Name: rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de Hollings Cancer Center's Cancer Center Support Grant P30 CA138313 pilot onderzoeksfinanciering van de National Institutes of Health<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">(https://www.nih.gov/),</a>en fondsen van de afdeling Pathologie & Laboratoriumgeneeskunde aan de Medische Universiteit van South Carolina. We willen Marijne Smiths bedanken voor het opnemen van de interviewverklaringen.

Alle dieren werden gehuisvest en onderhouden in een aaalac-goedgekeurde faciliteit, en experimenten beschreven in dit protocol werden goedgekeurd door het MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Dieren die bij wederkerige transplantatie worden gebruikt, moeten een ingeteelde of isogene stam zijn, met een congene status die de voorkeur heeft of gedurende ten minste 6 generaties wordt gekruist.
1. Oogsten donorrat borstklier epitheel
<ol><li>Bepaal het aantal donorratten dat no...

Dit protocol beschrijft een borstepitheel celtransplantatie techniek geoptimaliseerd voor het werken met ratten. Geïsoleerde borstepitheele-organoïden van donorratten (3-5 weken oud) worden geënt in het interscapulaire witte vetkussen van de ontvangende ratten (ook 3-5 weken oud). Resultaten kunnen worden geïnterpreteerd zo weinig als 4-6 weken later, met behulp van lichte microscopie om het geënte weefsel te onderzoeken; De optimale tijd tussen transplantatie en opoffering moet echter worden bepaald voordat een vol...

