Name: transduction and expansion of primary t cells in nine days with maintenance of central memory phenotype
Uploaded: 2020-03-18T13:00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype at JoVE.com

מחקר זה היה נתמך על ידי NIH מענקים 5R01AI096966-06S1 (PS, EC, ו-EB), 1UM1AI26617 (PS, EC ו-EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN להגיע להעניק 5R01AI096966-03 (PS), 1UM1AI26617-01 (PS ו-EB), 1UM14126617 (PS ו-EC) כמו גם קרנות שסופקו על ידי חטיבת NIAID של מחקר הפנים והפנים NIH התוכנית ויראלית. Anti-CD3 ו-anti-CD28 בשימוש במחקרים אלה סופק על ידי משאב מגיב הפרימטים של NIH Nonhuman (R24 OD010976, U24 AI126683). IL-2 בשימוש במחקרים אלה סופק על ידי מאגר Preclinical של NCI. אנו מודים למשתפי הפעולה שלנו בפרוייקט CD4-mbl/CXCR5 הזה, ד ר. אליזבת ' קוניק באוניברסיטת אריזונה, ד ר. אדוארד ברגר ב niaid, NIH, ד ר. אווה G rakasz במרכז לחקר הפרימטים הלאומית של ויסקונסין וד ר ג'ף הארט וגברת פרייס הרן באוניברסיטת מינסוטה, ד ר לסלי kean בבית הספר לרפואה של הרווארד וד ר קתרין בולרד במכון ל אנחנו גם מודים ד ר סקוט McIvor באוניברסיטת מינסוטה, ד ר. כריסטופר פיטרסון בבית פרד האצ סרטן המרכז, ד ר מתיו Trivett ב-NIH, ד ר. לזניה טרביטביוט בבית החולים סיאטל ילדים, וד ר קונרד ראסל קרוז במכון לחקר הילדים על הסיוע המועיל שלהם באופטימיזציה של פרוטוקול זה אנו מכירים גם את מיס צ'י פאן וגברת ג'ומארי אלגריה-Berrocal באוניברסיטת מינסוטה לייצור מוצרים ויראליות, וגברת קים וייגראו באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון לבידוד רזוס מקוק.

