Name: rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Hollings Cancer Center's Cancer Center Support Grant P30 CA138313 pilot forskning finansiering fra National Institutes of Health (<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">https://www.nih.gov/</a>), og midler fra Institut for Patologi & Laboratory Medicine ved Medical University of South Carolina. Vi vil gerne takke Marijne Smiths for at optage interviewudtalelserne.

Alle dyr blev anbragt og vedligeholdt i et AAALAC-godkendt anlæg, og forsøg, der er beskrevet i denne protokol, blev godkendt af MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Dyr til gensidig transplantation bør være en indavlet eller isogen stamme med genkogen status foretrukket eller tilbagekrydset i mindst 6 generationer.
1. Høst donor rotte mælkekirtlen epitel
<ol><li>Bestemme antallet af donor rotter er nødvendige for transplantation. BEMÆRK: Generelt kan 1 donorrot...

Denne protokol beskriver en mælkeepitelcelletransplantationsteknik, der er optimeret til at arbejde med rotter. Isolerede mælkeepitelorier fra donorrotter (3-5 uger) podes ind i den interscapular hvide fedtpude af recipientrotter (også 3-5 uger). Resultaterne kan fortolkes så lidt som 4-6 uger senere, ved hjælp af lys mikroskopi til at undersøge podet væv; den optimale tid mellem transplantation og ofring skal dog fastsættes, inden der gennemføres et fuldstændigt eksperiment. Hvis der er gået for lidt eller fo...

