Name: lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

Questa ricerca è stata supportata dal Basic Science Research Program (2016R1D1A1B03934418) e dal Bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) della NRF e finanziata dal governo coreano MSIT.

1. Fabbricazione di chip a base mistrali centrifuga (CMS)
<ol><li>Crea stampi per PC per gli strati superiore e inferiore del chip di coltura CMS mediante lavorazione CNC. Le dimensioni dettagliate del chip sono riportate nella Figura 1.</li>
	<li>Mescolare la base PDMS e l'agente di polimerità PDMS ad un rapporto di 10:1 (w/w) per 5 min e mettere in un desiccatore per 1 h per rimuovere le bolle d'aria.</li>
	<li>Dopo aver versato la miscela PDMS negli stampi del chip di coltura CMS, rimu...

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+Advantages+and+applications.">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Tung, Y. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies.">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li><li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering.">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance.">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li><li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential.">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).</li><li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin.">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li><li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics.">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li><li>Park, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood.">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity.">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li><li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications.">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li><li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform.">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li><li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts.">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li><li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation.">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li></ol>

Il CMS è un sistema chiuso in cui tutte le cellule iniettate entrano nel microwell senza rifiuti, rendendolo più efficiente ed economico rispetto ai metodi convenzionali di generazione di sferoidi a base di microwell. Nel sistema CMS, il supporto viene sostituito ogni 12-24 h attraverso un foro di aspirazione progettato per rimuovere il supporto nel chip (Figura 3A). Durante il processo di aspirazione dei supporti, a malapena qualsiasi supporto fuoriesce dall'interno del microposimo a caus...

È più facile simulare microambienti biologici in vivo con colture di cellule sferoidi tridimensionali (3D) che con colture cellulari bidimensionali (2D) (ad esempio, colture convenzionali di parabole di Petri) per produrre sperimentali più fisiologicamente realistici risultati1. I metodi di formazione degli sferoidi attualmente disponibili includono la tecnica di caduta appesa2, latecnica di sovrapposizione dei liquidi3, latecnicadi cellulosa carboxymetil bioreattori6. Anche se ogni metodo ha i suoi benefici, è necessario un ulteriore miglioramento della riproducibilità, della produttività e della generazione di sferoidi cocoltura. Ad esempio, mentre la tecnica microfluidica basata sulla forza magnetica5 è relativamente poco costosa, gli effetti dei forti campi magnetici sulle cellule viventi devono essere attentamente considerati. I benefici della cultura degli sferoidi, in particolare nello studio della differenziazione e della proliferazione delle cellule staminali mesenchymic, sono stati riportati in diversi studi7,8,9.
Il sistema microfluidico centrifugo, noto anche come lab-on-a-CD (compact disc), è utile per controllare facilmente il fluido all'interno e sfruttare la rotazione del substrato ed è stato quindi utilizzato in applicazioni biomediche come immunoasiste10, saggi colorimetrici per rilevare marcatori biochimici11, analisi dell'acido nucleico (PCR), sistemi automatizzati di analisi del sangue12e dispositivi microfluidici centrizici all-in-one13. La forza motrice che controlla il fluido è la forza centripeta creata dalla rotazione. Inoltre, più funzioni di missaggio, valving e suddivisione dei campioni possono essere eseguite semplicemente in questa singola piattaforma CD. Tuttavia, rispetto ai suddetti metodi di analisi biochimica, ci sono stati meno studi che hanno applicato piattaforme CD alle cellule di coltura, in particolare gli sferoidi14.
In questo studio, mostriamo le prestazioni del sistema di sferoidi a base microfluidica centrifuga (CMS) per monocoltura o cocultura di cellule staminali derivate da adiposi umane (hASC) e fibroblasti polmonari umani (MRC-5). Questo documento descrive in dettaglio la metodologia di ricerca del nostro gruppo15. Così, la piattaforma lab-on-a-CD di coltura sferoide può essere facilmente riprodotta. Viene presentato un sistema di generazione CMS che comprende un chip di coltura CMS, un supporto per chip, un motore DC, un supporto motore e una piattaforma rotante. Il supporto motore è stampato in 3D con acrylonitrile butadiene styrene (ABS). Il supporto del chip e la piattaforma rotante sono CNC (controllo numerico al computer) lavorati con il PC (policarbonato). La velocità di rotazione del motore è controllata da 200 a 4.500 rpm codificando un algoritmo PID (proporzionale-integrale-derivato) basato sulla modulazione larghezza-impulso. Le sue dimensioni sono 100 mm x 100 mm x 150 mm e pesa 860 g, rendendolo facile da maneggiare. Utilizzando il sistema CMS, gli sferoidi possono essere generati in varie condizioni di gravità da 1 x g a 521 x g, quindi lo studio della promozione della differenziazione cellulare sotto alta gravità può essere esteso da cellule 2D16,17 a 3D sferoide. La cocultura di vari tipi di cellule è anche una tecnologia chiave per imitare efficacemente l'ambiente in vivo18. Il sistema CMS può facilmente generare sferoidi monocoltura, così come sferoidi coculture di vari tipi di strutture (ad esempio, concentrico, Giano e sandwich). Il sistema CMS può essere utilizzato non solo in semplici studi sferoidi, ma anche in studi organoidi 3D, per considerare le strutture degli organi umani.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1056px;" width="1056">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">3D printer</td>
			<td style="width:171px;">Cubicon</td>
			<td style="width:124px;">3DP-210F</td>
			<td style="width:416px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15240-062</td>
			<td>Contained 1% of completed medium and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Green CMFDA</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C2925</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C34552</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Computer numerical control (CNC) rotary engraver</td>
			<td style="width:171px;">Roland DGA</td>
			<td style="width:124px;">EGX-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DC motor</td>
			<td style="width:171px;">Nurielectricity Inc.</td>
			<td style="width:124px;">MB-4385E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s modified eaggle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2020</td>
			<td>Contained 10% of completed medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">human lung fibroblasts (MRC-5)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Inventor 2019</td>
			<td style="width:171px;">Autodesk</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td>3D computer-aided design program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Petri dish &#934; 150 mm</td>
			<td style="width:171px;">JetBiofill</td>
			<td style="width:124px;">CAD010150</td>
			<td>Surface Treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:171px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:124px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">11/6/9003</td>
			<td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polycarbonate (PC)</td>
			<td style="width:171px;">Acrylmall</td>
			<td style="width:124px;">AC15PC</td>
			<td>200 x 200 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:171px;">Dowcorning</td>
			<td style="width:124px;">Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids

Una coltura tridimensionale di cellule sferoidi può ottenere risultati più utili negli esperimenti cellulari perché può simulare meglio i microambienti cellulari del corpo vivente rispetto alla coltura cellulare bidimensionale. In questo studio, abbiamo fabbricato una piattaforma di laboratorio su un CD (disco compatto) azionata a motore elettrico, chiamata sistema di coltura di sferoidi a base microfugale centrifuga , per creare sferoidi cellulari tridimensionali (3D) che implementano una forza centrifuga ad alta dimensione. Questo dispositivo può variare la velocità di rotazione per generare condizioni di gravità da 1 g a 521 x g. Il sistema CMS ha un diametro di 6 cm, ha cento micropozzi di 400 m ed è realizzato stampando con polidimetilsilosa in uno stampo in policarbonato prefatto da una macchina di controllo numerico al computer. Una parete di barriera all'ingresso del canale del sistema CMS utilizza la forza centrifuga per diffondere le cellule in modo uniforme all'interno del chip. Alla fine del canale, c'è una regione di scorrimento che permette alle cellule di entrare nei micropozzi. Come dimostrazione, gli sferoidi sono stati generati dalla monocoltura e dalla cocultura delle cellule staminali derivate dall'adiposità umana e dei fibroblasti polmonari umani in condizioni di alta gravità utilizzando il sistema. Il sistema CMS ha utilizzato un semplice schema operativo per produrre sferoidi cocoltura di varie strutture concentriche, giano e sandwich. Il sistema CMS sarà utile negli studi di biologia cellulare e ingegneria tissutale che richiedono sferoidi e coltura organoide di tipi di cellule singole o multiple.

Il chip di coltura CMS di 6 cm di diametro (Figura 2) è stato realizzato con successo seguendo il protocollo di cui sopra. In primo luogo, il chip è stato fatto separatamente da uno strato superiore e uno strato inferiore e poi legato insieme da incollaggio al plasma. Gli sferoidi risultanti possono essere facilmente raccolti staccando il chip. Il canale del chip di coltura CMS comprende una porta di ingresso e regioni centrali, scorrevoli e microwell (Figura 3</strong...