<ol>
	<li>Klebanoff, C. A., Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+for+gene-engineered+T+cell+immunotherapy+for+solid+cancers.">Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers.</a> Nature Medicine. 22 (1), 26-36 (2016).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Sadelain, M., Rivi&#232;re, I., Riddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+T+cell+engineering.">Therapeutic T cell engineering.</a> Nature. 545 (7655), 423-431 (2017).</li><li>Kuhlmann, A., Peterson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T-cell+approaches+to+HIV+cure.">Chimeric antigen receptor T-cell approaches to HIV cure.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 13 (5), 446-453 (2018).</li><li>Ghanem, M. H., Bolivar-Wagers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+chimeric+antigen+receptors+targeting+the+CD4+binding+site+and+high-mannose+Glycans+of+gp120+optimized+for+anti-human+immunodeficiency+virus+potency+and+breadth+with+minimal+immunogenicity.">Bispecific chimeric antigen receptors targeting the CD4 binding site and high-mannose Glycans of gp120 optimized for anti-human immunodeficiency virus potency and breadth with minimal immunogenicity.</a> Cytotherapy. 20, 407-419 (2018).</li><li>Folkvord, J. M., Armon, C., Connick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+Follicles+Are+Sites+of+Heightened+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+(HIV-1)+Replication+and+Reduced+Antiretroviral+Effector+Mechanisms.">Lymphoid Follicles Are Sites of Heightened Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Replication and Reduced Antiretroviral Effector Mechanisms.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. , (2005).</li><li>Connick, E., Mattila, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTL+Fail+to+Accumulate+at+Sites+of+HIV-1+Replication+in+Lymphoid+Tissue.">CTL Fail to Accumulate at Sites of HIV-1 Replication in Lymphoid Tissue.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 6975-6983 (2007).</li><li>Connick, E., Folkvord, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Simian+Immunodeficiency+Virus+Replication+within+Secondary+Lymphoid+Tissues+of+Rhesus+Macaques+Is+Linked+to+Disease+Stage+and+Inversely+Related+to+Localization+of+Virus-Specific+CTL.">Compartmentalization of Simian Immunodeficiency Virus Replication within Secondary Lymphoid Tissues of Rhesus Macaques Is Linked to Disease Stage and Inversely Related to Localization of Virus-Specific CTL.</a> The Journal of Immunology. 193 (11), 5613-5625 (2014).</li><li>Haran, K. P., Hajduczki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simian+immunodeficiency+virus+(SIV)-specific+chimeric+antigen+receptor-T+cells+engineered+to+target+B+cell+follicles+and+suppress+SIV+replication.">Simian immunodeficiency virus (SIV)-specific chimeric antigen receptor-T cells engineered to target B cell follicles and suppress SIV replication.</a> Frontiers in Immunology. 9 (MAR), 1-12 (2018).</li><li>Ayala, V. I., Deleage, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR5-Dependent+Entry+of+CD8+T+Cells+into+Rhesus+Macaque+B-Cell+Follicles+Achieved+through+T-Cell+Engineering.">CXCR5-Dependent Entry of CD8 T Cells into Rhesus Macaque B-Cell Follicles Achieved through T-Cell Engineering.</a> Journal of Virology. 91 (11), e02507-e02516 (2017).</li><li>Redeker, A., Arens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+adoptive+T+cell+therapy:+The+particular+role+of+T+cell+costimulation,+cytokines,+and+post-transfer+vaccination.">Improving adoptive T cell therapy: The particular role of T cell costimulation, cytokines, and post-transfer vaccination.</a> Frontiers in Immunology. 7 (SEP), 1-17 (2016).</li><li>Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+Through+Subsets.">Sorting Through Subsets.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).</li><li>Ghassemi, S., Nunez-Cruz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T+Cells.">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li><li>Minang, J. T., Trivett, M. T., Bolton, D. L., Trubey, C. M., Estes, J. D., Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Adoptively+Transferred+Central+and+Effector+Memory-Derived+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+in+Rhesus+Macaques+during+Acute+Infection.">Efficacy of Adoptively Transferred Central and Effector Memory-Derived Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones in Rhesus Macaques during Acute Infection.</a> The Journal of Immunology. 184 (1), 315-326 (2010).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+persistence,+and+activation+state+of+adoptively+transferred+allogeneic+and+autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-specific+CD8(+)+T+cell+clones+during+acute+and+chronic+infection+of+rhesus+macaques.">Trafficking, persistence, and activation state of adoptively transferred allogeneic and autologous Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8(+) T cell clones during acute and chronic infection of rhesus macaques.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). 184 (1), 303-314 (2010).</li><li>Patel, S., Jones, R. B., Nixon, D. F., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapies+for+HIV+:+Preclinical+successes+and+current+clinical+strategies.">T-cell therapies for HIV : Preclinical successes and current clinical strategies.</a> Cytotherapy. 18 (8), 931-942 (2019).</li><li>Chambers, C. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costimulatory+regulation+of+T+cell+function.">Costimulatory regulation of T cell function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 11 (2), 203-210 (1999).</li><li>Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culture+model+for+T+lymphocyte+clonal+anergy.">A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy.</a> Science. 248 (4961), 1349-1356 (1990).</li><li>Bajgain, P., Mucharla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+production+of+suspension+cells+using+the+G-Rex+M+series.">Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex M series.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 1, 14015 (2014).</li><li>Pampusch, M. S., Haran, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+transduction+and+expansion+of+transduced+T+cells+with+maintenance+of+central+memory+populations.">Rapid transduction and expansion of transduced T cells with maintenance of central memory populations.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 16, 1-10 (2019).</li><li>Taraseviciute, A., Tkachev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cell-mediated+neurotoxicity+in+nonhuman+primates.">Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates.</a> Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).</li><li>Berger, C., Sommermeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+targeting+ROR1+in+primates+with+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells.">Safety of targeting ROR1 in primates with chimeric antigen receptor-modified T cells.</a> Cancer Immunology Research. 3 (2), 206-216 (2015).</li></ol>

ד ר פמלה סקינר היא המייסד המשותף והקצין המדעי הראשי של מארפם פרמה.

