Name: transduction and expansion of primary t cells in nine days with maintenance of central memory phenotype
Uploaded: 2020-03-18T13:00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل المنح المعاهد القومية للصحة 5R01AI096966-06S1 (PS، EC، وEB)، 1UM1AI26617 (PS، EC و EB)، P51OD0111106/P51RR0000167 (ER)، MN REACH منحة 5U01HL127479-03 (PS)، 1R01A143380-01 (PS و EB)، 1UM14126617 (PS وEC) وكذلك الأموال المقدمة من شعبة NIAID للبحوث داخل الجداريات وبرنامج مكافحة الفيروسات المضادة للفيروسات المضادة للفيروسات الهوائية تم توفير مضاد CD3 ومكافحة CD28 المستخدمة في هذه الدراسات من قبل الموارد الكاشفة الرئيسيات غير البشرية المعاهد القومية للصحة (R24 OD010976, U24 AI126683). IL-2 المستخدمة في هذه الدراسات تم توفيرها من قبل مستودع ما قبل السريرية NCI. نشكر المتعاونين معنا في هذا المشروع CD4-MBL CAR/CXCR5، والدكتورة إليزابيث كونيك في جامعة أريزونا، والدكتور إدوارد أ بيرغر في NIAID، المعاهد القومية للصحة، والدكتورة إيفا جي راكاز في مركز ويسكونسن الوطني لأبحاث الرئيسيات والدكتور جيف هارت والسيدة بريتي هاران في جامعة مينيسوتا، والدكتورة ليزلي كين في كلية الطب بجامعة هارفارد والدكتورة كاثرين بولارد في معهد أبحاث الأطفال. كما نشكر الدكتور سكوت ماكيفور في جامعة مينيسوتا، والدكتور كريستوفر بيترسون في مركز فريد هاتشينسون للسرطان، والدكتور ماثيو تريفيت في المعاهد القومية للصحة، والدكتورة أغني تاراسيفيكوت في مستشفى سياتل للأطفال، والدكتور كونراد راسل كروز في معهد أبحاث الأطفال على مساعدتهم المفيدة للغاية في تحسين هذا البروتوكول. كما نعرب عن امتناننا للسيدة تشي فان والسيدة جهوماري أليغريا - بيروكال في جامعة مينيسوتا لإنتاج فيروس غاماريتريا، والسيدة كيم ويسغراو في جامعة ويسكونسن - ماديسون لعزلها محطة بناء السلام في الجمهورية.

