Name: lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

Denna forskning stöddes av Basic Science Research program (2016R1D1A1B03934418) och bio & medicinsk teknik Development program (2018M3A9H1023141) av NRF, och finansieras av den koreanska regeringen, MSIT.

1. centrifugal microfluidic-baserade sfäroid (CMS) kultur chip Fabrication
<ol><li>Gör PC formar för de övre och nedre lagren av CMS kultur chip genom CNC-bearbetning. Detaljerade mått på chippet anges i figur 1.</li>
	<li>Blanda PDMS Base och PDMS härdning agent vid ett förhållande av 10:1 (w/w) för 5 min och placera i en exsickator för 1 h för att ta bort luftbubblor.</li>
	<li>Efter hälla PDMS blandningen i formar av CMS kultur chip, ta bort luftbubblor för 1 h mer och bot...

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+Advantages+and+applications.">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array.">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li><li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroids+in+Cancer+Research.">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li><li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies.">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li><li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering.">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance.">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li><li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential.">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).</li><li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin.">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li><li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics.">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li><li>Park, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood.">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity.">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li><li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications.">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li><li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform.">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li><li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts.">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li><li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation.">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li></ol>

CMS är ett slutet system där alla injicerade celler in i mikrobrunn utan avfall, vilket gör det mer effektivt och ekonomiskt än konventionella mikrobrunn-baserade sfäroid generation metoder. I CMS-systemet byts Media varje 12 – 24 h genom ett sughål som är utformat för att ta bort materialet i chippet (figur 3a). Under Media sug processen, knappt någon Media flyr inifrån mikrobrunn på grund av ytspänningen mellan media och väggen i mikrobrunn. En användare kan enkelt ta bort ...

Det är lättare att simulera biologiska in vivo mikromiljöer med tredimensionell (3D) sfäroid cellkultur än med två-dimensionell (2D) cellkultur (t. ex. konventionell petriskål cellkultur) för att producera mer fysiologiskt realistiska experimentella resultat1. För närvarande tillgängliga sfäroid formation metoder inkluderar hängande droppe teknik2, vätska-overlay teknik3, karboxymetyl cellulosa teknik4, magnetisk kraft-baserade mikroflödessystem teknik5, och användning av bioreaktorer6. Även om varje metod har sina egna fördelar, ytterligare förbättring av reproducerbarhet, produktivitet, och generera coculture spheroids är nödvändigt. Till exempel, medan den magnetiska kraft-baserade mikroflödessystem teknik5 är relativt billigt, effekterna av starka magnetfält på levande celler måste noga övervägas. Fördelarna med sfäroid kultur, särskilt i studiet av mesenkymala stamceller differentiering och proliferation, har rapporterats i flera studier7,8,9.
Den centrifugal mikroflödessystem system, även känd som Lab-on-a-CD (Compact Disc), är användbart för att enkelt kontrollera vätskan inuti och utnyttja rotation av substratet och har därmed utnyttjats i biomedicinska tillämpningar såsom immunanalyser10, kolorimetriska analyser för detektion av biokemiska markörer11, test av nukleinsyramplifiering (PCR), automatiserade blodanalys system12, och allt-i-ett centrifugalmikrofluidiska enheter13. Den drivande kraften som styr vätskan är den centripetala kraft som skapas genom rotation. Dessutom kan flera funktioner för blandning, valving, och prov uppdelning göras helt enkelt i denna enda CD-plattform. Jämfört med de ovan nämnda biokemiska analysmetoderna har det dock förekommit färre försök att använda CD-plattformar för att odla celler, särskilt spheroids14.
I denna studie visar vi prestanda för centrifugalmikrofluidic-baserade sfäroid (CMS) system genom monokultur eller samodling av mänskliga adipose härledda stamceller (hASC) och mänskliga lung fibroblaster (MRC-5). Denna uppsats beskriver i detalj vår grupps forskningsmetodik15. Således kan sfäroid Culture Lab-on-a-CD-plattformen enkelt återges. Ett CMS-system bestående av ett CMS-kulturchip, en chip-hållare, en likströmsmotor, ett motor fäste och en roterande plattform presenteras. Motor fästet är 3D-tryckt med akrylnitril-butadienstyren (ABS). Chip hållaren och roterande plattform är CNC (Computer numerisk kontroll) bearbetas med PC (polykarbonat). Motorns rotationshastighet styrs från 200 till 4 500 rpm genom kodning av en PID-algoritm (proportionell-integral-derivata) baserad på pulsbredd modulering. Dess mått är 100 mm x 100 mm x 150 mm och den väger 860 g, vilket gör den lätt att hantera. Använda CMS-systemet, spheroids kan genereras under olika gravitation villkor från 1 x g till 521 x g, så studiet av celldifferentiering befordran under hög gravitation kan förlängas från 2D-celler16,17 till 3D sfäroid. Samodling av olika typer av celler är också en viktig teknik för att effektivt imitera in vivo miljö18. CMS-systemet kan enkelt generera monokultur spheroids, liksom samodling spheroids av olika struktur typer (t. ex., Concentric, Janus, och Sandwich). CMS-systemet kan utnyttjas inte bara i enkla sfäroid studier utan även i 3D Organoid studier, att överväga mänskliga organ strukturer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1056px;" width="1056">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">3D printer</td>
			<td style="width:171px;">Cubicon</td>
			<td style="width:124px;">3DP-210F</td>
			<td style="width:416px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15240-062</td>
			<td>Contained 1% of completed medium and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Green CMFDA</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C2925</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">C34552</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Computer numerical control (CNC) rotary engraver</td>
			<td style="width:171px;">Roland DGA</td>
			<td style="width:124px;">EGX-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DC motor</td>
			<td style="width:171px;">Nurielectricity Inc.</td>
			<td style="width:124px;">MB-4385E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s modified eaggle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">30-2020</td>
			<td>Contained 10% of completed medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">human lung fibroblasts (MRC-5)</td>
			<td style="width:171px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Inventor 2019</td>
			<td style="width:171px;">Autodesk</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td>3D computer-aided design program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Petri dish &#934; 150 mm</td>
			<td style="width:171px;">JetBiofill</td>
			<td style="width:124px;">CAD010150</td>
			<td>Surface Treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:171px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:124px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">11/6/9003</td>
			<td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polycarbonate (PC)</td>
			<td style="width:171px;">Acrylmall</td>
			<td style="width:124px;">AC15PC</td>
			<td>200 x 200 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:171px;">Dowcorning</td>
			<td style="width:124px;">Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lab-on-a-cd platform for generating multicellular three-dimensional spheroids