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיית הפקה תא T לטיפול אשר מנצל וקטור gammar, כדי לשנות את רזוס מקוק PBMC המוביל לאוכלוסיית תא T המבטא רכב אנטי ויראלי, כמו גם את הזקיקים קולטן ביות, CXCR5. עם סך של 8 ימים של התרבות vivo ex הזמן, קיימא, פונקציונלי מכונית T מיוצרים בכמות שהיא בתוך טווח שפורסם10,21, 22 משמש22 לעירוי לתוך פרימטים אנושיים עבור בדיקות יעילות טרום קלינית.
ההצלחה של פרוטוקול התמרה מסתמך הן בריאים, מגורה PBMCs ועל ההכנות איכות של וירוס gammar,. כדי להשיג גירוי והתמרה מוצלחת, חיוני שטיפול נאות יילקח בהקפאה ובהובלה של PBMCs לאחר האיסוף. באופן אידיאלי, אם התאים נאספים מחוץ לאתר, הם נשלחים בחנקן נוזלי וממוקמים במהירות באחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך. PBMCs חייב להיות פעיל באופן מיאוסטי כדי להיות מושפע בהצלחה על ידי וירוס gammar,. אחד צריך לפקח באופן חזותי עבור האשכולות של התאים לאחר גירוי עם אנטי CD3/anti-CD28. כשל בהפעלה כהלכה יגרום ליעילות נמוכה של התמרה. חשוב גם לעקוב אחר הכדאיות בתאים מגורה. הכדאיות המסכנה לאחר שלב הגירוי מובילה בדרך כלל להתמרה פחות מוצלחת. אם ההכנות וירוס מיוצרים במעבדה או מיקור חוץ, הם צריכים להיות מאוחסנים ב-80 ° c בשימוש יחיד ali, כדי למנוע הקפאת מחזורי הפשרה כי יכול לפגוע בווירוס ולפגוע התמרה יעילות. הווירוס חייב להיות מבוקר כך כמויות עקביות של וירוס ניתן להשתמש בכל ניסוי. בעת שימוש בווירוס לצורך התמרה, הפשרת הווירוס במהירות והחנות על הקרח עד הצורך. הבחירה של היזם, משפר ומעטפות חלבונים עלולים להשפיע על יעילות התמרה וביטוי של הטרנסגנים בתאי היעד. לפיכך, יש לקבוע באופן אמפירי את משרד הבית. בנוסף, השימוש במדיה המיועדת לתמוך בתאי T ובלוחות עם בארות חדירות גז להתרחבות הובילו להתרחבות מעולה של תאי התמרה. עם זאת, קיימת בעלי חיים לשונות בעלי חיים בקצב ההרחבה של התא. אנו ממליצים על מחקר ניסיון כדי לקבוע את היכולת של הכנה תא מסוים להיות התמרה והרחבה. רמות הרחבה הן עקביות בהתמרה בקנה מידה קטן וגדול.
עם השימוש בפרוטוקול זה, הופקו עד 2.5 x 109 תאים לעירוי לתוך בדיקת חיות. למרות שמצאנו את זה מיותר לשנות את הפרוטוקול בשלב זה, השימוש 6 טוב לוחות הוא מגבלה על הכנת התא בקנה מידה גדול הפרוטוקול ידרוש שינוי כדי לייצר מספר גדול יותר של תאים. דוגמאות של שינויים פוטנציאליים כוללים ביצוע התמרה של שקית התרבות מצופה fibronectin כדי להגדיל את מספר התאים המותמרים ולהשתמש בכלי קיבול גז חדיר גדול יותר לשלב ההתרחבות. למרות שעדיין לא עשינו שינויים אלה, הם מנצלים מוצרים זמינים מסחרית ושינויים אפשריים לפרוטוקול הנוכחי.
באמצעות שיטה זו, יש לנו הפיק תאי התמרה מ-PBMC מבודדים בעלי חיים נגועים, סיב בעלי חיים נגועים בעלי בעלי חיים שנדבקו סיב מטופלים עם טיפול תרופתי (אמנות). עם זאת, אנו ציינו ירידה ביעילות התמרה בתאים שטופלו באמנות20. הפחתה זו נובעת ככל הנראה בשל העיכוב של היפוך הטרנסקריפטאז ו/או שילובי התרופות. התמרה של התאים מבעלי חיים שטופלו באמנות ידרוש שינויים בפרוטוקול זה, כגון הפחתת רמות תאיים של תרופות אמנות על ידי עצירת אמנות במשך מספר ימים לפני איסוף PBMC או באמצעות וקטור חלופי אשר אינו מושפע התרופות האמנות בדרך כלל בשימוש.
חשוב כי תאים המיוצרים עבור טיפול חיסוני להיות של פנוטיפ הבדיל מינימלית, כך שהם ממשיכות post-אינפוזיה12. למרות פרוטוקולים רבים עבור העברה המאמצת של תאים דורשים פעמים תרבות ארוכה, הזמן הvivo לשעבר התרבות הקטנה כבר בקורלציה עם הפחתת בידול ושיפור בתפקוד תא T רכב13. פרק הזמן המהיר יחסית של התמרה זו ופרוטוקול הרחבה מאפשר תחזוקה של הזיכרון המרכזי הרצוי הזכרון תוך שהוא עדיין מייצר תאים מספיקים לבדיקת הפוטנציאל החיסוני שלהם20.
המטרה של אסטרטגיית הייצור עבור מוצר זה חיסוני תא T היא לייצר תאים T שיזהו תאים נגועים סיב, התנועה לאתר של שכפול נגיפי ב זקיק התא B ו יהיה להתמיד בבעלי חיים וכתוצאה מכך לטווח ארוך תרופה פונקציונלית ללא צורך בתרופות אנטי-retroviral. לתרגום מוצר חיסוני האדם, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לשנות את התאים האנושיים T באמצעות השימוש בנוגדנים ספציפיים לאדם, ציטוקינים ויישום של תקני GMP עם המטרה האולטימטיבית של הפקת תרופה פונקציונלית עבור HIV.