Postnatal mammøkirtel udvikling og ductal morfogenese er processer i vid udstrækning påvirket af hormonelle signalering i begyndelsen af puberteten. Hos mus og rotter, almindeligt anvendte model organismer af mælkekirtlen biologi, denne proces begynder omkring 3 uger af alder, hvor hurtig spredning og differentiering resultere i dannelsen af den modne parenkym. Den modne mælkekirtlen kan gennemgå mange runder af ekspansion og involution, en ejendom, der har været under efterforskning siden begyndelsen af det20. Inden for rammerne af hyperproliferation og udvikling af kræft blev der i1950'erne udviklet mælkekirteltransplantationsteknikker , som blev forstærket af den kvantitative metode , som Gould et al. bidrog med i 19772,3,4. Raffinement af transplantation teknik i gnavere har bidraget til store fremskridt i forståelsen af normal mælkekirtlen biologi, der stadig er meget udbredt til at studere effekten af forskellige behandlinger og genetisk manipulation på normal mælkekirtlen udvikling og sygdom stater.
Mange hypoteser er blevet genereret og efterfølgende testet ved hjælp af mælkekirtlen transplantation, først beskrevet af DeOme et al. i 19591. Eksperimenter på tværs af flere årtier viste tilbøjeligheden af ductal væv punktafgifter fra donor mælkekirtler til at genbefolke hele fedt pad5,6,7 og viste, at en kritisk komponent af mælkekirtlen udvikling ligger i disse epitelstrukturer. Senere undersøgelser i mus viste, at en enkelt mælkestamceller kan genbefolke en renset fedtpude og bidrog til opdagelsen af en enkelt, almindelig stamforemand af basale og luminale mælkeceller8,9,10. I overensstemmelse med disse konklusioner, Er det blevet foreslået, at transplantation øger puljen af celler med multilineage-repopulating potentiale som følge af plasticitet, så podede celler til at vokse en funktionel mælkekirtlen7,10,11,12,13. Det er vigtigt, at brugen af transplantationsteknikker i gnavere overvinder begrænsningerne af cellekultur-inducerede abnormiteter14 og giver ofte resultater på bare et spørgsmål om uger.
Mens proceduren oprindeligt blev beskrevet i forbindelse med præoplastiske læsioner i mus, blev den hurtigt udvidet til rotter og anvendt i forbindelse med behandlingen med kræftfremkaldende stoffer for at etablere mangfoldighed som et mål for kræftfølsomhed15, men populariteten af transplantationsteknikker har fulgt udviklingen af genetiske værktøjer for hver art. Selv om mus undersøgelser indarbejde transplantation har bidraget mange translationelle resultater, parenkym af rotte mælkekirtlen ligner det menneskelige tættere16,17 og tilbyder klare fordele for at studere østrogen receptor-positiv (ER +) brystkræft. Mammary tumorer er utilgængelige i begge arter, men de adskiller sig med hensyn til hormon følsomhed og genekspression profiler. En primær forskel er, at rotte mælketumorer udtrykke og afhænge af funktionen af æggestokkene og hypofyse hormon receptorer, nemlig østrogen og progesteron (PR), svarende til luminal-A subtype af human brystkræft. Faktisk, mammary epitelcelletransplantation, som beskrevet i denne protokol, er blevet brugt til at studere genetiske varianter involveret i brystkræft og bestemme cellulære autonomi virkninger på mælkeepitelceller18.
Ud over tumorbiologi, kanalen epitel af den normale rotte mælkekirtlen udviser et højere niveau af forgrening og er flankeret af et tykkere lag af stroma end musen. Betydningen af stroma er veldokumenteret i mælkeepiteltransplantationsundersøgelser. Mammary epitel skal interagere med fede stroma, og ideelt set sin egen mesenchyme, at gennemgå sin karakteristiske morfogenese19,20. Podning væv i en modtager mælkekirtlen giver et optimalt miljø; tilstedeværelsen af endogenepitel kan dog forstyrre resultaterne. Preclearing mælkekirtlen af endogene epitel er almindeligt udført i mus transplantation assays og kræver kirurgisk excision af endogene mælkevæv og / eller fjernelse af brystvorten1,21,22. Selv om det er muligt, preclearing mælkeepitel i post-fravænning rotter er ikke så almindeligt udført, hovedsagelig på grund af ineffektivitet clearing den voksende mælketræ i post-fravænning rotter. Da det har vist sig, at regioner med fedtvæv andre steder i kroppen kunne støtte væksten af transplanteret mælkeepitel21,23,24, processen med preclearing kan let undgås i rotter ved podning væv i interscapular hvid fedt pad.
Den transplantationsmetode, der er beskrevet i dette papir, indebærer injektion af enzymatisk adskilte mælkekirtelorider (fragmenter af mælkeductal epitel og andre celler, der kan mororegenese) eller monopergers celler i den interscapular fedtpude, der er indavlet, isogene eller kongene stammer af laboratorierotter2. Fordi interscapular fedt pad er normalt blottet for mælkevæv, det giver et passende miljø for flere transplantationssteder uden at det er nødvendigt at præ-klar endogene epitel. Som følge heraf er værtsdyrets endogene, abdominale mønelle mælkekirtler ikke underlagt kirurgisk manipulation, udvikler sig normalt og kan ikke forstyrre fortolkningen af resultaterne. Derudover, den intakte mælkekirtler kan bruges til sammenligning for at evaluere vært versus donor effekter på mælkeepitel udvikling og tumorigenese18,25. Selv om genindsættelse af mælkekirtlen fra en enkelt stamcelle er tilgængelig for mus, det er endnu ikke blevet udviklet til rotte, hovedsagelig på grund af den manglende tilgængelighed af antistoffer til at vælge for rotte mælkestamceller25,26,27. På trods af dette kan transplantation af monodispersed mælkeepitelceller til kvantificering af genbefolkende potentiale udføres med succes, og disse celler vil udvikle sig normalt, når de podes ind i den relevante ramme2,3,4. Mens organoider er gode til mange formål, monodispersed celler er nødvendige for kvantitative anvendelser, for eksempel, at bestemme antallet af mælkeepitelceller, der kræves for kræft indledningen efter ioniserende strålebehandling28 eller for at sammenligne karakteristika flow cytometrisk udvalgte mælkeceller epitelcellepopulationer29.