En tredimensionell sfäroid cellkultur kan få mer användbara resultat i cell experiment eftersom det kan bättre simulera cell mikromiljöer i den levande kroppen än tvådimensionell cellkultur. I denna studie, vi fabricerade en elektrisk motor driven Lab-på-en-CD (Compact Disc) plattform, kallad en centrifugal microfluidic-baserade sfäroid (CMS) kultur system, att skapa tredimensionella (3D) cell spheroids genomföra hög centrifugalkraft. Denna enhet kan variera rotationshastigheter för att generera gravitation villkor från 1 x g till 521 x g. CMS-systemet är 6 cm i diameter, har 500 μm mikrobrunnar, och görs genom gjutning med Polydimetylsiloxan i en polykarbonat mögel premade av en dator numerisk kontroll maskin. En barriär vägg vid kanal ingången i CMS-systemet använder centrifugalkraft för att sprida celler jämnt inuti chipet. I slutet av kanalen finns en bild region som gör att cellerna kan komma in i mikrobrunnarna. Som en demonstration, spheroids genererades av monokultur och samodling av mänskliga adipose-härledda stamceller och mänskliga lung fibroblaster under hög gravitation villkor med hjälp av systemet. CMS-systemet används ett enkelt operativsystem för att producera coculture spheroids av olika strukturer av Concentric, Janus och Sandwich. CMS-systemet kommer att vara användbart i cellbiologi och vävnadstekniska studier som kräver spheroids och Organoid kultur av en eller flera celltyper.

Den 6 cm diameter CMS kultur chip (figur 2) gjordes framgångsrikt efter ovanstående protokoll. Först, chip gjordes separat från ett toppskikt och ett bottenskikt och sedan limmas samman av plasma bindning. Resulterande spheroids kan enkelt samlas in genom att lossa chippet. Kanalen för CMS-kulturchip består av en inloppsport och en central-, glid-och mikrobrunn-region (figur 3). Cell-, medium-och pluroniska lösningar injiceras genom ett inloppshål med en...