חיסוני הסלולר מתגלים כאמצעי חדש לטיפול במחלות כולל סרטן ומחלות זיהומיות. שיטות הטיפול החיסוני מעורבות בדרך כלל בתאים טיפוליים לבטא מולקולות ספציפיות. לדוגמה, כימאריק קולטן אנטיגן (רכב) תאים T מתוכננים לבטא מולקולה רכב כי יש תחום החילוץ כי נקשר במיוחד מולקולות על תאים חולים ומתחם איתות המפעיל את התאים החיסוניים להרוג את התא החולה. תאי T מכונית נמצאים בשימוש בהצלחה חיסוני סרטן, והיה יעיל במיוחד בטיפול B תא לוקמיה1,2,3. מכונית-T תאים גם מפותחים לטיפול בזיהומים נגיפי כגון HIV. HIV ספציפי מכוניות למקד את החלבונים המעטפה על פני השטח של תאים נגועים באופן ויראלי4. תאים אימונותרפיה יכולים גם להיות מהונדסים לבטא מולקולות ביות למקד את התאים הטיפוליים למיקומים רקמות ספציפיות. פיתחנו וקטורים כי מעביר הן מכונית ספציפית וירוס, כמו גם הלימפה זקיק מולקולה CXCR55.
שכפול נגיפי של וירוסים מסוימים, כולל וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) וירוס הכשל החיסוני קופיים (סיב), מרוכז ב-B זקיקי תאים ברקמות הלימפה המשני6. ב-זקיקי התאים הם אתרים מיוחסים במקצת, בהם רמות נמוכות של וירוסים ספציפיים לאישור CTL שכפול ויראלי מתמשך7,8. מסיבות אלה, מיקוד התאים HIV/סיב ספציפי T לתוך זקיק דרך הביטוי של CXCR5 היא אסטרטגיה חיסול של מאגר הזקיקים של תאים נגועים virally9,10. באופן ספציפי, אנו מיקוד התאים הספציפיים סיב מכונית T אל זקיקי התא באמצעות CXCR5 הביטוי המשותף.
בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לשנות את המכונית/CXCR5 ולהרחיב PBMCs לייצר תאים מכונית/CXCR5 T של כמויות מספיקות אינפוזיה טיפולית. תאים שעברו התמרה עם שיטות אלה לשמור על הזיכרון המרכזי הפנוטיפים. מחקרים הראו כי תאים עם פנוטיפ פחות הבדיל, כגון הזיכרון המרכזי t תאים ותאי גזע t זיכרון להתמיד יותר מאשר תאים הבדיל יותר11,12. בנוסף, פרוטוקולים רבים שנועדו לייצר תאים שהועברו מאומצים יש זמן רב יחסית בתרבות כי התוצאה בתאים שיש להם פנוטיפ הבדיל יותר והתמדה מופחתת13. יתר על כן, תאים שהועברו מאמצים עם זמני תרבות ארוכים שהצטברו בתוך הריאות במקום רקמות14הלימפה היעד ב רזוסמקוק 14,15. בשיטות שאנו מתארים ולהדגים כאן, אנו מרחיבים במהירות ולהרחיב PBMCs רזוס מקוק לייצר תאי T מתתמרים לשמור על הזיכרון המרכזי הזיכרונות.
גם תאי CD4 ו-CD8 T נכללים בגישת החיסוני שלנו. זה האוכלוסייה תא מעורב נבחר כי, בניסויים קליניים, העדר CD4 + T תאים במוצר תא CD8 + T היה מתואם עם כישלון של תאים CD8 T מעורבב כדי להמשיך 16. השיטות המתוארות כאן מתחילות בהפעלת pbmcs עם נוגדנים anti-CD3 ו anti-CD28 אשר לעורר בסיפוק את הקולטן התא T ולספק אות שיתוף מגרה כדי למנוע שבטיים anergy17,18.
לאחר ההפעלה, תאים מותמרים עם קידוד וקטורי של gammaretroviral מכונית ספציפית וירוס ואת המולקולה הלימפה CXCR5. תאי התמרה מורחבת לאחר מכן באמצעות צלחות שנועדו עבור הפצת תאים שאינם חסיד אשר יש קרום חדיר גז בבסיס. קרום זה מתיר החלפת גז בתחתית הבאר המובילה הישרדות התא משופר זמינות מזינים19. באמצעות שיטות אלה, ניתן לייצר תאים פונקציונליים מספיקים בפרק זמן של 9 ימים במחקרים vivo אינפוזיה. למרות שפרוטוקול זה מיועד לצורך התמרה והרחבה של תאי מקוק רזוס, עם שינוי קל של נוגדנים מסוג מינים ספציפיים, ניתן להשתמש בו עם תאים ממינים אחרים. שיטות אלה מבוססות על מחקרים שפורסמו בעבר9,20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gammaretrovirus preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.025% Trypsin, 0.01% EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates, treated</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>Sh30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Mem</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985070</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBS-CMV-gagpol</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35614</td>
			<td>A gift from Dr. Patrick Salmon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5</td>
			<td>custom order from GenScript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RD114</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Dr. Ed Berger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VSV-G</td>
			<td></td>
			<td>pMD.G</td>
			<td>A gift from Dr. Scott McIvor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T cell stimulation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates, untreated</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD28</td>
			<td>NHP Reagent Resource</td>
			<td>Clone: CD28.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-macaque CD3</td>
			<td>NHP Reagent Resource</td>
			<td>Clone: FN18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells</td>
			<td>WNPRC</td>
			<td></td>
			<td>Primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Fibronectin coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates, untreated</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Fraction V)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH 30574.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin (1 mg/ml)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For T cell Expansion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-Rex 6 Well Plate</td>
			<td>Wilson Wolf</td>
			<td>P/N 80240M</td>
			<td>Plates with gas permeable wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>Sh30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>NCI Preclinical Repository</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Vivo-15 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variations of Media used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic medium:</td>
			<td>X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expansion medium:</td>
			<td>Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth medium:</td>
			<td>Basic medium + 50 IU/ml IL-2</td>
			<td></td>
			<td>Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chambers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20186</td>
			<td>for conjugation of MBL antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD28-BV605</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3-AF700</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8-BV788</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD95-PerCP Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CXCR5-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-1985-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MBL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-40145-S6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Analysis software</td>
			<td>FlowJo, LLC</td>
			<td>FlowJo v10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Near IR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosolve canisters to contain aerosol leakage</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>SX4750</td>
			<td>Safety equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Allegra Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Sterilgard e3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Everlast 247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Laminar flow hood</td>
			<td>Baker</td>
			<td>Heracell Vios 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-Safe Disposable lab coat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>359232</td>
			<td>Personal protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate carriers with biocertified covers</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td>Safety equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>X13-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gen Nitrile gloves</td>
			<td>Genesee</td>
			<td></td>
			<td>Personal protective equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transduction and expansion of primary t cells in nine days with maintenance of central memory phenotype