Til dato, den procedure, der er beskrevet her er den mest robuste metode til at udføre mælkekirtlen transplantation i rotten med et overordnet mål om at studere mælkekirtlen udvikling og mekanismer, der ligger til grund for brystkræft udvikling. Donor- og/eller recipientdyrene udsættes ofte for forskellige variabler før, under eller efter den epiteltransplantation. Som eksempler kan nævnes enkeltgensundersøgelser , der involverer kemisk carcinogenese30, stråling28,31,32, genetisk manipulation af værts-/donorgenom18og hormonmanipulation12. En stor fordel ved den enzymatiske dissociation, der er beskrevet i denne protokol, er muligheden for at isolere epitelorier eller monodispersed celler til komplementære eksperimenter, der involverer flowcytometri, 3D-kultur, genredigering og meget mere. Fremtidige anvendelser af denne teknik vil omfatte yderligere manipulation af donor og / eller vært væv med genteknologi. For eksempel kan donorceller genetisk ændres ex vivo på enhver valgt genomisk locus ved hjælp af CRISPR-Cas9 genredigeringssystem. Tilsvarende kan recipient rotter også genetisk ændres for at studere samspillet mellem donor og modtager manipuleret genetiske faktorer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;M syringe filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-715G</td>
			<td>sterile-filtering collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td>filtering brain homogenate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 uL gastight syringes with 25 gauge needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81001 &#38; 90525</td>
			<td>For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 uL pipette tips + pipette</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>transferring cells/mixtures/tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352196</td>
			<td>brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td>filtering organoids after washing the cell pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td>for collagenase digestion of donor mammary gland tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130181</td>
			<td>for mincing tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alum Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>243361/237086</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer for veterinary use</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-dine or iodine</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass culture tube for homogenization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carmine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6152/1022</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting apparatus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean animal cages for recovery</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 3</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS004183</td>
			<td>enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for chemical solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11320033</td>
			<td>for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705/2701</td>
			<td>mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>-</td>
			<td>inactivation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-212</td>
			<td>use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pads</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets (x2)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital rotation</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>must be capable of maintaining 37&#176;C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthesia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope or digital camera</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>TissueMiser or alternative models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>long-term storage of cleared mammary gland whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks for anesthesia vaporizer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels or delicate task wipes</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively-charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P4981-001</td>
			<td>mammary gland tissue whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postoperative analgesic</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>electric clippers, or other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jars</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile field drapes</td>
			<td>IMCO</td>
			<td>4410-IMC</td>
			<td>used during transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclave surgical tools used for donors and recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes: 5 mL (or greater)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for sterile filtration of collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td></td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier, clips, and removal tool</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12020-00</td>
			<td>Closing the skin incision over the interscapular white pad pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>clearing mammary gland whole mount slides after staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad

Så tidligt som i 1970'erne, forskere har med succes transplanteret mælkeceller epitelceller i den interscapular hvide fedt pad af rotter. Podning mammary epitel ved hjælp af transplantation teknikker udnytter det hormonelle miljø, som den unge gnaver vært. Disse undersøgelser er velegnet til at udforske virkningen af forskellige biologiske manipulationer på mælkekirtlen udvikling og dissekere mange aspekter af mælkekirtlen biologi. En fælles, men begrænsende, træk er, at transplanterede epitelceller er stærkt påvirket af den omgivende stroma og udkonkurreret af endogene epitel; for at udnytte indfødte mælkevæv, abdominal-inguinale hvide fedt pad skal ryddes for at fjerne vært mælkeepitel før transplantation. En stor hindring, når du bruger rotte model organismen er, at rydde udviklingslandene mælketræ i post-fravænnet rotter er ikke effektiv. Når transplanteret i kirtel-fri fedt puder, donor epitelceller kan genbefolke den ryddede vært fedt pad og danne en funktionel mælkekirtlen. Den interscapular fedt pad er et alternativt sted for disse grafts. En stor fordel er, at det mangler kanalstruktur endnu giver den normale stroma, der er nødvendig for at fremme epitel udvækst og er let tilgængelig i rotten. En anden stor fordel ved denne teknik er, at det er minimalt invasive, fordi det eliminerer behovet for at ætse og fjerne den voksende endogene mammary træ. Derudover indeholder den interscapulære fedtpude et mediale blodkar, der kan bruges til at adskille steder til podning. Fordi endogene kirtler forbliver intakt, denne teknik kan også bruges til undersøgelser sammenligne endogene mælkekirtlen til den transplanterede kirtel. Dette papir beskriver metoden til mælkeepitelcelletransplantation i den interscapular hvide fedt pude af rotter.