<ol>
	<li>Klebanoff, C. A., Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+for+gene-engineered+T+cell+immunotherapy+for+solid+cancers.">Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers.</a> Nature Medicine. 22 (1), 26-36 (2016).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Sadelain, M., Rivi&#232;re, I., Riddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+T+cell+engineering.">Therapeutic T cell engineering.</a> Nature. 545 (7655), 423-431 (2017).</li><li>Kuhlmann, A., Peterson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T-cell+approaches+to+HIV+cure.">Chimeric antigen receptor T-cell approaches to HIV cure.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 13 (5), 446-453 (2018).</li><li>Ghanem, M. H., Bolivar-Wagers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+chimeric+antigen+receptors+targeting+the+CD4+binding+site+and+high-mannose+Glycans+of+gp120+optimized+for+anti-human+immunodeficiency+virus+potency+and+breadth+with+minimal+immunogenicity.">Bispecific chimeric antigen receptors targeting the CD4 binding site and high-mannose Glycans of gp120 optimized for anti-human immunodeficiency virus potency and breadth with minimal immunogenicity.</a> Cytotherapy. 20, 407-419 (2018).</li><li>Folkvord, J. M., Armon, C., Connick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+Follicles+Are+Sites+of+Heightened+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+(HIV-1)+Replication+and+Reduced+Antiretroviral+Effector+Mechanisms.">Lymphoid Follicles Are Sites of Heightened Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Replication and Reduced Antiretroviral Effector Mechanisms.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. , (2005).</li><li>Connick, E., Mattila, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTL+Fail+to+Accumulate+at+Sites+of+HIV-1+Replication+in+Lymphoid+Tissue.">CTL Fail to Accumulate at Sites of HIV-1 Replication in Lymphoid Tissue.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 6975-6983 (2007).</li><li>Connick, E., Folkvord, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Simian+Immunodeficiency+Virus+Replication+within+Secondary+Lymphoid+Tissues+of+Rhesus+Macaques+Is+Linked+to+Disease+Stage+and+Inversely+Related+to+Localization+of+Virus-Specific+CTL.">Compartmentalization of Simian Immunodeficiency Virus Replication within Secondary Lymphoid Tissues of Rhesus Macaques Is Linked to Disease Stage and Inversely Related to Localization of Virus-Specific CTL.</a> The Journal of Immunology. 193 (11), 5613-5625 (2014).</li><li>Haran, K. P., Hajduczki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simian+immunodeficiency+virus+(SIV)-specific+chimeric+antigen+receptor-T+cells+engineered+to+target+B+cell+follicles+and+suppress+SIV+replication.">Simian immunodeficiency virus (SIV)-specific chimeric antigen receptor-T cells engineered to target B cell follicles and suppress SIV replication.</a> Frontiers in Immunology. 9 (MAR), 1-12 (2018).</li><li>Ayala, V. I., Deleage, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR5-Dependent+Entry+of+CD8+T+Cells+into+Rhesus+Macaque+B-Cell+Follicles+Achieved+through+T-Cell+Engineering.">CXCR5-Dependent Entry of CD8 T Cells into Rhesus Macaque B-Cell Follicles Achieved through T-Cell Engineering.</a> Journal of Virology. 91 (11), e02507-e02516 (2017).</li><li>Redeker, A., Arens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+adoptive+T+cell+therapy:+The+particular+role+of+T+cell+costimulation,+cytokines,+and+post-transfer+vaccination.">Improving adoptive T cell therapy: The particular role of T cell costimulation, cytokines, and post-transfer vaccination.</a> Frontiers in Immunology. 7 (SEP), 1-17 (2016).</li><li>Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+Through+Subsets.">Sorting Through Subsets.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).</li><li>Ghassemi, S., Nunez-Cruz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Minang, J. T., Trivett, M. T., Bolton, D. L., Trubey, C. M., Estes, J. D., Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Adoptively+Transferred+Central+and+Effector+Memory-Derived+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+in+Rhesus+Macaques+during+Acute+Infection.">Efficacy of Adoptively Transferred Central and Effector Memory-Derived Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones in Rhesus Macaques during Acute Infection.</a> The Journal of Immunology. 184 (1), 315-326 (2010).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+persistence,+and+activation+state+of+adoptively+transferred+allogeneic+and+autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-specific+CD8(+)+T+cell+clones+during+acute+and+chronic+infection+of+rhesus+macaques.">Trafficking, persistence, and activation state of adoptively transferred allogeneic and autologous Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8(+) T cell clones during acute and chronic infection of rhesus macaques.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). 184 (1), 303-314 (2010).</li><li>Patel, S., Jones, R. B., Nixon, D. F., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapies+for+HIV+:+Preclinical+successes+and+current+clinical+strategies.">T-cell therapies for HIV : Preclinical successes and current clinical strategies.</a> Cytotherapy. 18 (8), 931-942 (2019).</li><li>Chambers, C. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costimulatory+regulation+of+T+cell+function.">Costimulatory regulation of T cell function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 11 (2), 203-210 (1999).</li><li>Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culture+model+for+T+lymphocyte+clonal+anergy.">A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy.</a> Science. 248 (4961), 1349-1356 (1990).</li><li>Bajgain, P., Mucharla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+production+of+suspension+cells+using+the+G-Rex+M+series.">Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex M series.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 1, 14015 (2014).</li><li>Pampusch, M. S., Haran, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+transduction+and+expansion+of+transduced+T+cells+with+maintenance+of+central+memory+populations.">Rapid transduction and expansion of transduced T cells with maintenance of central memory populations.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 16, 1-10 (2019).</li><li>Taraseviciute, A., Tkachev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cell-mediated+neurotoxicity+in+nonhuman+primates.">Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates.</a> Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).</li><li>Berger, C., Sommermeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+targeting+ROR1+in+primates+with+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells.">Safety of targeting ROR1 in primates with chimeric antigen receptor-modified T cells.</a> Cancer Immunology Research. 3 (2), 206-216 (2015).</li></ol>

الدكتورة باميلا سكينر هي المؤسس المشارك وكبير المسؤولين العلميين في ماربام فارما.