חיסוני המתעוררים לטיפול במחלות זיהומיות וסרטן לעתים קרובות כרוך התמרה של אוכלוסיות סלולריות עם גנים קידוד מחלות מיקוד החלבונים. לדוגמה, כצ קולטן אנטיגן (רכב)-T תאים לטיפול בסרטן וזיהומים נגיפי כרוך התמרה של תאים T עם גנים סינתטיים קידוד מולקולות רכב. מולקולות רכב להפוך את התאים T במיוחד לזהות ולהרוג סרטן או תאים נגועים virally. תאים יכולים גם להיות מהתמרה משותפת עם גנים אחרים של עניין. לדוגמה, תאים יכולים להיות משותפים עם גנים קידוד חלבונים היעד תאים למיקומים ספציפיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשנות את הדם ההיקפי העיקרי תאים מוננונקה (PBMCs) עם גנים קידוד מכונית ספציפית וירוס ו תא B זקיק מולקולה מולקולת כימוקין סוג 5 (CXCR5). הליך זה לוקח תשעה ימים ותוצאות התמרה אוכלוסיות תא T לשמור על הזיכרון המרכזי הפנוטיפ. תחזוקה של זיכרון מרכזי או פנוטיפ פחות מובחנים הוכחו לשיוך להתמדה של תאים שלאחר העירוי. יתר על כן, תאים המיוצרים עם שיטה זו להראות רמות גבוהות של יכולת הכדאיות, רמות גבוהות של ביטוי שיתוף של שני גנים התמרה, וכמויות גדולות מספיק של תאים עירוי חיסוני. פרוטוקול זה בן תשעה ימים עשוי לשמש בהרחבה עבור תא CAR-T וגישות אחרות לחיסוני תא T. השיטות המתוארות כאן מבוססות על מחקרים שהוצגו בפרסומים הקודמים שלנו.