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Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Vi presentiamo un dispositivo microfluidico centricomotore a motore in grado di coltivare sferoidi cellulari. Utilizzando questo dispositivo, sferoidi di tipo cellulare singolo o multiplo potrebbe essere facilmente costati in condizioni di alta gravità.

Piattaforma lab-on-a-CD per la generazione di spheroid tridimensionali multicellulari

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Questa tecnica può essere utilizzata per generare sferoidi cellulari da singoli e più tipi di cellule utilizzando una piattaforma lab-on-a-CD, un sistema pionieristico per la rapida generazione di sferoidi. La tecnica utilizza la forza centrifuga per depositare le cellule in microliqui designati, permettendo l'euforia sequenziale di più tipi di cellule per la produzione di sferoidi diversi. Per la fabbricazione di chip di coltura CMS, realizzare prima stampi in policarbonato per gli strati superiore e inferiore del chip di coltura mediante lavorazione a controllo numerico computerizzato.Quindi mescolare la base PDMS e l'agente di polimerizzazione PDMS a un rapporto 10 a uno per cinque minuti prima di posizionare la miscela in un essiccatore per un'ora per rimuovere le bolle d'aria. Versare la miscela PDMS degassata negli stampi del chip di coltura CMS e posizionare gli stampi nell'essiccatore per un'altra ora per rimuovere eventuali bolle d'aria. Alla fine del secondo degassamento, polimerizzarla in una camera termica a 80 gradi Celsius per due ore prima di posizionare i trucioli in un aspirapolvere con le superfici da legare rivolte verso l'alto.Esporre i trucioli di coltura al plasma assistito dall'aria con una potenza di 18 watt per 30 secondi e legare i due strati del chip nella camera di calore a 80 gradi Celsius per 30 minuti per aumentare la forza di adesione. Quindi sterilizzare il chip di coltura CMS in un'autoclave a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Per preparare le cellule per la formazione di sferoidi, scongelare un flaconcino da un millilitro contenente da cinque a 10 volte 10 alle cinque cellule di interesse in un bagno d'acqua di 36,5 gradi Celsius per due minuti prima di aggiungere un millilitro di DMEM alle cellule con miscelazione delicata.Aggiungere quindi le celle a una piastra di Petri di 150 millimetri di diametro contenente 15 millilitri di mezzo di 36,5 gradi Celsius e posizionare il piatto in un incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Il giorno dopo, sostituire il supernatante con 15 millilitri di DMEM fresco e riportare le cellule nell'incubatrice. Per staccare le cellule, creare la coltura con quattro millilitri di tripsiderina per quattro minuti a 36,5 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, fermando la reazione con mezzo fresco quando le cellule si sono alzate dal fondo del piatto.Per etichettare le cellule, riscaldare un colorante a fluorescenza cellulare appropriato a temperatura ambiente prima di aggiungere 20 microlitri di solfossido di dimetile anidro al flaconcino per ottenere una soluzione millimolare. Diluire la fluorescenza ad una concentrazione di lavoro finale di un micromolare in DMEM e aggiungere il colorante alla sospensione cellulare di interesse con miscelazione delicata. Quindi posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 20 minuti.Per la formazione di sferoidi monocoltura, aggiungere prima 2,5 millilitri di soluzione F-127 pluronica al foro di ingresso del chip di coltura CMS ruotando il chip a 500-1.000 rotazioni al minuto. Una volta aggiunta tutta la soluzione, ruotare il chip a 4.000 rotazioni al minuto per tre minuti utilizzando il sistema CMS. Al termine della rotazione, incubare il chip di coltura durante la notte a 36,5 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica.La mattina seguente, rimuovere la soluzione Pluronic e lavare il chip di coltura con DMEM. Dopo aver asciugato il truciolo per 12 ore su una panca pulita, aggiungere 2,5 millilitri del mezzo alla porta di ingresso e ruotare il truciolo a 4.000 rotazioni al minuto per tre minuti. Al termine della rotazione, sostituire 100 microlitri del mezzo nella porta di ingresso con 100 microlitri della sospensione cellulare preparata mentre il chip ruota a 500 a 1.000 rotazioni al minuto.Quindi ruotare il chip a 3.000 rotazioni al minuto per tre minuti per intrappolare le cellule in ogni microwell per forza centrifuga prima di posizionare il chip nell'incubatore di coltura cellulare per tre