هذا البروتوكول يحدد استراتيجية إنتاج العلاج المناعي الخلايا تي الذي يستخدم ناقل جاماريتروفيروسات إلى transduce rhesus المكاك PBMC مما يؤدي إلى مجموعة الخلايا T التي تعبر عن CAR المضادة للفيروسات وكذلك مستقبلات توجيه الجريبية، CXCR5. مع ما مجموعه 8 أيام من وقت ثقافة الجسم الحي السابق ، يتم إنتاج خلايا T CAR القابلة للحياة والوظيفية في كمية تقع ضمن النطاق المنشور10،21،22 المستخدمة للضخ في الرئيسيات غير البشرية لاختبار الفعالية قبل السريرية.
ويعتمد نجاح بروتوكول النقل على كل من مركبات PBMCs الصحية والمحفزة وعلى المستحضرات الجيدة لفيروس غاماريترو. من أجل تحقيق التحفيز الناجح والنقل ، من الضروري أن يتم توخي الحذر المناسب في تجميد ونقل PBMCs بعد جمعها. من الناحية المثالية ، إذا تم جمع الخلايا خارج الموقع ، يتم شحنها في النيتروجين السائل ووضعها بسرعة في تخزين النيتروجين السائل على المدى الطويل. يجب أن تكون مركبات PBMCs نشطة mitotically من أجل أن يتم نقلها بنجاح بواسطة فيروس غاماريترية. يجب على المرء رصد بصريا لتجميع الخلايا بعد التحفيز مع مكافحة CD3/anti-CD28. الفشل في تنشيط بشكل صحيح سوف يسبب انخفاض كفاءة نقل. من المهم أيضًا مراقبة قابلية البقاء في الخلايا المحفزة. ضعف الجدوى بعد خطوة التحفيز عادة ما يؤدي إلى نقل أقل نجاحا. سواء تم إنتاج مستحضرات الفيروس في المختبر أو الاستعانة بمصادر خارجية ، يجب تخزينها عند -80 درجة مئوية في aliquots استخدام واحد لتجنب تجميد دورات ذوبان الجليد التي يمكن أن تلحق الضرر بالفيروس وإضعاف كفاءة النقل. يجب أن يكون الفيروس titered بحيث يمكن استخدام كميات متسقة من الفيروس في كل تجربة. عند استخدام الفيروس لنقل، إذابة الفيروس بسرعة وتخزينها على الجليد حتى الحاجة. اختيار البروتينات المروج، محسن ومغلف قد تؤثر جميع كفاءة نقل وتعبير عن transgene في الخلايا المستهدفة. وبالتالي، يجب تحديد وزارة الداخلية تجريبياً. وبالإضافة إلى ذلك، أدى استخدام وسائط مصممة لدعم الخلايا التائية والصحون ذات الآبار القابلة للنفاذ بالغاز للتوسع إلى توسع ممتاز في الخلايا المنقولة. ومع ذلك ، هناك تقلب بين الحيوان والحيوان في معدل توسع الخلية. نوصي بإجراء دراسة تجريبية لتحديد قدرة إعداد خلية معينة على أن يتم نقلها وتوسيعها. ومستويات التوسع متسقة في كل من عمليات النقل الصغيرة والكبيرة النطاق.
مع استخدام هذا البروتوكول، أنتجنا ما يصل إلى 2.5 × 109 خلايا للضخ في اختبار الحيوانات. على الرغم من أننا وجدنا أنه من غير الضروري توسيع نطاق البروتوكول في هذا الوقت ، فإن استخدام 6 لوحات بئر هو قيد على إعداد الخلايا على نطاق واسع وسيتطلب البروتوكول تعديلًا لإنتاج أعداد أكبر من الخلايا. ومن الأمثلة على التعديلات المحتملة تنفيذ النقل في كيس ثقافة مغلف بالليفية لزيادة عدد الخلايا المنقولة واستخدام وعاء أكبر لثقافة الغاز القابلة للنفاذ ية لخطوة التوسع. وعلى الرغم من أننا لم نُحَب َ بعد هذه التعديلات، فإنها تستخدم منتجات متاحة تجارياً، وهي تعديلات قابلة للتنفيذ على البروتوكول الحالي.
وباستخدام هذه الطريقة، قمنا بإنتاج خلايا مرسلة من PBMC معزولة عن الحيوانات غير المصابة، والحيوانات المصابة بسيف ومن الحيوانات المصابة بسيف التي تعالج بالعلاج المضاد للفيروسات القهقرية. ومع ذلك ، لاحظنا انخفاضًا في كفاءة النقل في الخلايا المعالجة بمضادات الفيروسات القهقرية20. ومن المفترض أن هذا الانخفاض يرجع إلى تثبيط النسخ العكسي و / أو integrase من المخدرات. وستتطلب عمليات نقل الخلايا من الحيوانات المعالجة بمضادات الفيروسات القهقرية إدخال تعديلات على هذا البروتوكول مثل خفض المستويات داخل الخلايا من عقاقير العلاج المضاد للفيروسات القهقرية عن طريق وقف العلاج المضاد للفيروسات القهقرية لعدة أيام قبل جمع PBMC أو من خلال استخدام ناقل بديل لا يتأثر بأدوية ART المستخدمة عادة.
من المهم أن تكون الخلايا المنتجة للعلاج المناعي ذات النمط الظاهري المتمايز الحد الأدنى بحيث تستمر بعد التسريب12. على الرغم من أن العديد من البروتوكولات لنقل الخلايا بالتبني تتطلب أوقات ثقافة طويلة، فقد تم ربط انخفاض وقت ثقافة الجسم الحي مع كل من انخفاض في التمايز وتحسين في وظيفة خلية T CAR13. الإطار الزمني السريع نسبيا لهذا بروتوكول النقل والتوسع يسمح بالحفاظ على النمط الظاهري للذاكرة المركزية المطلوبة في حين لا يزال إنتاج خلايا كافية لاختبار إمكاناتها المناعية20.
الهدف من استراتيجية الإنتاج لهذا المنتج العلاج المناعي الخلايا تي هو تصنيع الخلايا التائية التي سوف تعترف الخلايا المصابة SIV، وسوف المرور إلى موقع النسخ المتماثل الفيروسي في بصيلات B وسوف تستمر في الحيوان مما أدى إلى على المدى الطويل علاج وظيفي دون الحاجة إلى الأدوية المضادة للفيروسات الرجعية. للترجمة إلى منتج العلاج المناعي البشري ، يمكن تعديل هذا البروتوكول إلى خلايا T ية بشرية من خلال استخدام الأجسام المضادة والسيتوكينات الخاصة بالإنسان وتنفيذ معايير GMP بهدف نهائي هو إنتاج علاج وظيفي لـ فيروس نقص المناعه البشريه.