ייצור תאים התוצאות המוצגות בפרסום זה דומות לאלה שבעבודתנו הקודמת שפורסמה בשנת9,20. ניצול הפרוטוקול המוצג כאן, אנו מצפים לפחות 8-קיפול הרחבה של תאים בין ימים 5 ו 9 (חציון 11.1 קיפול, טווח 8.7 – 13 קיפול). חדירות גז בארות שופרה בצפיפות התחלתי של 5 x 106 תאים ואחרי 4 ימים של צמיחה, השגנו צפיפות חציון של 55.6 x 106 תאים לכל באר (טווח 43.5 – 64.8 x 106) (איור 1א). ספירת תאים עם הדרה טרילון כחול מראה כי התאים לשמור על הכדאיות גבוהה ברחבי הפרוטוקול (יום 9 החציוני 85.8%, טווח 83 – 95%) (איור 1B). אנו מוצאים בעלי חיים לשונות בעלי חיים ביכולתם של התאים להתרחב; עם זאת, עם האוכלוסייה ההתחלתית של 50-100 x 106 תאים ביום 1, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לייצר מספיק תאים עבור עירוי רזוס מקוק של 1 – 2 x 108 תאים/ק"ג.
ביטוי משותף של הגנים המותמרים היה במעקב עם הזרימה cy, (איור 2א). ביטוי של המכונית וCXCR5 על פני התאים המותמרים היה יציב יחסית בין הימים 5 ו -9 של פרוטוקול זה הרחבה. ביום 5, חציון של 42.8% (טווח 36.5 – 46.9%) של התאים היו מותמרים עם CD4-MBL רכב ו CXCR5 ואילו ביום 9, הביטוי החציוני היה 47.6% (טווח 44.5 – 64.5%) בסיבוב אחד של התמרה (איור 2ב'). למרות שפרוטוקולים מסוימים מתקשרים לסיבוב נוסף של התמרה, לא ראינו תועלת במונחים של תאי התמרה מוחלטת בסיום הפרוטוקול (הנתונים אינם מוצגים).
פנוטייפ תאי התמרה נותחו על ידי מיכלי הזרימה. לפני התמרה והתרחבות, נאיבי, זיכרון מרכזי ואוכלוסיית הזיכרון של אפקטור מזוהים (הנתונים אינם מוצגים) אך האוכלוסייה התמימה אובדת באמצעות התאים, ובראשם בעיקר תאי זיכרון מרכזיים לפי יום 5 (איור 3A) ויום 9 (איור 3ב) כפי שזוהה על-ידי CD95+ CD28+ ביטוי. שימוש זה התמרה מהירה ופרוטוקול הרחבה הפיק תאים אשר בעיקר בתאי זיכרון מרכזי וכך יהיה סיכוי גבוה יותר להתרבות ולהימשך כאשר החדרת לתוך בעל חיים בדיקה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig01.jpg"> איור 1: התמרה ופרוטוקול ההרחבה מייצרת תאי התמרה שופע הנמצאים בעלי קיימא מאוד. (א) התרחבות התאים המתמרים מ -6 בעלי חיים שונים מימים 5 עד 9 בכלי קיבול הגזBויכולת הכדאיות של ה-pbmc המחלחל מ-6 בעלי חיים. הדרה של טרילון כחול באמצעות מונה תאים אוטומטי שימש לניטור מספר התאים והכדאיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig02.jpg"> איור 2: פרוטוקול התמרה מפיק תאים השומרים על ביטוי משותף של שני הגנים המותמרים. (א) מגרש זרימה ייצוגית של רזוס pbmc ביום 9 של התמרה ופרוטוקול הרחבה להפגין ביטוי הן CD4-MBL המכונית ו CXCR5. (ב) ביטוי של CD4-MBL המכונית ו CXCR5 על התמרה רזוס pbmc מתוך 6 בעלי חיים שונים בימים 5 ו 9 בתרבות כפי שנמדד על-ידי cy try זרימה. גייטס הוגדרו על CD3+ תאים בשידור חי. התמרה תאים שזוהו כ-MBL+ CXCR5+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig03.jpg"> איור 3: רוב התאים המיוצרים בפרוטוקול 9-יום יש מרכזי זיכרון פנוטיפ. זרם הנציג cy,לנסותחלקות של (א) יום 5 ו (ב) יום 9 מכונית/CXCR5 התמרה רזוס pbmc. גייטס הוגדרו על חיים, CD3+, CD8+ תאים. הזיכרון המרכזי הוגדר כ-CD28+ CD95+. הזיכרון של אפקטור הוגדר כ-CD28, CD95+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype at JoVE.com

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

אנו מתארים פרוטוקול של 9 ימים עבור התמרה והתרחבות של דם היקפי רזוס מקוק תאים מונמוננקה שתשואות תאים עם ביטוי מעולה של הגנים של העניין במספר מספיק עבור מחקרי אינפוזיה של יעילות התא.