Donor og modtager mælkekirtler Trinene til at isolere og forberede rottemælkeepitelceller til transplantation er vist i figur 1A. Ved 4 ugers alderen er donorrottens endeogene mælkekirtlen begyndt modning, og epitel kan visualiseres på hele monterede dias, der er plettet med alumcarmin (figur 1B). En donor rotte i denne alder vil give ca 1 x 10...

Watch this Scientific Journal Video about Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad at JoVE.com

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad (Video) | JoVE

Denne artikel beskriver en transplantationmetode til graft donor rotte mælkeceller epitelceller i den interscapular hvide fedt pude af recipient dyr. Denne metode kan anvendes til at undersøge vært og/eller donorvirkninger på mælkeepiteludvikling og eliminerer behovet for forclearing og udvider dermed nytten af denne teknik.

Rotte Mammary Epithelial Celletransplantation i Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Denne protokol har været anvendt i over 40 år og er fortsat den eneste pålidelige metode til brystcelletransplantation assays hos rotten. Denne metode er almindeligt anvendt til at afhøre mammary celle autonome versus vært effekter i brystkræft modtagelighed forskning. Ved podning i den interscapular fedt pad, denne metode omgår at skulle klare den endogene membran epitel, som ikke er effektiv hos rotter.Metoden er derfor mindre invasiv, og de endogene mælkekirtler kan anvendes som en intern kontrol. For at begynde denne procedure, placere en aflivet kvindelig rotte på ryggen og sikre det med stifter. Spray hele den ventrale overflade med 70% ethanol.Lav en sagittal Y-formet snit giver adgang til thorax, abdominal, og lyskeformede mælkekirtler. Brug saks til at dissekere alle mælkekirtlen væv fra donor rotte og fjerne alle synlige lymfeknuder. Dernæst skal du bruge vicess til at udtrække mælkevæv.Læg den i en mærket 60 millimeter skål med 500 mikroliter serumfri DMEM F12-medier, og opbevar den på is. Brug derefter en saks til fint hakke mælkevæv. Først skal du forsigtigt vende kroppen af donordyret over for at placere det i en udsat position og sikre det med stifter.Spray hovedet og den øverste del af ryggen med 70% ethanol. Find bunden af kraniet og lav et snit under occipital condyles, indsæt skarpe saks under huden og skær huden væk fra kraniet, herunder siderne af hovedet. Dernæst skal du bruge knogleskærere eller stærk saks til at skære kraniet langs midterlinjen fra occipital til frontal knogler og samtidig sørge for at holde bladet så overfladisk som muligt og vinklet opad for at forhindre ødelæggelsen af det underliggende hjernevæv.Brug Rongeurs eller stærke kraftæceser til at skrælle knoglen væk. Sæt værktøjet lateral til lillehjernen for at bryde knoglen på begge sider. Afskrive forbindelserne til meninges ved fuldt ud at udsætte øregangen.Brug buede finspidsede kraftbecer til at løfte hjernen ud af kraniet og registrere dens vægt. Brug en frisk start på forsyninger til yderligere donor hjerner. Overfør den straks til et 15 milliliterrør, der indeholder en tilsvarende mængde medier, der opbevares på is.Homogeniser hjernen i 10 til 15 sekunder ved lav hastighed. Derefter filtrere homogenatet for at fjerne store stykker. Opbevar væsken på is, indtil det er nødvendigt.Først skæres en centimeter af enden af en 1.000 mikroliterpipettespids og anstuk den manuelt på pipettoren. Brug en cut pipettespids til at overføre det hakkede donorvæv fra hver 60 millimeter skål til kollagenasefordøjerøret. Bland forsigtigt hakket væv ved at pipettere det op og ned en til to gange.Fastgør derefter prøverne vandret i rystende inkubator. Lad prøverne fordøje i 1,5 til to timer ved 37 grader Celsius, mens de rystes med en hastighed mellem 200 og 220 omdr./min. Når donor mammary kirtel væv er fuldt fordøjet, centrifuge suspensionen ved 1, 200 gange g og ved fire grader Celsius i 10 minutter.Efter at sikre en pellet har dannet, skal du bruge en pipette til at fjerne fedtlaget eller forsigtigt hælde supernatanten af. Forsigtigt resuspend pellet i 10 milliliter friske DMEM F12 medier. Gentag denne proces for grundigt at vaske cellerne.Forbered en 50 milliliter rør med en 40 mikrometer si for hver donor dyr. Fortæt semestren med mindst en milliliter DMEM F12-medier. Brug derefter en pipette til at passere cellesuspensionen gennem filteret for at indsamle ductal fragmenter eller organoider.For organoider opbevares kun de celler, der forbliver i filteret. Inverter celles sien over et nyt 50 milliliterrør og skyl med enhver mængde sterile medier, der kræves for at indsamle alle cellerne. Efter dette, pellet cellerne igen og resuspenderet i en lille mængde medier til optælling.Forbered enkelte partier donormateriale til alle transplantationsmodtagere ved at kombinere lige store mængder af cellesuspensionen med 50 % hjernehomogenat for hvert transplantationssted. Først skal du identificere bunden af kraniet og starten af rygsøjlen på et recipientdyr. Cirka en tredjedel af vejen ned ad ryggen, barbere en tre centimeter med to centimeter område på den øverste brystkasse del af ryggen.Dernæst forberede sterile felt, der vil blive brugt til kirurgi og arrangere alle nødvendige forsyninger. Skyl Hamilton-sprøjterne med sterile DMEM F12-medier for at forhindre tab af celler. Indvarsring af hele mængden af donormateriale i en separat sprøjte for hver tilstand.Når sprøjten er helt