Name: lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pelo Basic Science Research Program (2016R1D1A1B03934418) e pelo Programa de Desenvolvimento de Biotecnologia e Tecnologia Médica (2018M3A9H1023141) da NRF e financiado pelo governo coreano, MSIT.

1. Fabricação de chips de cultura microfluídica (CMS) de base microfluídica (CMS)
<ol><li>Faça moldes de PC para as camadas superior e inferior do chip de cultura CMS por usinagem CNC. Dimensões detalhadas do chip são dadas na Figura 1.</li>
	<li>Misture a base pdms e pdms agente de cura em uma proporção de 10:1 (w/ w) para 5 min e coloque em um desidratador para 1 h para remover bolhas de ar.</li>
	<li>Depois de derramar a mistura PDMS nos moldes do chip de cultura CMS, retire as...

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+Advantages+and+applications.">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array.">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li><li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroids+in+Cancer+Research.">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li><li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies.">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li><li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering.">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance.">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li><li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential.">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).</li><li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin.">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li><li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics.">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li><li>Park, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood.">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity.">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li><li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications.">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li><li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform.">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li><li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts.">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li><li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation.">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li></ol>

O CMS é um sistema fechado em que todas as células injetadas entram no micropoço sem resíduos, tornando-o mais eficiente e econômico do que os métodos convencionais de geração esferóide à base de microwell. No sistema CMS, a mídia é substituída a cada 12-24 h através de um buraco de sucção projetado para remover a mídia no chip (Figura 3A). Durante o processo de sucção da mídia, quase nenhuma mídia escapa de dentro do micropoço devido à tensão superficial entre a míd...

