמיה של המיקרווולים לאחר שלושה ימים של תרבות מראה כי הספרואידים מפגינים אחידות וספיריות מצוינות. ניתן גם ליצור ספרואידים עם קוננטרי, יאנוס ומבני סנדוויץ'. בנוסף, תרבות תאים שנחשפו לכבידה גבוהה במשך שבעה ימים, ואחריה כתמים חיים /מתים, מראות שרוב התאים שורדים תרבות ארוכת טווח בתוך השבבים.השכבות העליונות והתחתונות של שבב התרבות CMS צריכות להיות מיושרות בקפידה כאשר הן קשורות, אחרת מספר התאים בכל מיקרווול עשוי שלא להיות שווה. מחקר זה יכול להוריד את מחסום הכניסה למחקר ספרואיד coculture והוא יכול להיות בשימוש נרחב במחקרים coculture, למשל, לסינון תרופות חדשות של עניין.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מוליך

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

ייצור רקמת סחוס אנושי באמצעות שלושה ממדי הזרקת דיו טכנולוגיית הדפסה

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

המצאה של הפוך קולואיד קריסטל פולי (אתילן גליקול) פיגום: פלטפורמת תרבית תאים תלת ממדי עבור הנדסת רקמות כבדה

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

ייצור של מכשירי microfluidic נייר מבוססים תלת ממדי עבור Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...