تظهر العلاجات المناعية الخلوية كوسيلة جديدة لعلاج الأمراض بما في ذلك السرطانات والأمراض المعدية. غالبًا ما تنطوي طرق العلاج المناعي هذه على التلاعب الجيني بالخلايا العلاجية للتعبير عن جزيئات محددة. على سبيل المثال، تم تصميم مستقبلات مستضد الكيميري (CAR) الخلايا التائية للتعبير عن جزيء CAR الذي يحتوي على مجال خارج الخلية يربط على وجه التحديد الجزيئات على الخلايا المريضة ومجال الإشارات الذي يحفز الخلايا المناعية لقتل الخلية المريضة. يتم استخدام خلايا CAR T بنجاح في العلاجات المناعية للسرطان ، وكانت فعالة بشكل خاص في علاج سرطان الدم ب الخلية1،2،3. كما يجري تطوير خلايا CAR-T لعلاج العدوى الفيروسية مثل فيروس نقص المناعة البشرية. CARs فيروس نقص المناعة البشرية تستهدف البروتينات المغلف على سطح الخلايا المصابة فيروسيا4. كما يمكن تصميم الخلايا المناعية للتعبير عن جزيئات التوجيه لاستهداف الخلايا العلاجية إلى مواقع محددة من الأنسجة. لقد طورنا ناقلات نقل كل من CAR الخاصة بالفيروسات وكذلك جزيء توجيه الجريب اللمفاوي CXCR55.
ويتركز النسخ المتماثل الفيروسي لبعض الفيروسات، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) وفيروس نقص المناعة السيميان (SIV)، داخل بصيلات الخلايا B في الأنسجة اللمفاوية الثانوية6. بصيلات الخلايا B هي مواقع محصنة مميزة إلى حد ما تسمح فيها مستويات منخفضة من CTL الخاصة بالفيروسات بتكرار الفيروسيةالمستمرة 7,8. لهذه الأسباب، استهداف فيروس نقص المناعة البشرية / SIV الخلايا التائية الخاصة في المسام من خلال التعبير عن CXCR5 هو استراتيجية للقضاء على خزان الجريب من الخلايا المصابةفيروسي9,10. على وجه التحديد، نحن نستهدف خلايا CAR T الخاصة بـ SIV إلى بصيلات الخلايا B عبر التعبير المشترك CXCR5.
في هذا البروتوكول نصف طريقة لtransduce CAR/CXCR5 وتوسيع PBMCs لإنتاج CAR/CXCR5 T خلايا من كميات كافية للضخ العلاجي. الخلايا المستحثة مع هذه الأساليب الحفاظ على النمط الظاهري الذاكرة المركزية. وقد أظهرت الدراسات أن الخلايا ذات النمط الظاهري أقل تميّزا, مثل الخلايا التائية الذاكرة المركزية والخلايا الجذعية الذاكرة T أفضل من الخلايا أكثر تمايز111,,12. بالإضافة إلى ذلك، العديد من البروتوكولات المصممة لإنتاج الخلايا المنقولة بالتبني لها أوقات ثقافة طويلة نسبياً تؤدي إلى خلايا لديها نمط ظاهري أكثر تمايزًا وتقليل الثبات13. وعلاوة على ذلك، الخلايا المنقولة بالتبني مع أوقات الثقافة الطويلة المتراكمة داخل الرئتين بدلا من الأنسجة اللمفاوية المستهدفة في المكاك ريسوس14,15. في الطرق التي نصفها ونشرح هنا، ونحن بسرعة transduce وتوسيع rhesus المكاك PBMCs لإنتاج الخلايا التائية المستحثة التي تحافظ على النمط الظاهري الذاكرة المركزية.
يتم تضمين كل من خلايا CD4 و CD8 T في نهج العلاج المناعي لدينا. تم اختيار هذه الخلايا المختلطة لأنه، في التجارب السريرية، كان هناك ارتباط غياب خلايا CD4+ T في منتج الخلايا T CD8+ مع فشل خلايا CD8 T المشبعة لتستمر 16. الطرق الموصوفة هنا تبدأ بتفعيل PBMCs مع الأجسام المضادة لمكافحة CD3 والمضادة CD28 التي تحفز بقوة مستقبلات الخلايا T وتوفر إشارة تحفيزية للمشترك لتجنب الأنجي ة البرسيم17,18.
بعد التنشيط، يتم نقل الخلايا مع ناقل جاماريتروفيروسات ترميز سيارة خاصة بفيروس وجزيء توجيه اللمفاويCXCR5. ثم يتم توسيع الخلايا المستحثة باستخدام لوحات مصممة لنشر الخلايا غير الملتصقة التي تحتوي على غشاء نفاذي للغاز في القاعدة. يسمح هذا الغشاء تبادل الغاز في الجزء السفلي من البئر مما يؤدي إلى تعزيز بقاء الخلايا وتوافر المغذيات19. باستخدام هذه الأساليب، يمكن إنتاج خلايا وظيفية كافية في إطار زمني لمدة 9 أيام لدراسات التسريب في الجسم الحي. في حين تم تصميم هذا البروتوكول لنقل وتوسيع خلايا rhesus المكاك T، مع تعديل طفيف من الأجسام المضادة تفعيل الأنواع محددة، ويمكن استخدامه مع خلايا من الأنواع الأخرى. وتستند هذه الأساليب على دراساتنا المنشورة سابقا9،20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gammaretrovirus preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.025% Trypsin, 0.01% EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates, treated</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>Sh30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985070</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBS-CMV-gagpol</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35614</td>
			<td>A gift from Dr. Patrick Salmon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5</td>
			<td>custom order from GenScript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RD114</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Dr. Ed Berger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G</td>
			<td></td>
			<td>pMD.G</td>
			<td>A gift from Dr. Scott McIvor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T cell stimulation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates, untreated</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD28</td>
			<td>NHP Reagent Resource</td>
			<td>Clone: CD28.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-macaque CD3</td>
			<td>NHP Reagent Resource</td>
			<td>Clone: FN18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells</td>
			<td>WNPRC</td>
			<td></td>
			<td>Primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Fibronectin coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates, untreated</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Fraction V)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH 30574.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin (1 mg/ml)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For T cell Expansion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-Rex 6 Well Plate</td>
			<td>Wilson Wolf</td>
			<td>P/N 80240M</td>
			<td>Plates with gas permeable wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>Sh30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>NCI Preclinical Repository</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Vivo-15 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variations of Media used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic medium:</td>
			<td>X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion medium:</td>
			<td>Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth medium:</td>
			<td>Basic medium + 50 IU/ml IL-2</td>
			<td></td>
			<td>Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chambers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20186</td>
			<td>for conjugation of MBL antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD28-BV605</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3-AF700</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8-BV788</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD95-PerCP Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CXCR5-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-1985-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MBL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-40145-S6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Analysis software</td>
			<td>FlowJo, LLC</td>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Near IR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosolve canisters to contain aerosol leakage</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>SX4750</td>
			<td>Safety equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Allegra Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Sterilgard e3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Everlast 247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Laminar flow hood</td>
			<td>Baker</td>
			<td>Heracell Vios 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-Safe Disposable lab coat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>359232</td>
			<td>Personal protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate carriers with biocertified covers</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td>Safety equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>X13-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gen Nitrile gloves</td>
			<td>Genesee</td>
			<td></td>
			<td>Personal protective equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transduction and expansion of primary t cells in nine days with maintenance of central memory phenotype