É mais fácil simular microambientes in vivo biológicos com cultura celular esferóide tridimensional (3D) do que com cultura celular bidimensional (2D) (por exemplo, cultura celular convencional da placa de Petri) produzir experimental fisiologicamente mais realista resultados1. Os métodos de formação esferóide atualmente disponíveis incluem a técnica de queda suspensa2,a técnica de sobreposição líquida3,a técnica de celulose carboxtil4,a técnica microfluídica baseada em força magnética5,e o uso de biorreatores6. Embora cada método tenha seus próprios benefícios, é necessária uma melhora adicional na reprodutibilidade, produtividade e geração de esferóides da cocultura. Por exemplo, enquanto a técnica microfluídica baseada em força magnética5 é relativamente barata, os efeitos de fortes campos magnéticos em células vivas devem ser cuidadosamente considerados. Os benefícios da cultura esferóide, particularmente no estudo da diferenciação e proliferação de células-tronco mesenchymal, têm sido relatados em vários estudos7,8,9.
O sistema microfluídico centrífuga, também conhecido como laboratório-em-um-CD (disco compacto), é útil para controlar facilmente o fluido dentro e explorar a rotação do substrato e, portanto, tem sido utilizado em aplicações biomédicas, como imunoensaios10, Ensaios colorimétricos para detectar marcadores bioquímicos11, ensaios de amplificação de ácido nucleico (PCR), sistemas automatizados de análise de sangue12e dispositivos microfluídicos centrífugas de todos emum 13. A força motriz que controla o fluido é a força centrípeta criada pela rotação. Além disso, várias funções de mistura, valving e divisão de amostras podem ser feitas simplesmente nesta única plataforma de CD. No entanto, em comparação com os métodos de análise bioquímica acima mencionados, houve menos ensaios aplicando plataformas de CD para células culturais, especialmente esferóides14.
Neste estudo, mostramos o desempenho do sistema de esferóides microfluídicos (CMS) de base microfluífuga por monocultura ou cocultura de células-tronco derivadas do adiposo humano (hASC) e fibroblastos pulmonares humanos (MRC-5). Este artigo descreve em detalhes a metodologia de pesquisa15do nosso grupo. Assim, a plataforma de cultura esferóide lab-on-a-CD pode ser facilmente reproduzida. Um sistema gerador cms compreendendo um chip de cultura CMS, um suporte de chip, um motor DC, uma montagem de motor, e uma plataforma rotativa, é apresentado. A montagem do motor é impressa em 3D com estireno butadiene acrilonitrile (ABS). O suporte de chip e a plataforma rotativa são CNC (controle numérico de computador) usinado com o PC (policarbonato). A velocidade de rotação do motor é controlada de 200 a 4.500 rpm codificando um algoritmo de PID (proporcional-integral-derivado) baseado na modulação da pulso-largura. Suas dimensões são de 100 mm x 100 mm x 150 mm e pesa 860 g, tornando mais fácil de manusear. Usando o sistema CMS, os esferóides podem ser gerados várias condições de gravidade de 1 x g a 521 x g,de modo que o estudo da promoção de diferenciação celular alta gravidade pode ser estendido de células 2D16,17 a 3D Spheroid. A cocultura de vários tipos de células também é uma tecnologia fundamental para efetivamente imitar o ambiente in vivo18. O sistema CMS pode facilmente gerar esferóides de monocultura, bem como esferóides de cocultura de vários tipos de estrutura (por exemplo, concêntricos, Janus e sanduíche). O sistema CMS pode ser utilizado não só em estudos esferóides simples, mas também em estudos organóides 3D, para considerar estruturas de órgãos humanos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1056px;" width="1056">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">3D printer</td>
			<td style="width:171px;">Cubicon</td>
			<td style="width:124px;">3DP-210F</td>
			<td style="width:416px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15240-062</td>
			<td>Contained 1% of completed medium and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Green CMFDA</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C2925</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C34552</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Computer numerical control (CNC) rotary engraver</td>
			<td style="width:171px;">Roland DGA</td>
			<td style="width:124px;">EGX-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DC motor</td>
			<td style="width:171px;">Nurielectricity Inc.</td>
			<td style="width:124px;">MB-4385E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s modified eaggle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2020</td>
			<td>Contained 10% of completed medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">human lung fibroblasts (MRC-5)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Inventor 2019</td>
			<td style="width:171px;">Autodesk</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td>3D computer-aided design program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Petri dish &#934; 150 mm</td>
			<td style="width:171px;">JetBiofill</td>
			<td style="width:124px;">CAD010150</td>
			<td>Surface Treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:171px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:124px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">11/6/9003</td>
			<td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polycarbonate (PC)</td>
			<td style="width:171px;">Acrylmall</td>
			<td style="width:124px;">AC15PC</td>
			<td>200 x 200 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:171px;">Dowcorning</td>
			<td style="width:124px;">Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids

Uma cultura tridimensional de células esferóides pode obter resultados mais úteis em experimentos celulares porque pode simular melhor microambientes celulares do corpo vivo do que a cultura celular bidimensional. Neste estudo, fabricamos uma plataforma elétrica de laboratório em um CD (disco compacto), chamada de sistema de cultura esferóide de base microfluídica (CMS), para criar esferóides de células tridimensionais (3D) implementando força centrífuga alta. Este dispositivo pode variar velocidades de rotação para gerar condições de gravidade de 1 x g a 521 x g. O sistema CMS tem 6 cm de diâmetro, tem cem 400 microwells μm, e é feito moldando com polidimetilsiloxano em um molde de policarbonato pré-feito por uma máquina de controle numérica de computador. Uma parede de barreira na entrada do canal do sistema CMS usa força centrífuga para espalhar as células uniformemente dentro do chip. No final do canal, há uma região de deslizamento que permite que as células entrem nos micropoços. Como demonstração, os esferóides foram gerados pela monocultura e pela cocultura de células-tronco derivadas do adiposo humano e dos fibroblastos pulmonares humanos em condições de alta gravidade usando o sistema. O sistema CMS usou um esquema de operação simples para produzir esferóides de cocultura de várias estruturas de concêntricos, Janus e sanduíche. O sistema CMS será útil em biologia celular e estudos de engenharia de tecidos que exigem esferóides e cultura organóide de tipos de células únicas ou múltiplas.

