Name: lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research program (2016R1D1A1B03934418) og bio & Medical Technology Development program (2018M3A9H1023141) av NRF, og finansiert av den koreanske regjeringen, MSIT.

1. sentrifugal mikrovæskebasert-basert spheroid (CMS) kultur chip fabrikasjon
<ol><li>Lag PC muggsopp for toppen og bunnen lag av CMS kulturen chip av CNC maskinering. Detaljerte dimensjoner av brikken er gitt i figur 1.</li>
	<li>Bland PDMS base og PDMS herding agent i forholdet 10:1 (w/w) i 5 min og plasser i en desikator for 1 t for å fjerne luftbobler.</li>
	<li>Etter støping av PDMS blandingen i formene av CMS kultur chip, fjerne luftbobler for 1 t mer og kur i et varme kammer ved ...

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+Advantages+and+applications.">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array.">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li><li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroids+in+Cancer+Research.">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li><li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies.">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li><li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering.">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance.">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li><li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential.">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).</li><li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin.">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li><li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics.">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li><li>Park, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood.">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity.">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li><li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications.">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li><li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform.">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li><li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts.">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li><li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation.">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li></ol>

CMS er et lukket system der alle injisert celler inn i mikrotiterplateleser uten avfall, noe som gjør den mer effektiv og økonomisk enn konvensjonelle mikrotiterplateleser-baserte spheroid generasjon metoder. I CMS-systemet erstattes mediene hver 12 – 24 h gjennom et suge hull som er utformet for å fjerne mediene i brikken (figur 3a). Under Media suge prosessen, unnslipper knapt noen medier fra innsiden av mikrotiterplateleser på grunn av overflatespenningen mellom mediene og veggen av...

Det er lettere å simulere biologisk in vivo microenvironments med tredimensjonal (3D) spheroid cellekultur enn med to-dimensjonale (2D) cellekultur (for eksempel konvensjonelle Petri parabol cellekultur) for å produsere mer fysiologisk realistisk eksperimentell resultater1. Foreløpig tilgjengelig spheroid formasjon metoder inkluderer hengende slipp teknikk2, Liquid-overlay teknikk3, carboxymethyl cellulose teknikk4, magnetisk Force-baserte mikrovæskebasert teknikk5, og bruk av bioreaktorer6. Selv om hver metode har sine egne fordeler, er det nødvendig med ytterligere forbedring i reproduserbarhet, produktivitet og generering av coculture spheroids. For eksempel, mens den magnetiske Force-baserte mikrovæskebasert teknikk5 er relativt billig, effekten av sterke magnetiske felt på levende celler må vurderes nøye. Fordelene med spheroid kultur, spesielt i studiet av mesenchymal stilk cellen differensiering og spredning, er rapportert i flere studier7,8,9.
Sentrifugal mikrovæskebasert systemet, også kjent som Lab-on-a-CD (CD-plate), er nyttig for enkelt å kontrollere væsken inne og utnytte rotasjonen av underlaget og har dermed blitt utnyttet i biomedisinsk applikasjoner som immunanalyser10, fargemetrisk analyse for å oppdage biokjemiske markører11, nukleinsyre acid forsterkning (PCR) analyser, automatiserte blod analyse systemer12og alt-i-ett sentrifugal mikrovæskebasert enheter13. Drivkraften som kontrollerer væsken er den sentripetal kraften som skapes ved rotasjon. Ytterligere, mangfoldig funksjonene av blander, valving, og eksemplar splitting kan gjort bare i denne enkelt CD plattform. Men sammenlignet med de ovenfor nevnte biokjemiske analysemetoder, har det vært færre forsøk å bruke CD-plattformer til kultur celler, spesielt spheroids14.
I denne studien viser vi ytelsen til sentrifugal mikrovæskebasert-baserte spheroid (CMS)-systemet ved monokultur eller coculture av humane fett avledede stamceller (hASC) og humant lunge fibroblaster (MRC-5). Dette dokumentet beskriver i detalj vår gruppes forskningsmetode15. Således, det spheroid kulturen laboratorium-opp på-en-CD plattform kan lett reprodusert. En CMS genererer system bestående av et CMS kultur chip, en chip holder, en DC motor, en motor Mount, og en roterende plattform, er presentert. Motor braketten er 3D trykt med akrylnitril butadien styren (ABS). Chip holder og roterende plattform er CNC (datamaskin numerisk kontroll) bearbeidet med PC (polykarbonat). Rotasjonshastigheten til motoren styres fra 200 til 4 500 RPM ved å kode en PID (proporsjonal-Integral-derivat) algoritme basert på puls-bredde moduleringshjul. Dens dimensjoner er 100 mm x 100 mm x 150 mm og den veier 860 g, noe som gjør det enkelt å håndtere. Ved hjelp av CMS-systemet, kan spheroids genereres under ulike tyngdekraften forhold fra 1 x g til 521 x g, så studiet av celle differensiering forfremmelse under høy gravitasjon kan utvides fra 2D-celler16,17 til 3D spheroid. Coculture av ulike typer celler er også en viktig teknologi for effektivt å etterligne in vivo miljø18. Det CMS system kanne lett utvikle monokultur spheroids, likeledes idet coculture spheroids av forskjellige struktur typer (e.g., konsentrisk, Janus, og sandwich). CMS-systemet kan utnyttes ikke bare i enkle spheroid studier, men også i 3D-organoid studier, for å vurdere menneskelige organ strukturer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1056px;" width="1056">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">3D printer</td>
			<td style="width:171px;">Cubicon</td>
			<td style="width:124px;">3DP-210F</td>
			<td style="width:416px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15240-062</td>
			<td>Contained 1% of completed medium and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Green CMFDA</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C2925</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C34552</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Computer numerical control (CNC) rotary engraver</td>
			<td style="width:171px;">Roland DGA</td>
			<td style="width:124px;">EGX-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DC motor</td>
			<td style="width:171px;">Nurielectricity Inc.</td>
			<td style="width:124px;">MB-4385E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s modified eaggle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2020</td>
			<td>Contained 10% of completed medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">human lung fibroblasts (MRC-5)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Inventor 2019</td>
			<td style="width:171px;">Autodesk</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td>3D computer-aided design program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Petri dish &#934; 150 mm</td>
			<td style="width:171px;">JetBiofill</td>
			<td style="width:124px;">CAD010150</td>
			<td>Surface Treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:171px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:124px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">11/6/9003</td>
			<td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polycarbonate (PC)</td>
			<td style="width:171px;">Acrylmall</td>
			<td style="width:124px;">AC15PC</td>
			<td>200 x 200 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:171px;">Dowcorning</td>
			<td style="width:124px;">Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids

En tredimensjonal spheroid cellekultur kan få mer nyttige resultater i celle eksperimenter fordi det kan bedre simulere celle microenvironments av den levende kroppen enn to-dimensjonal cellekultur. I denne studien, fabrikkert vi en elektrisk motor-drevet Lab-on-a-CD (Compact Disc) plattform, kalt en sentrifugal mikrovæskebasert-baserte spheroid (CMS) kultur system, for å lage tredimensjonale (3D) celle spheroids implementere høy sentrifugalkraft. Denne enheten kan variere rotasjonshastighet for å generere tyngdekraft forhold fra 1 x g til 521 x g. CMS-systemet er 6 cm i diameter, har 500 μm microwells, og er laget av molding med Polydimethylsiloxan i en polykarbonat mold forhåndslagde av en datamaskin numerisk kontroll maskin. En barriere vegg ved kanal inngangen til CMS-systemet bruker sentrifugalkraften til å spre celler jevnt inne i brikken. På slutten av kanalen, det er en skyve område det innrømmer cellene å gå inn det microwells. Som en demonstrasjon, spheroids ble generert av monokultur og coculture av menneskelig fett-avledet stamceller og menneskelige lunge fibroblaster under høy gravitasjon forhold ved hjelp av systemet. CMS-systemet brukte en enkel operasjon ordning for å produsere coculture spheroids av ulike strukturer i konsentriske, Janus, og sandwich. CMS-systemet vil være nyttig i cellebiologi og vev engineering studier som krever spheroids og organoid kultur av én eller flere celletyper.

Den 6 cm diameter CMS kultur chip (figur 2) ble vellykket gjort etter ovennevnte protokollen. Først ble brikken laget separat fra et topplag og et nederste lag, og deretter limt sammen av plasma binding. Resulterende spheroids kan enkelt samles ved å løsne chip. Kanalen for CMS kultur chip består av en innløps port og sentrale, slide, og mikrotiterplateleser regioner (Figur 3). Celle-, medium-og pluronic-løsninger injiseres gjennom et innløps hull med en ...

Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Vi presenterer en motor drevet sentrifugal mikrovæskebasert innretning som kan dyrke celle spheroids. Ved hjelp av denne enheten, kan spheroids av én eller flere celletyper lett cocultured under høy gravitasjon forhold.

Lab-on-a-CD plattform for generering flercellede tredimensjonal Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Denne teknikken kan brukes til å generere celle spheroider fra individuelle og flere celletyper ved hjelp av en lab-on-a-CD-plattform, et banebrytende system for rask generering av sfæroider. Teknikken bruker sentrifugalkraft til å deponere celler i utpekte mikrobrønner, slik at sekvensiell oppmuntring av flere celletyper for produksjon av ulike sfæroider. For CMS kultur chip fabrikasjon, først lage polykarbonat former for de øverste og nederste lagene av kulturbrikken ved hjelp av datamaskin numerisk kontroll maskinering.Deretter blander PDMS-base og PDMS herdingsmiddel med et forhold på 10 til ett i fem minutter før blandingen plasseres i en desiccator i en time for å fjerne luftbobler. Hell den avgassede PDMS-blandingen i CMS-kulturbrikkeformene, og legg formene i desiccatoren i en time til for å fjerne eventuelle luftbobler. På slutten av den andre avgassing, kurere blandingen i et varmekammer på 80 grader Celsius i to timer før du plasserer chips i en støvsuget plasma renere med overflatene som skal bindes vendt opp.Utsett kulturbrikkene for luftassistert plasma med en effekt på 18 watt i 30 sekunder, og bind de to lagene av brikken i varmekammeret ved 80 grader Celsius i 30 minutter for å øke vedheftsstyrken. Steriliser deretter CMS-kulturbrikken i en autoklav ved 121 grader Celsius i 15 minutter. For å forberede cellene for sfæroid dannelse, tine en ett milliliter hetteglass som inneholder fem til 10 ganger 10 til de fem cellene av interesse i en 36,5 grader Celsius vannbad i to minutter før du legger en milliliter DMEM til cellene med mild blanding.Deretter legger cellene til en 150-millimeter diameter Petriskål som inneholder 15 milliliter på 36,5-graders Celsius medium, og legg parabolen i en cellekulturinkubator i 24 timer. Neste dag, erstatt supernatant med 15 milliliter frisk DMEM, og returnere cellene til inkubatoren. For å løsne cellene, lag kulturen med fire milliliter trypsin i fire minutter ved 36,5 grader Celsius og 5% karbondioksid, og stopp reaksjonen med friskt medium når cellene har løftet fra bunnen av parabolen.For å merke cellene, varm en passende cellefluorescensfargestoff til romtemperatur før du legger til 20 mikroliter vannfri dimetylsulfoksid til hetteglasset for å oppnå en ett millimolarløsning. Fortynn fluorescensen til en endelig arbeidskonsentrasjon av en mikromos i DMEM, og tilsett fargestoffet til cellefjæringen av interesse med mild blanding. Plasser deretter cellene i cellekulturinkubatoren i 20 minutter.For monokultur spheroid formasjon, først legge til 2,5 milliliter av 4% Pluronic F-127 løsning til innløpshullet av CMS kultur chip mens du roterer brikken på 500 til 1000 rotasjoner per minutt. Når all løsningen er lagt til, roterer du brikken ved 4000 rotasjoner per minutt i tre minutter ved hjelp av CMS-systemet. På slutten av rotasjonen inkubere kulturbrikken over natten på 36,5 grader Celsius ved 5% karbondioksid.Neste morgen, fjern Pluronic løsning, og vask kulturchip med DMEM. Etter tørking av brikken i 12 timer på en ren benk, legg til 2,5 milliliter av mediet til innløpsporten, og roter brikken ved 4000 rotasjoner per minutt i tre minutter. På slutten av rotasjonen erstatter du 100 mikroliter av mediet i innløpsporten med 100 mikroliter av den tilberedte cellesuspensjonen mens brikken roterer ved 500 til 1000 rotasjoner per minutt.Deretter roterer du brikken ved 3000 rotasjoner per minutt i tre minutter for å fange cellene i hver mikrobrønn ved sentrifugalkraft før du plasserer brikken i cellekulturinkubatoren i tre dager, forfriskende mediet som demonstrert hver dag. For generering av konsentrisk sfæroid kokultur, legg til den første populasjonen