غالبًا ما تنطوي العلاجات المناعية الناشئة لعلاج الأمراض المعدية والسرطانات على نقل مجموعات الخلايا مع ترميز البروتينات التي تستهدف الأمراض. على سبيل المثال، مستقبلات مستضد الايميريك (CAR)-T الخلايا لعلاج السرطانات والالتهابات الفيروسية تنطوي على نقل الخلايا التائية مع الجينات الاصطناعية ترميز جزيئات CAR. جزيئات جمهورية أفريقيا الوسطى جعل الخلايا التائية التعرف على وجه التحديد وقتل السرطان أو الخلايا المصابة فيروسي. كما يمكن أن تكون الخلايا مُنقلة مع جينات أخرى ذات أهمية. على سبيل المثال، يمكن أن يتم نقل الخلايا مع الجينات ترميز البروتينات التي تستهدف الخلايا إلى مواقع محددة. هنا، نقدم بروتوكولاً لتبديل الخلايا النووية الأحادية الدم الطرفية الأولية (PBMCs) مع جينات ترميز CAR خاصة بالفيروسات وبصيلات الخلايا B توجيه جزيء chemokine مستقبلات الكيماوي5 (CXCR5). يستغرق هذا الإجراء تسعة أيام ويؤدي إلى مجموعات خلايا T المستحثة التي تحافظ على النمط الظاهري للذاكرة المركزية. وقد ثبت الحفاظ على ذاكرة مركزية أو أقل تميز ًا في النمط الظاهري للاقتران باستمرار الخلايا بعد التسريب. وعلاوة على ذلك، تظهر الخلايا المنتجة بهذه الطريقة مستويات عالية من الجدوى، ومستويات عالية من التعبير المشترك للجينين المستحثين، وكميات كبيرة بما يكفي من الخلايا للضخ المناعي. يمكن استخدام هذا البروتوكول لمدة تسعة أيام على نطاق واسع لخلية CAR-T وغيرها من أساليب العلاج المناعي للخلايا T. وتستند الأساليب الموصوفة هنا إلى الدراسات المقدمة في منشوراتنا السابقة.