התמרה והרחבה של תאי T ראשוניים בתשעה ימים עם אחזקה של זיכרון מרכזי מושגים

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של תאי T-t של רזוס אימונותרפי המבטאים שני חלבונים: קולטן אנטיגן כימרי אנטי ויראלי קולטן כימוקין CXCR5 כי תאים היעד זקיקי הלימפה. הליך מהיר יחסית זה בן תשעת הימים מייצר תאי T עם פנוטיפ זיכרון מרכזי פחות מובחן עם פוטנציאל להתמדה ארוכת טווח לאחר עירוי לבעלי חיים. התאמת שיטה זו לתאים אנושיים תאפשר ייצור של תאי T אימונותרפיים עם פוטנציאל לגרום הפוגה עמידה ל- HIV ללא מתן תרופות אנטי-רטרו-ויראליות.שיטה זו יכולה לשמש באופן נרחב כדי לייצר רזוס T-תאים המביעים חלבונים אחרים של עניין. ועם שינויים קלים, זה יכול לשמש כדי ליצור תאי T מתומרים במינים אחרים כולל בני אדם. הצלחת ההתמרה תלויה ב-PBMCs מגורים בריאים.יש לדאוג לאיסוף, הובלה ואחסון. לפני ההעתקה, חשוב להעריך חזותית את הגירוי של התאים. התחל על-ידי הפשרת מחשבי רזוס ראשיים.הדגירה את התאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה עד רק כמות קטנה של קרח נשאר. בעדינות pipette התאים לתוך צינור חרוט. לאחר מכן לשטוף את הבקבוקון עם מיליליטר אחד של מדיום בסיסי לאט להוסיף אותו לתאים.לאט לאט להוסיף תשעה מיליליטר נוספים של מדיום בסיסי חם לתאים. מניחים את הצינור במיכל עמיד בתרסיס וצנטריפוגה אותו ב 600 פעמים g במשך חמש דקות ב 22 מעלות צלזיוס. שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את גלולת הכדור בכמות קטנה של מדיום צמיחה.כדי לספור את התאים, להוסיף 10 microliters של תאים 10 microliters של כחול טריפאן. טען את שקופית התא והוסף אותה לדלפק. לחץ על לחצן הלכידה כדי לספור את התאים.לחשב את המספר הכולל של תאים על ידי הכפלת ריכוז התאים לפי נפח לדלל אותם לשני מיליון תאים למיליליטר במדיום הצמיחה. הוסף אנטי CD28 לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר. ואז פיפטה שלושה עד שישה מיליון תאים לתוך צלחות מצופות אנטי CD3.דגירה הצלחות במשך יומיים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. מחממים צנטריפוגה ל 32 מעלות צלזיוס על ידי הפעלתו ב 2, 000 פעמים g במשך כ 30 דקות. בינתיים, חם הן ללא סרום והן מדיה צמיחה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהפשיר את הנגיף עם מערבולת עדינה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.ואז למקם אותו על קרח. לדלל את הנגיף לריבוי אופטימלי קבוע מראש של זיהום במדיום ללא סרום. הוסף שני מיליליטר של רטרווירוס מדולל לכל באר של צלחת מצופה fibronectin באמצעות מדיה לבד עבור תאי הבקרה השליליים.מניחים את הצלחות בצנטריפוגה מראש במנשאי מיקרופלאט וצנטריפוגה אותם ב 2,000 פעמים g במשך שעתיים. אם משתמשים מיד, שאפו את הכנת הנגיף מה בארות והוסיפו שני מיליליטר של מדיום צמיחה. בדוק את המחשבים הממריצים תחת מיקרוסקופ הפוך.התאים צריכים להיות עגולים, בהירים, והם צריכים לנטרל אור. הם צריכים גם מראה מגושם המציין גירוי. לאסוף את תאי היעד ולהעביר אותם לצינור חרוט 50 מיליליטר.לשטוף כל טוב פעם אחת עם מיליליטר אחד של מדיום צמיחה ולהוסיף את זה לצינור. לאחר מכן ספור את התאים כפי שהודגם קודם לכן. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 600 פעמים g במשך חמש דקות ב 32 מעלות צלזיוס.שאף את התקשורת מהכדור והתן מחדש את התאים במדיום הצמיחה בריכוז של 1.5 מיליון תאים למיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של ההשעיה התא לכל היטב מצופה וירוס ולהוסיף MAC להתמר תאים בארות מצופה fibronectin שלא קיבל וירוס. צנטריפוגה הצלחות ב 1, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות ב 32 מעלות צלזיוס ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות.עבודה עם תאי רזוס ורטרווירוסים גמא דורשת שימוש בציוד מגן אישי כגון חלוקי מעבדה וכפפות והעבודה חייבת להתבצע בארון ביו-בטיחותי. יש לפענח את כל הפיפטות והפתרונות. פיפטה התוכן של כל באר למעלה ולמטה עם פיפטה חמישה מיליליטר כדי להשתמש שוב את התאים ולהעביר אותם צינור חרוט 50 מיליליטר.הוסף מיליליטר אחד של צמיחה בינוני לכל באר פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר תאים חסידים. לאחר מכן ספור את התאים כפי שתואר קודם לכן. צנטריפוגה התאים ב 600 פעמים גרם במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.לאחר מכן שאף את התקשורת ולחץ מחדש על התאים במדיה התפשטות לריכוז של מיליון תאים למיליליטר. זרע חמישה מיליליטר של תאים לתוך כל גז חדיר היטב של צלחת שש בארות בזהירות שכבה נוספת 25 מיליליטר של מדיה הרחבה ל הבאר. ואז להידגר התאים באין מפריע ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבעה ימים.כדי לאסוף את התאים מן בארות, להסיר ולהשליך 20 מיליליטר של התקשורת דואג לא להפריע לתאים. פיפטה המדיה הנותרת למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. השתמש פיפטה העברה סטרילית לשטוף כל באר עם שלושה מיליליטר של מדיה ולאסוף את התאים שיורית.לאחר מכן ספור אותם כדי לבדוק אם קיימים מספר תא וכדאיות. פרוטוקול זה שימש להעתקה והרחבה של תאים משש חיות שונות. בארות חדירות גז נזרעו בצפיפות התחלתית של חמישה מיליון תאים ולאחר ארבעה ימים של צמיחה, הושגה צפיפות חציונית של 55.6 מיליון תאים ל באר.הכדאיות של התאים המנוטרים על ידי אי הכללה כחולה trypan נשמרה ב 83 עד 95% לאורך כל הפרוטוקול. ציטומטריית זרימה שימשה להתבוננות בביטוי שותף של הגנים שהתומרו. ביום החמישי, חציון של 42.8% מהתאים הותמר הן עם CD4-MBL CAR והן עם CXCR5.בעוד שביום התשיעי, הביטוי החציוני היה 47.6% עם סבב יחיד של ההעתקה. ציטומטריית זרימה שימשה גם לניטור פנוטיפ זיכרון. לפני התמורה וההתפשטות זוהו אוכלוסיות זיכרון מרכזיות נאיביות וזיכרון משפיע.האוכלוסייה הנאיבית אבדה עם culturing והתאים היו בעיקר תאי זיכרון מרכזיים ביום החמישי והיום התשיעי. ההצלחה בהעתקה תלויה בשימוש בריאגנטים באיכות גבוהה, תאים בני קיימא מאוד ווירוסים ציטרציה, כמו גם באופן עקבי בעקבות העיתוי של הפרוטוקול. התאים יכולים לשמש עבור בדיקות תפקודיות כולל הגירה ודיכוי ויראלי בדיקות, כמו גם עירוי לתוך בעלי חיים למחקרים פרה-קליניים כדי לבדוק את היעילות של האימונותרפיה.התקדמנו עם בדיקות פרה-קליניות של תאי T CAR ו- CXCR5 בבעלי חיים ומקווים לבדוק בקרוב את האימונותרפיה הזו אצל אנשים נגועים ב- HIV.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

זיכרון צורה פולימרים לתרבות התא הפעיל

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

אחזור כירורגי, בידוד ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הרחבת תאים הצולבות קדמי אדם נגזרים רצועה עבור יישומי הנדסת רקמות

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

בידוד ותרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים ראשוניים באמצעות Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

בידוד, הרחבה והתמיינות של תאי גזע מזנכימליים ממשטח השומן האינפרא-פטלרי של מפרק העיזים מחניק

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...