lastet, skal du vende den og trykke stemplet lidt for at fjerne luftbobler på spidsen af nålen. Hold sprøjten på is under hele proceduren. Sørg for, at dyret forbliver ikke reagerer på dybe stimuli med en fast tå knivspids.Brug derefter en skarp kirurgisk klinge til at lave et lille interscapular snit. Find den mediale blodkar til orientering og bruge krafterne til at løfte huden på den ene side af snittet. Hold huden væk fra fedtpuden og undgå det underliggende brune fedt, mens transplantationen udføres.Sæt derefter nålen ind i transplantatet. Injicer forsigtigt 40 mikroliter af celleblandingen i det interscapular hvide fedtpudevæv. Fjern nålen langsomt.Hold vævet på plads og lad de transplanterede celler nøjes i tre til fem sekunder. Gentag hele injektionsproceduren som tidligere beskrevet på transplantationsstedet. Efter dette, lukke kirurgisk sår ved hjælp af sårclips eller suturer og derefter afbryde anæstesi.Efter at have ofret dyret, forberede det til dissektion. Identificer det mediale blodkar, der adskiller graft steder i interscapular fedt pad. Punktafgifter hele puden som et enkelt stykke væv.Placer vævet på et positivt opladet mikroskop dias for hele mount. Placer dias i 70% ethanol i syv til 10 dage for at affedte vævet. Derefter forberede alum carmine pletten og behandle dias, når vævet er tilstrækkeligt uigennemsigtig.Når behandlingen er færdig, og vævet på diaset er ryddet, skal du bruge lav effekt mikroskopi eller høj opløsning digital fotografering til at erhverve billeder af dias til analyse. I denne undersøgelse transplanteres mammary epitelceller ved hjælp af en teknik, der er optimeret til at arbejde med rotter, hvor de isolerede brystpitelorganoider fra donorrotter podes ind i modtagerrotternes interscapular hvide fedtpude. Tilstedeværelsen, fraværet eller forekomsten af epitel kan evalueres for at bestemme eksperimentets succes samt uafhængigheden af virkninger relateret til eksperimentelle variabler.En gensidig transplantation eksperiment, hvor hver faktor har to niveauer såsom vilde type versus knockout vil skabe fire transplantation grupper for hypotese test. Den repræsentative hele monteret interscapular fedt pad vist her indeholder positive epiteludvækst på begge steder af transplantation. Ved analyse af dias, manglende epitel i interscapular fedt pad på tværs af mange prøver kan indikere et teknisk problem med proceduren og bør behandles som et negativt resultat.Donor epiteludvækst kan også sammenlignes med den endogene mælkekirtlen og kan lette yderligere konklusioner. I eksemplet vist her, resultaterne af gensidig transplantation ved hjælp af vilde type og CDKN1B knockout rotter foreslog ikke-mælkecelle autonome virkninger på mælkekirtlen udvikling. Husk donorepitelceller og organoider skal forberedes omhyggeligt og holdes i live, indtil de injiceres i recipientdyret.Det er bydende nødvendigt at planlægge og udføre proceduren omhyggeligt og uden afbrydelser. Primære carcinogenese assays kan udføres efter transplantation for at afhøre mammary celle autonomi i ætiologi eller behandling af brystkræft. Genredigering kan også indarbejdes til gensplejsning donorcellerne eller modtagerrotteren.Som den eneste metode til at udføre mælkeepitelcelletransplantation hos rotter, denne procedure letter mælkekirtlen udvikling samt carcinogenese undersøgelser. Denne teknik er især vigtig for at forske i interaktioner mellem brystkræftceller og/eller brystpitelceller med værtmikromiljø. Det gør det muligt undersøgelser i mælkekirtlen udvikling samt brystkræft forskning.Dem, der forsøger denne teknik for første gang bør optimere donor celle præparater for at sikre maksimal celle udbytte og levedygtighed, derefter udføre små pilot eksperimenter til at praktisere kirurgiske procedurer og bestemme cellenumre til at injicere og også bestemme post-kirurgiske inkubation gange, der kræves for eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Kirurgiske Procedurer og Metodologi til Præklinisk Murin Model af<em&gt; De Novo</em&gt; Mammakræft Metastase

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation af zebrafisk-pædiatriske hjernetumorer til immunkompetente værter til langvarig undersøgelse af tumorcelleradfærd og lægemiddelrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Live imaging bryst epitelcelle migration efter forbigående nedbrydningen af TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Betinget Knockdown af genekspression i kræft cellelinjer til at studere ansættelse af monocytter/makrofager at Tumor mikromiljø

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

En Syngeneic bugspytkirtelkræft musen Model til at studere virkningerne af irreversibel elektroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopic injektion af brystkræftceller ind i musene brystkirtler fedt Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function (Video) | JoVE

I Vitro Tumor celle Rechallenge For intelligent evaluering af kimære Antigen Receptor T-celle Antitumor funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland (Video) | JoVE

Modellering brystkræft via en intraductal injektion af CRE-udtrykker adenovirus i mus Brystkirtlen

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture (Video) | JoVE

Evaluering af differentierings kapaciteten af mus prostata Epiteliale celler ved hjælp af Organoid kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...