إنتاج الخلايا النتائج المعروضة في هذا المنشور مماثلة لتلك الموجودة في عملنا المنشور سابقا9،20. باستخدام البروتوكول المعروض هنا، نتوقع على الأقل توسعًا 8 أضعاف للخلايا بين اليومين 5 و9 (متوسط 11.1 أضعاف، نطاق 8.7-13 أضعاف). تم بذر الآبار القابلة للنفاذ بالغاز بكثافة بدء 5 × 106 خلايا وبعد 4 أيام من النمو ، حققنا كثافة متوسطة قدرها 55.6 × 106 خلايا لكل بئر (النطاق 43.5-64.8 × 106)(الشكل 1A). يظهر عد الخلايا مع استبعاد تريبان بلو أن الخلايا تحافظ على صلاحية عالية طوال البروتوكول (اليوم 9 متوسط 85.8٪، نطاق 83-95٪). (الشكل1ب). نجد تقلب الحيوان إلى الحيوان في قدرة الخلايا على التوسع. ومع ذلك، مع عدد السكان بدءا من 50-100 × 106 خلايا في اليوم 1، وقد استخدمنا هذا البروتوكول لإنتاج خلايا كافية لضخ المكاك ريسوس من 1-2 × 108 خلايا / كجم.
تم رصد التعبير المشترك للجينات المستحثة مع قياس الخلايا التدفق(الشكل 2A). وكان التعبير عن جمهورية أفريقيا الوسطى وCXCR5 على سطح الخلايا المستحثة مستقرا نسبيا بين اليومين 5 و 9 من بروتوكول التوسع هذا. في اليوم الخامس، يبلغ متوسط 42.8% (يتراوح بين 36.5 و46.9%) من الخلايا تم نقلها مع كل من CD4-MBL CAR و CXCR5 بينما في اليوم 9، كان متوسط التعبير 47.6٪ (النطاق 44.5-64.5٪ ) مع جولة واحدة من نقل(الشكل 2B). على الرغم من أن بعض البروتوكولات تدعو إلى جولة ثانية من النقل، لم نر فائدة من حيث مجموع الخلايا المنقولة في نهاية البروتوكول (البيانات غير مبينة).
النمط الظاهري للخلية تم تحليل الخلايا المستحثة عن طريق قياس التدفق الخلوي لمراقبة النمط الظاهري للذاكرة. قبل نقل وتوسيع، يتم تحديد السذاجة، والذاكرة المركزية وتجمعات الذاكرة effector (البيانات غير مبين) ولكن يتم فقدان السكان السذج مع زراعة والخلايا هي في المقام الأول خلايا الذاكرة المركزية بحلول اليوم 5(الشكل 3A)واليوم 9(الشكل 3B)كما تم تحديدها من قبل CD95+ CD28+ التعبير. وقد أنتج استخدام هذا البروتوكول السريع للنقل والتوسع خلايا هي في المقام الأول خلايا الذاكرة المركزية، وبالتالي سيكون من المرجح أن تتكاثر وتستمر عندما غرست في الحيوان اختبار.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig01.jpg"> الشكل 1: ينتج بروتوكول النقل والتوسع خلايا مُستورَعة وفيرة قابلة للتطبيق بدرجة كبيرة. (أ)توسع الخلايا المستحثة من 6 أنواع مختلفة من الأيام 5 إلى 9 في السفن القابلة للنفاذ ية للغاز و(B)صلاحية PBMC المستحثة من نفس 6 الحيوانات. تم استخدام استبعاد Trypan الأزرق باستخدام عداد الخلية الآلي لمراقبة رقم الخلية وقابليتها للاستمرار. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig01large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig02.jpg"> الشكل 2: ينتج بروتوكول النقل خلايا تحافظ على التعبير المشترك عن الجينات المنقولة. (أ)مؤامرة تدفق تمثيلية من rhesus PBMC في اليوم 9 من بروتوكول النقل والتوسع مما يدل على التعبير عن كل من CD4-MBL CAR و CXCR5. (ب)التعبير عن CD4-MBL CAR و CXCR5 على rhesus PBMC المستحثة من 6 الحيوانات المختلفة في الأيام 5 و 9 في الثقافة كما تقاس بتدفق قياس الخلايا. تم تعيين غيتس على الهواء مباشرة، CD3+ الخلايا. يتم تعريف الخلايا المستحثة على أنها MBL+ CXCR5+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig02large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig03.jpg"> الشكل 3: غالبية الخلايا المنتجة في بروتوكول 9 أيام لها نمط فينوموياً مركزي الذاكرة. مؤامرة التدفق التمثيلي للقياس الخلوي من (A) اليوم 5 و(B)اليوم 9 CAR / CXCR5 - المنقولة ريسوس PBMC. تم تعيين غيتس على الهواء مباشرة، CD3+، CD8+ الخلايا. تم تعريف الذاكرة المركزية على أنها CD28+ CD95+. تم تعريف ذاكرة Effector على أنها CD28-CD95+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig03large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype at JoVE.com

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

نحن نرسم بروتوكول لمدة 9 أيام لنقل وتوسيع خلايا الدم الأحادي النووي المحيطية rhesus المكاك الذي ينتج الخلايا مع التعبير المشترك الممتاز عن الجينات ذات الاهتمام في عدد كاف لدراسات التسريب من فعالية الخلية.