Watch this Scientific Journal Video about Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids at JoVE.com

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Vi presenterar en motordriven centrifugal mikroflödessystem enhet som kan odla cellspheroids. Med hjälp av denna enhet, spheroids av enstaka eller flera celltyper kan lätt coculodlas under hög gravitation villkor.

Lab-på-en-CD plattform för att generera Multicellulära tredimensionell spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Denna teknik kan användas för att generera cellsfäroider från enskilda och flera celltyper med hjälp av en lab-on-a-CD-plattform, ett banbrytande system för snabb generering av sfäroider. Tekniken använder centrifugalkraft för att deponera celler i utsedda mikrobrunnar, vilket gör att sekventiell upprymdhet av flera celltyper för produktion av olika sfäroider. För CMS kultur chip tillverkning, först göra polykarbonat formar för toppen och botten skikten av kulturen chip genom dator numeriska kontroll bearbetning.Nästa mix PDMS bas och PDMS härdningsmedel vid ett 10 till ett förhållande i fem minuter innan du placerar blandningen i en exsiccator i en timme för att avlägsna luftbubblor. Häll den avgasade PDMS blandningen i CMS kultur spånformar, och placera formar i exsiccator i ytterligare en timme för att ta bort eventuella luftbubblor. I slutet av den andra avgasningen, bota blandningen i en värmekammare vid 80 grader Celsius i två timmar innan du placerar spånorna i en dammsugare plasma renare med de ytor som skall bindas uppåt.Exponera kulturflisorna för luftassisterad plasma vid en effekt av 18 watt i 30 sekunder, och bind de två skikten av chipet i värmekammaren vid 80 grader Celsius i 30 minuter för att öka vidhäftningsstyrkan. Sterilisera sedan CMS-odlingschipet i en autoklav vid 121 grader Celsius i 15 minuter. För att förbereda cellerna för sfäroid bildning, tina en en-milliliter injektionsflaska som innehåller fem till 10 gånger 10 till de fem cellerna av intresse i en 36,5 grader Celsius vattenbad i två minuter innan du lägger en milliliter DMEM till cellerna med skonsam blandning.Nästa lägga till cellerna till en 150-millimeters diameter Petriskål som innehåller 15 milliliter av 36,5-graders-Celsius medium, och placera skålen i en cellkultur inkubator i 24 timmar. Nästa dag, ersätta supernatanten med 15 milliliter färsk DMEM, och återför cellerna till inkubatorn. För att ta bort cellerna, skapa kulturen med fyra milliliter trypsin i fyra minuter vid 36,5 grader Celsius och 5%koldioxid, stoppa reaktionen med färskt medium när cellerna har lyft från botten av skålen.För att märka cellerna, värm en lämplig cell fluorescens färgämne till rumstemperatur innan du lägger till 20 mikroliter av vattenfri dimetylsulfoxid till injektionsflaskan för att få en millimolarlösning. Späd fluorescensen till en slutlig arbetskoncentration av en mikromolar i DMEM, och tillsätt färgämnet till cellen suspension av intresse med skonsam blandning. Placera sedan cellerna i cellodlingsinkubatorn i 20 minuter.För monokultur sfäroidbildning, först lägga 2,5 milliliter av 4%Pluronic F-127 lösning till inloppshålet i CMS kultur chip samtidigt roterande chip på 500 till 1, 000 rotationer per minut. När hela lösningen har lagts till, roterar du chipet vid 4, 000 rotationer per minut i tre minuter med hjälp av CMS-systemet. I slutet av rotationen, inkubera kulturchip över natten på 36,5 grader Celsius på 5%koldioxid.Nästa morgon, ta bort Pluronic lösningen, och tvätta kulturen chip med DMEM. Efter torkning av chipet i 12 timmar på en ren bänk, tillsätt 2,5 milliliter av mediet till inloppsporten, och rotera chipet på 4, 000 rotationer per minut i tre minuter. Vid slutet av rotationen, byt ut 100 mikroliter av mediet i inloppsporten med 100 mikroliter av den förberedda cellupphängningen medan chipet roterar vid 500 till 1, 000 rotationer per minut.Rotera sedan chipet vid 3, 000 rotationer per minut i tre minuter för att fånga cellerna i varje mikrobrunn genom centrifugalkraft innan du placerar chipet i cellodlingsinkubatorn i tre dagar, vilket friskar upp mediet som visas varje dag. För generering av koncentrisk sfäroid kokultur, lägg till den första populationen av celler i 100 mikroliter medium till inloppsporten av chipet medan chipet roterar