O chip de cultura CMS de 6 cm de diâmetro (Figura 2)foi feito com sucesso seguindo o protocolo acima. Primeiro, o chip foi feito separadamente de uma camada superior e uma camada inferior e, em seguida, ligado si por ligação plasmática. Esferóides resultantes podem ser facilmente reunidos, desanexando o chip. O canal do chip de cultura CMS compreende uma porta de inseto e regiões centrais, slide, e microwell (Figura 3). As soluções celular, média e plur...

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Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Apresentamos um dispositivo microfluídico centrífuga movido a motor que pode cultivar esferóides celulares. Usando este dispositivo, esferóides de tipos de células únicas ou múltiplas podem ser facilmente coculturados condições de alta gravidade.

Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Essa técnica pode ser usada para gerar esferoides celulares de tipos individuais e múltiplos de células usando uma plataforma lab-on-a-CD, um sistema pioneiro para a rápida geração de esferoides. A técnica utiliza força centrífuga para depositar células em microwells designadas, permitindo a euforia sequencial de vários tipos de células para a produção de diversos esferoides. Para a fabricação de chips de cultura CMS, primeiro faça moldes de policarbonato para as camadas superior e inferior do chip de cultura por usinagem de controle numérico de computador.Em seguida, misture a base PDMS e o agente de cura PDMS a uma proporção de 10 para um por cinco minutos antes de colocar a mistura em um desiccador por uma hora para remover bolhas de ar. Despeje a mistura PDMS desgaseada nos moldes de chip de cultura CMS e coloque os moldes no desiccator por mais uma hora para remover quaisquer bolhas de ar. No final do segundo desgaseamento, cure a mistura em uma câmara de calor a 80 graus Celsius por duas horas antes de colocar os chips em um aspirador de plasma aspirado com as superfícies a serem ligadas de frente para cima.Exponha os chips de cultura ao plasma assistido pelo ar a uma potência de 18 watts por 30 segundos, e ligue as duas camadas do chip na câmara de calor a 80 graus Celsius por 30 minutos para aumentar a força de adesão. Em seguida, esterilize o chip de cultura CMS em uma autoclave a 121 graus Celsius por 15 minutos. Para preparar as células para a formação de esferoides, descongele um frasco de um mililitro contendo cinco a dez vezes 10 às cinco células de interesse em um banho de água de 36,5 graus Celsius por dois minutos antes de adicionar um mililitro de DMEM às células com mistura suave.Em seguida, adicione as células a uma placa de Petri de 150 milímetros de diâmetro contendo 15 mililitros de 36,5 graus Celsius médio, e coloque o prato em uma incubadora de cultura celular por 24 horas. No dia seguinte, substitua o supernascedor por 15 mililitros de DMEM fresco, e devolva as células à incubadora. Para desprender as células, crie a cultura com quatro mililitros de trippsina por quatro minutos a 36,5 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, interrompendo a reação com meio fresco quando as células levantaram do fundo do prato.Para rotular as células, aqueça um corante de fluorescência celular apropriada à temperatura ambiente antes de adicionar 20 microliters de sulfóxido de dimetil anidro ao frasco para obter uma solução mililitro. Diluir a fluorescência a uma concentração final de trabalho de um micromolar em DMEM, e adicionar o corante à suspensão celular de interesse com mistura suave. Em seguida, coloque as células na incubadora de cultura celular por 20 minutos.Para a formação de esferoides monocultura, adicione primeiro 2,5 mililitros de solução F-127 plurônica de 4%plurônicos ao orifício de entrada do chip de cultura CMS enquanto gira o chip a 500 a 1.000 rotações por minuto. Quando toda a solução tiver sido adicionada, gire o chip a 4.000 rotações por minuto durante três minutos usando o sistema CMS. No final da rotação, incubar o chip de cultura durante a noite a 36,5 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono.Na manhã seguinte, remova a solução Pluronic e lave o chip de cultura com DMEM. Depois de secar o chip por 12 horas em um banco limpo, adicione 2,5 mililitros do meio à porta de entrada e gire o chip a 4.000 rotações por minuto durante três minutos. No final da rotação, substitua 100 microliters do meio na porta de entrada por 100 microliters da suspensão da célula preparada enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto.Em seguida, gire o chip a 3.000 rotações