نقل وتوسيع الخلايا التائية الأولية في تسعة أيام مع الحفاظ على النمط الظاهري للذاكرة المركزية

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

يحدد هذا البروتوكول إنتاج خلايا الريسوس المناعية التي تعبر عن بروتينين: مستقبل مستضد اتمريك مضاد للفيروسات ومستقبلات chemokine CXCR5 التي تستهدف الخلايا إلى بصيلات اللمفاوية. هذا الإجراء السريع نسبيا لمدة تسعة أيام تنتج الخلايا التائية مع أقل تميزا نمط الظاهري الذاكرة المركزية مع احتمال طويل الأجل الثابتة بعد ضخ في الحيوانات. وسيتيح تكييف هذه الطريقة مع الخلايا البشرية إنتاج الخلايا التائية المناعية التي يمكن أن تحفز على مغفرة دائمة لفيروس نقص المناعة البشرية دون تناول العقاقير المضادة للفيروسات العكوسة.ويمكن استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع لإنتاج خلايا الريسوس تي التعبير عن البروتينات الأخرى من الفائدة. ومع تعديلات طفيفة، يمكن استخدامه لتوليد الخلايا التائية المُحولة في أنواع أخرى بما في ذلك البشر. ويعتمد نجاح عملية النقل على مراكز الـ PBMCs الصحية المحفزة.يجب توخي الحذر في الجمع والنقل والتخزين. قبل عملية النقل، من المهم تقييم تحفيز الخلايا بصريًا. ابدأ بإذابة نكسات الريسوس PBMCs الأولية.احتضان الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية مع التحريض لطيف حتى يبقى سوى كمية صغيرة من الجليد. ماصات بلطف الخلايا في أنبوب مخروطي. ثم شطف القارورة مع ملليلتر واحد من الوسط الأساسي و ببطء إضافته إلى الخلايا.إضافة ببطء إضافية تسعة ملليلتر من المتوسطة الأساسية الدافئة إلى الخلايا. ضع الأنبوب في العبوة المقاومة للهباء الجوي والطرد المركزي بمعدل 600 مرة في غرام لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 22 درجة مئوية. التعرق وssuspend بيليه في كمية صغيرة من متوسطة النمو.لحساب الخلايا، إضافة 10 ميكرولترات من الخلايا إلى 10 ميكرولترات من الأزرق trypan. قم بتحميل شريحة الغرفة وأدخلها في العداد. اضغط على زر الالتقاط لحساب الخلايا.حساب العدد الإجمالي للخلايا بضرب تركيز الخلايا بالحجم وتخفيفها إلى مليوني خلية لكل ملليلتر في متوسط النمو. إضافة المضادة لـ CD28 لتركيز النهائي من خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر. ثم الماصات من ثلاثة إلى ستة ملايين خلية في البئر في لوحات مغلفة CD3 المضادة.احتضان لوحات لمدة يومين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. سخني جهاز طرد مركزي إلى 32 درجة مئوية عن طريق تشغيله عند 2,000 ضعف ز لمدة 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه، دافئة على حد سواء خالية من المصل وسائل الإعلام والنمو في حمام الماء 37 درجة مئوية وذوبان الفيروس مع دوامة لطيف في حمام مائي 37 درجة مئوية.ثم ضعه على الجليد. تخفيف الفيروس إلى تعدد الأمثل المحدد سلفا من العدوى في المتوسطة خالية من المصل. إضافة ملليلترين من الفيروس الرجعي المخفف إلى كل بئر من لوحة ليفية المغلفة باستخدام وسائل الإعلام وحدها لخلايا التحكم السلبية.ضع اللوحات في جهاز الطرد المركزي المُسبق الارهاد في حاملات الصواح الصغيرة والطرد المركزي عند 2000 مرة من g لمدة ساعتين. إذا كان يستخدم على الفور، الاستنشاق إعداد الفيروس من الآبار وإضافة ملليلتر من متوسطة النمو. تحقق من PBMCs حفز تحت مجهر مقلوب.يجب أن تكون الخلايا مستديرة ومشرقة وينبغي أن تنكس الضوء. وينبغي أن يكون لديهم أيضا مظهر متجمع تشير إلى التحفيز. جمع الخلايا المستهدفة ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.شطف كل بئر مرة واحدة مع ملليلتر واحد من متوسطة النمو وإضافة ذلك إلى الأنبوب. ثم عد الخلايا كما أظهرت سابقا. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لهم في 600 مرة ز لمدة خمس دقائق في 32 درجة مئوية.استلهم وسائل الإعلام من بيليه و resuspend الخلايا في وسط النمو بتركيز 1.5 مليون خلية لكل ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى كل فيروس المغلفة جيدا وإضافة خلايا تحويل MAC إلى الآبار المغلفة ليفينيكتين التي لم تتلقى الفيروس. أجهزة الطرد المركزي لوحات في 1،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في 32 درجة مئوية واحتضانها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.يتطلب العمل مع خلايا الريسوس وفيروسات غاما الرجعية استخدام معدات الحماية الشخصية مثل معاطف المختبرات والقفازات ويجب أن يتم العمل في خزانة السلامة البيولوجية. يجب تطهير جميع الماصات والحلول. ماشيت محتويات كل بئر صعودا وهبوطا مع ماصة ملليلتر خمسة لإعادة تعليق الخلايا ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.إضافة ملليلتر واحد من متوسطة النمو لكل بئر والماصات صعودا وهبوطا لإزالة الخلايا الملتصاة. ثم عد الخلايا كما سبق وصفها. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق في 25 درجة مئوية.ثم تطن وسائل الإعلام و resuspend الخلايا في توسيع وسائل الإعلام إلى تركيز مليون خلية لكل ملليلتر. بذور خمسة ملليلتر من الخلايا في كل بئر الغاز نفاذية من لوحة ستة بئر وطبقة بعناية إضافية 25 ملليلتر من وسائل الإعلام التوسع في البئر. ثم احتضان الخلايا دون عائق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربعة أيام.لجمع الخلايا من الآبار، وإزالة وتجاهل 20 ملليلتر من وسائل الإعلام مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا. الماصات وسائل الاعلام المتبقية صعودا وهبوطا لإزاحة الخلايا. استخدام ماصة نقل العقيمة لشطف كل بئر مع ثلاثة ملليلتر من وسائل الإعلام وجمع الخلايا المتبقية.ثم عد لهم للتحقق من رقم الخلية ومقومات البقاء. وقد استخدم هذا البروتوكول في نقل وتوسيع الخلايا من ستة مختلفة. وتم زرع آبار الغاز القابلة للنفاذ بكثافة تبدأ من خمسة ملايين خلية، وبعد أربعة أيام من النمو، تم تحقيق كثافة متوسطة قدرها 55.6 مليون خلية في البئر.أبقيت القدرة صلاحية من الخلايا يرصّد ب [تريبن] الإقصاء زرقاء كان في 83 [أو 95] ٪ طوال البروتوكول. تم استخدام قياس تدفق السيل لمراقبة التعبير المشترك للجينات المتحولة. في اليوم الخامس، تم نقل متوسط 42.8٪ من الخلايا مع كل من CD4-MBL CAR و CXCR5.بينما في اليوم التاسع، كان متوسط التعبير 47.6٪ مع جولة واحدة من النقل. كما تم استخدام عملية استئصال التدفق لمراقبة النمط الظاهري للذاكرة. قبل النقل والتوسع، تم تحديد مجموعات الذاكرة المركزية الساذجة والذاكرة المنفذة.فقد السكان الساذج مع زراعة وكانت الخلايا في المقام الأول خلايا الذاكرة المركزية في اليوم الخامس واليوم التاسع. ويعتمد النجاح في النقل على استخدام الكواشف عالية الجودة، والخلايا القابلة للحياة للغاية، وفيروس الثدي، فضلا عن اتباع توقيت البروتوكول باستمرار. يمكن استخدام الخلايا للفحوصات الوظيفية بما في ذلك الهجرة واختبارات قمع الفيروسية وكذلك للضخ في الحيوانات للدراسات قبل الإكلينيكية لاختبار فعالية العلاج المناعي.لقد تقدمنا في الاختبار قبل الفحصي للخلايا التائية في الحيوانات وCXCR5 في الحيوانات ونأمل أن نختبر هذا العلاج المناعي قريبًا في الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