på 500 till 1, 000 rotationer per minut följt av tre minuters rotation vid 3, 000 rotationer per minut. I slutet av rotationen, lägga till 100 mikroliter av den andra cellpopulationen medan chipet roterar på 500 till 1, 000 rotationer per minut, och rotera chipet på 3, 000 rotationer per minut i ytterligare tre minuter.När båda volymerna av celler har injicerats, placera chipet i cellkulturinkubatorn på 1, 000 till 2, 000 rotationer per minut i 24 timmar. För Janus sfäroidbildning, tillsätt 100 mikroliter av den första populationen av celler medan chipet roterar på 500 till 1, 000 rotationer per minut följt av tre minuter vid 3, 000 rotationer per minut. I slutet av rotationen, placera chip i cellkulturen inkubator för rotation på 1, 000 till 2, 000 rotationer per minut i tre timmar.I slutet av inkubationen, tillsätt 100 mikroliter av den andra populationen av celler medan chipet roterar på 500 till 1, 000 rotationer per minut innan du roterar chipet vid 3, 000 rotationer per minut i tre minuter. Placera sedan cellerna i cellodlingsinkubatorn på 1, 000 till 2, 000 rotationer per minut i 24 timmar. För sandwich sfäroidbildning, först lägga till 100 mikroliter av den första cellen befolkningen medan chipet roterar på 500 till 1, 000 rotationer per minut följt av tre minuters rotation vid 3, 000 rotationer per minut.I slutet av rotationen, placera chipet på en rotator i cellkulturen inkubatorn i två timmar vid 1, 000 till 2, 000 rotationer per minut innan du lägger till 100 mikroliter av den andra populationen av celler medan chipet roterar på 500 till 1, 000 rotationer per minut. Rotera chipet vid 3, 000 RPM i tre minuter, och placera chipet tillbaka i inkubatorn för en tre timmars inkubation med rotation. Lägg sedan till ytterligare 100 mikroliter av den första cellpopulationen medan chipet roterar vid 500 till 1 000 rotationer per minut och roterar och odlar cellerna som just visats i 12 timmar.Efter protokollet som visat, en sex centimeter diameter CMS kultur chip kan framgångsrikt fabriceras. Kanalen för CMS kultur chip består av en inloppsport, och centrala, slide och microwell regioner. Time-lapse bilder av två typer av cellkultur tas vid 2, 000 rotationer per minut för de första 24 timmarna av kultur inom enskilda CMS-chips, som visat, visar den framgångsrika bildandet av sfäroider.Avbildning av mikrobrunnarna efter tre dagar av kultur visar att sfäroiderna visar en utmärkt enhetlighet och sfärikitet. Kokulturerade sfäroider med konentrisk, Janus, och sandwich strukturer kan också genereras. Dessutom visar cellkulturer som exponerats för hög gravitation i sju dagar, följt av levande/ död färgning, att de flesta celler överlever långsiktig kultur inom chipsen.De översta och nedre skikten på CMS-odlingschipet bör vara noggrant i linje när de är bundna, annars kan antalet celler i varje mikrobrunn inte vara lika. Denna studie kan sänka inträdesbarriären för kokultur sfäroid forskning och kan användas i stor utsträckning i kokultur studier, till exempel för screening nya läkemedel av intresse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tredimensionell optisk upplösning photoacoustic Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Alginat Hydrogeler för tredimensionella Organ Kultur äggstockarna och äggledarna

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Plana och tredimensionella Tryckning av ledande bläck

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human Brosk Tissue Fabrication Använda Tredimensionell Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analys av Cell Migration inom en tredimensionell kollagenmatris

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Utveckling av en multicellulär Tredimensionell Organotypiska modell av det mänskliga tarmslemhinnan odlade under mikrogravitation

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensionella epitelvävnader Embedded inom extracellulär matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Tillverkning av Inverted kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Scaffold: En tredimensionell cellkultur plattform för levervävnad Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Tillverkning av Tredimensionell Pappersbaserade Mikrofluidikanordningar för Immun

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...