giorni, rinfrescando il mezzo come dimostrato ogni giorno. Per la generazione di cocultura sferoide concentrica, aggiungere la prima popolazione di cellule in 100 microlitri di mezzo alla porta di ingresso del chip mentre il chip ruota a 500-1.000 rotazioni al minuto seguite da tre minuti di rotazione a 3.000 rotazioni al minuto. Alla fine della rotazione, aggiungere 100 microlitri della seconda popolazione cellulare mentre il chip ruota a 500 a 1.000 rotazioni al minuto e ruotare il chip a 3.000 rotazioni al minuto per altri tre minuti.Quando entrambi i volumi di cellule sono stati iniettati, posizionare il chip nell'incubatore di coltura cellulare a 1.000-2.000 rotazioni al minuto per 24 ore. Per la formazione di sferoidi Janus, aggiungere 100 microlitri della prima popolazione di cellule mentre il chip ruota a 500 a 1.000 rotazioni al minuto seguite da tre minuti a 3.000 rotazioni al minuto. Al termine della rotazione, posizionare il chip nell'incubatore di coltura cellulare per la rotazione a 1.000-2.000 rotazioni al minuto per tre ore.Alla fine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri della seconda popolazione di cellule mentre il chip ruota da 500 a 1.000 rotazioni al minuto prima di ruotare il chip a 3.000 rotazioni al minuto per tre minuti. Quindi posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare a 1.000-2.000 rotazioni al minuto per 24 ore. Per la formazione di sferoidi sandwich, aggiungere prima 100 microlitri della prima popolazione cellulare mentre il chip ruota a 500 a 1.000 rotazioni al minuto seguito da tre minuti di rotazione a 3.000 rotazioni al minuto.Alla fine della rotazione, posizionare il chip su un rotatore nell'incubatore di coltura cellulare per due ore a 1.000-2.000 rotazioni al minuto prima di aggiungere 100 microlitri della seconda popolazione di cellule mentre il chip ruota a 500-1.000 rotazioni al minuto. Ruotare il chip a 3.000 giri/min per tre minuti e riposizionare il chip nell'incubatore per un'incubazione di tre ore con rotazione. Quindi aggiungere altri 100 microlitri della prima popolazione cellulare mentre il chip ruota da 500 a 1.000 rotazioni al minuto e ruotare e colturare le cellule come appena dimostrato per 12 ore.Seguendo il protocollo come dimostrato, è possibile fabbricare con successo un chip di coltura CMS di sei centimetri di diametro. Il canale del chip di coltura CMS comprende una porta di ingresso e regioni centrali, scorrevoli e microwell. Le immagini time-lapse di due tipi di coltura cellulare scattate a 2.000 rotazioni al minuto per le prime 24 ore di coltura all'interno dei singoli chip CMS, come dimostrato, mostrano la formazione riuscita di sferoidi.L'imaging dei microlidi dopo tre giorni di coltura mostra che gli sferoidi dimostrano un'eccellente uniformità e sfericità. Possono anche essere generati sferoidi cocolturati con strutture conentriche, janus e sandwich. Inoltre, le colture cellulari esposte all'alta gravità per sette giorni, seguite dalla colorazione viva / morta, dimostrano che la maggior parte delle cellule sopravvive alla coltura a lungo termine all'interno dei chip.Gli strati superiore e inferiore del chip di coltura CMS devono essere accuratamente allineati quando sono legati, altrimenti il numero di celle in ogni microwell potrebbe non essere uguale. Questo studio può abbassare la barriera all'ingresso per la ricerca sugli sferoidi della cocoltura e può essere ampiamente utilizzato negli studi di cocultura, ad esempio, per lo screening di nuovi farmaci di interesse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Ricerca

Bioingegneria

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

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Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Stampa planare e tridimensionale di inchiostri conduttivi

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Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analisi della migrazione delle cellule all&#39;interno di una tridimensionale di collagene Matrix

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Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

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Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

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Fabbricazione di invertito colloidale cristallo poli (glicole etilenico) Scaffold: una piattaforma Cell Culture tridimensionale per il fegato Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

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