por minuto durante três minutos para prender as células em cada microwell por força centrífuga antes de colocar o chip na incubadora de cultura celular por três dias, refrescando o meio como demonstrado todos os dias. Para a geração de cocultura esferoide concêntrica, adicione a primeira população de células em 100 microliters de médio para a porta de entrada do chip enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto seguido de três minutos de rotação a 3.000 rotações por minuto. No final da rotação, adicione 100 microlitadores da segunda população celular enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto, e gire o chip a 3.000 rotações por minuto por mais três minutos.Quando ambos os volumes de células tiverem sido injetados, coloque o chip na incubadora de cultura celular em 1.000 a 2.000 rotações por minuto durante 24 horas. Para a formação de esferoides Janus, adicione 100 microlitadores da primeira população de células enquanto o chip está girando a 500 a 1.000 rotações por minuto seguido de três minutos a 3.000 rotações por minuto. No final da rotação, coloque o chip na incubadora de cultura celular para rotação em 1.000 a 2.000 rotações por minuto durante três horas.No final da incubação, adicione 100 microlitadores da segunda população de células, enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto antes de girar o chip a 3.000 rotações por minuto durante três minutos. Em seguida, coloque as células na incubadora de cultura celular em 1.000 a 2.000 rotações por minuto durante 24 horas. Para a formação de sanduíches esferoides, primeiro adicione 100 microliters da população da primeira célula, enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto seguido de três minutos de rotação a 3.000 rotações por minuto.No final da rotação, coloque o chip em uma rotadora na incubadora de cultura celular por duas horas a 1.000 a 2.000 rotações por minuto antes de adicionar 100 microliters da segunda população de células enquanto o chip está girando em 500 a 1.000 rotações por minuto. Gire o chip a 3.000 RPM por três minutos, e coloque o chip de volta na incubadora para uma incubação de três horas com rotação. Em seguida, adicione mais 100 microliters da primeira população celular, enquanto o chip gira em 500 a 1.000 rotações por minuto, e gire e cultue as células como apenas demonstrado por 12 horas.Seguindo o protocolo, como demonstrado, um chip de cultura CMS de seis centímetros de diâmetro pode ser fabricado com sucesso. O canal do chip de cultura CMS compreende um porto de entrada, e regiões centrais, deslizantes e microwell. Imagens de lapso de tempo de dois tipos de cultura celular tiradas a 2.000 rotações por minuto para as primeiras 24 horas de cultura dentro de chips CMS individuais, como demonstrado, mostram a formação bem sucedida de esferoides.Imagens dos microwells após três dias de cultura mostram que os esferoides demonstram uma excelente uniformidade e esfericidade. Esferoides coculturados com estruturas conentricas, janus e sanduíches também podem ser gerados. Além disso, culturas celulares expostas à alta gravidade por sete dias, seguidas por coloração viva/morta, demonstram que a maioria das células sobrevive à cultura de longo prazo dentro dos chips.As camadas superior e inferior do chip de cultura CMS devem ser cuidadosamente alinhadas quando estiverem ligadas, caso contrário, o número de células em cada microwell pode não ser igual. Este estudo pode diminuir a barreira de entrada para a pesquisa de esferoides de cocultura e pode ser amplamente utilizado em estudos de cocultura, por exemplo, para triagem de novos medicamentos de interesse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bioengenharia

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Hidrogéis alginato para Tridimensional Cultura Órgão de ovários e tubas uterinas

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Impressão de planar e tridimensional de tintas condutoras

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Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Análise da migração celular dentro de uma matriz de colagénio tridimensional

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabricação de Inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) Andaime: Uma Plataforma Cultura celular tridimensional para Liver Engenharia de Tecidos

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Fabricação de dispositivos microfluídicos tridimensional baseados em papel para imunoensaios

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...