البوليمرات الذاكرة شكل خلية للثقافة أحدث

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

التنمية، والتوسع، و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

زرع المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من Mesoangioblast مثل السلف الميوجينيك في نماذج الماوس من تجديد العضلات

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

استرجاع الجراحية، عزل و<em&gt; في المختبر</em&gt; توسيع الأمامي الإنسان الصليبي الخلايا المشتقة من الرباط لتطبيقات هندسة الأنسجة

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

تنظيم المغذيات عن طريق تغذية مستمرة لتوسيع نطاق واسع من خلايا الثدييات في الأجسام الشبه الكروية

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

ميكروفلويديك تدفق الدوائر عن طريق الدم تم اعادة تشكيل لنموذج الإرقاء وصفائح الدم نقل<em&gt; في المختبر</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

تذوب الكتابة اليكتروسبينينج من السقالات Poly(ε-caprolactone) ثلاثي الأبعاد مع مورفولوجيس يمكن السيطرة عليها لتطبيقات هندسة الأنسجة

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

تحسين 3D المائية الثقافات من الخلايا الدبقية الأولية لنمذجة في المختبر نيوروينفلاميشن

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

عزل وثقافة الخلايا الظهارية البشرية الأولية باستخدام Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

عزل وتوسيع وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة من وسادة الدهون تحت الرضفة لمفصل خنق الماعز

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...