av celler i 100 mikroliter med middels til innløpsporten på brikken mens brikken roterer på 500 til 1000 rotasjoner per minutt etterfulgt av tre rotasjonsminutter ved 3000 rotasjoner per minutt. På slutten av rotasjonen legger du til 100 mikroliter av den andre cellepopulasjonen mens brikken roterer ved 500 til 1000 rotasjoner per minutt, og roterer brikken ved 3000 rotasjoner per minutt i ytterligere tre minutter.Når begge volumene av celler har blitt injisert, plasser brikken i cellekulturinkubatoren på 1000 til 2000 rotasjoner per minutt i 24 timer. For Janus sfæroidformasjonen, legg til 100 mikroliter av den første populasjonen av celler mens brikken roterer ved 500 til 1000 rotasjoner per minutt etterfulgt av tre minutter ved 3000 rotasjoner per minutt. På slutten av rotasjonen, plasser brikken i cellekulturinkubatoren for rotasjon ved 1000 til 2000 rotasjoner per minutt i tre timer.På slutten av inkubasjonen legger du til 100 mikroliter av den andre populasjonen av celler mens brikken roterer ved 500 til 1000 rotasjoner per minutt før du roterer brikken ved 3000 rotasjoner per minutt i tre minutter. Plasser deretter cellene i cellekulturinkubatoren på 1000 til 2000 rotasjoner per minutt i 24 timer. For sandwich sfæroid formasjon, først legge til 100 mikroliter av den første cellepopulasjonen mens brikken roterer på 500 til 1000 rotasjoner per minutt etterfulgt av tre minutter rotasjon på 3000 rotasjoner per minutt.På slutten av rotasjonen, plasser brikken på en rotator i cellekulturinkubatoren i to timer ved 1000 til 2000 rotasjoner per minutt før du legger til 100 mikroliter av den andre populasjonen av celler mens brikken roterer på 500 til 1000 rotasjoner per minutt. Roter brikken ved 3 000 o/min i tre minutter, og plasser brikken tilbake i inkubatoren for en tre timers inkubasjon med rotasjon. Deretter legger du til ytterligere 100 mikroliter av den første cellepopulasjonen mens brikken roterer ved 500 til 1000 rotasjoner per minutt, og roterer og kulturer cellene som nettopp demonstrert i 12 timer.Etter protokollen som demonstrert, kan en seks centimeter diameter CMS kulturbrikke med hell fabrikkeres. Kanalen til CMS kulturbrikken består av en innløpsport, og sentrale, lysbilde- og mikrobrønnområder. Time-lapse bilder av to typer cellekultur tatt på 2000 rotasjoner per minutt for de første 24 timene av kultur i individuelle CMS chips, som demonstrert, viser vellykket dannelse av sfæroider.Avbildning av mikrobrønnene etter tre dager med kultur viser at spheroidene viser en utmerket ensartethet og sfærisitet. Cocultured sfæroider med conentric, Janus, og sandwich strukturer kan også genereres. I tillegg viser cellekulturer utsatt for høy tyngdekraft i syv dager, etterfulgt av levende / døde flekker, at de fleste celler overlever langsiktig kultur i chips.De øverste og nederste lagene i CMS kulturbrikke bør være nøye justert når de er limt, ellers kan antall celler i hver mikrobrønn ikke være lik. Denne studien kan senke inngangsbarrieren for coculture spheroid forskning og kan brukes mye i coculture studier, for eksempel for screening nye legemidler av interesse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar og tredimensjonale Trykking av Conductive blekk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelig bruskvev Fabrication Bruke Tredimensjonal Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse av celle migrasjon innenfor en tre-dimensjonal Kollagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Utvikling av en Flercellede Tredimensjonal organotypiske Model of Human tarmslimhinnen Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensjonal epitelvev innebygd i ekstracellulær matriks

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrikasjon av invertert Kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Stillas: En Tredimensjonal Cell Culture plattform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Fabrikasjon av Tredimensjonal Papirbaserte mikrofluid Enheter for immunologiske

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...