Postnatale borstklier ontwikkeling en ductalmorfogenese zijn processen grotendeels beïnvloed door hormonale signalering aan het begin van de puberteit. Bij muizen en ratten, veelgebruikte modelorganismen van de borstklierbiologie, begint dit proces rond 3 weken oud, waar snelle proliferatie en differentiatie resulteren in de vorming van de volwassen parenchyma. De rijpe borstklier kan ondergaan talrijke rondes van expansie en involutie, een eigenschap die is onderzocht sinds het begin van de20e eeuw. In het kader van hyperproliferatie en kankerontwikkeling werden in de jaren vijftig1transplantatietechnieken voor de borstklier ontwikkeld en versterkt door de kwantitatieve methodologie die Gould et al. in 19772,3,4heeft bijgedragen . Verfijning van de transplantatie techniek bij knaagdieren heeft bijgedragen aan grote vooruitgang in het begrijpen van de normale borstklier biologie die nog steeds op grote schaal worden gebruikt om het effect van verschillende behandelingen en genetische manipulatie op de normale borstklier ontwikkeling en ziekte staten te bestuderen.
Veel hypothesen zijn gegenereerd en vervolgens getest met behulp van borstkliertransplantatie, voor het eerst beschreven door DeOme et al. in 19591. Experimenten in verschillende decennia toonden de neiging van ductalweefsel uit donorborstklieren om het hele vetpad5,6,7 opnieuw te bevolken en gaven aan dat een kritieke component van de ontwikkeling van de borstklier in deze epitheelstructuren woont. Latere studies bij muizen toonden aan dat een enkele borststamcel een gewist vetpad kan herbevolken en heeft bijgedragen aan de ontdekking van een enkele, gemeenschappelijke voorloper van basale en luminaire borstepitheelcellen8,9,10. In overeenstemming met deze conclusies is gesuggereerd dat transplantatie de pool van cellen met multilineage-repopulating potentieel als gevolg van plasticiteit verhoogt, waardoor de geënte cellen een functionele borstklierkunnenlaten groeien 7,10,11,12,13. Belangrijk is dat het gebruik van transplantatietechnieken bij knaagdieren de beperkingen van celkweek-geïnduceerde afwijkingen overwint14 en vaak resultaten oplevert in slechts een kwestie van weken.
Terwijl de procedure oorspronkelijk werd beschreven in de context van preneoplastische laesies bij muizen, werd het al snel uitgebreid tot ratten en gebruikt in combinatie met de carcinogene behandeling om multipliciteit vast te stellen als een maatregel van de gevoeligheid van kanker15, maar de populariteit van transplantatie technieken heeft gevolgd de ontwikkeling van genetische instrumenten voor elke soort. Hoewel muisstudies waarin transplantatie is opgenomen, veel translationele bevindingen hebben bijgedragen, lijkt de haakse van de rattenborstklier op de mens dichterop 16,17 en biedt verschillende voordelen voor het bestuderen van oestrogeenreceptor-positieve (ER+) borstkanker. Borsttumoren zijn in ducible in beide soorten, maar ze verschillen in termen van hormoongevoeligheid en genexpressie profielen. Een primair verschil is dat rat borsttumoren uitdrukken en afhankelijk zijn van de functie van eierstokkanker en hypofyse hormoonreceptoren, namelijk oestrogeen en progesteron (PR), vergelijkbaar met de luminal-A subtype van de menselijke borstkanker. Inderdaad, borstepitheel epitheel celtransplantatie, zoals beschreven in dit protocol, is gebruikt om genetische varianten die betrokken zijn bij borstkanker te bestuderen en de cellulaire autonomie van effecten op borstepitheelcellen te bepalen18.
Naast de tumorbiologie vertoont het ductale epitheel van de normale rattenborstklier een hoger niveau van vertakking en wordt geflankeerd door een dikkere laag stroma dan de muis. Het belang van de stroma is goed gedocumenteerd in borstepitheel epitheliale transplantatie studies. Borstepitheel moet interageren met vette stroma, en idealiter zijn eigen mesenchyme, om zijn karakteristieke morfogenese19,20ondergaan . Entweefsel in een ontvanger borstklier zorgt voor een optimale omgeving; de aanwezigheid van endogene epitheel kan echter de resultaten verstoren. Preclearing de borstklier van endogene epitheel wordt vaak uitgevoerd in muistransplantatie tests en vereist chirurgische excisie van endogene borstweefsel en / of verwijdering van de tepel1,21,22. Hoewel mogelijk, preclearing de borstepitheel in post-spenen ratten is niet zo breed uitgevoerd, vooral te wijten aan de ineffectiviteit van het opruimen van de groeiende borstboom in post-spenende ratten. Aangezien is aangetoond dat gebieden van vetweefsel elders in het lichaam de groei van getransplanteerde borstepitheel21,23,24kunnen ondersteunen, kan het proces van voorclearing gemakkelijk worden vermeden bij ratten door weefsel te enten in het interscapulaire witte vetpad.
De in dit document beschreven transplantatiemethode omvat de injectie van enzymatisch gescheiden borstklierorganoïden (fragmenten van borstkanaalepitheel en andere cellendie morfogenese kunnen) of mono-verspreide cellen in het interscapulaire vetpad in inteelt, isogenische of congene stammen van laboratoriumratten2. Omdat de interscapulaire vetpad normaal gesproken verstoken is van borstweefsel, biedt het een geschikte omgeving voor meerdere transplantatielocaties zonder dat het endogeen epitheel vooraf hoeft te zuiveren. Als gevolg hiervan zijn de endogene, abdominale borstklieren van het gastheerdier niet onderhevig aan chirurgische manipulatie, ontwikkelen zich normaal en kunnen ze de interpretatie van de resultaten niet verstoren. Bovendien kunnen de intacte borstklieren worden gebruikt voor vergelijking om gastheer versus donoreffecten op de borstepitheelontwikkeling en tumorigenese18,25te evalueren. Hoewel herpopulatie van de borstklier uit een enkele stamcel beschikbaar is voor muizen, is deze nog niet ontwikkeld voor ratten, voornamelijk vanwege het gebrek aan beschikbaarheid van antilichamen om te selecteren voor ratborststamcellen25,26,27. Desondanks kan transplantatie van monodispersed borstepitheelcellen om repopulating potentieel te kwantificeren met succes worden uitgevoerd, en die cellen zullen zich normaal ontwikkelen wanneer ze in het juiste kader2,3,4worden geënt. Hoewel organoïden voor vele doeleinden goed zijn, zijn monodispersed cellen nodig voor kwantitatieve toepassingen, bijvoorbeeld om het aantal borstepitheelcellen te bepalen dat nodig is voor de kankerinitiatie na ioniserende bestraling28 of voor het vergelijken van kenmerken van flow cytometrisch geselecteerde borstepitheelcelpopulaties29.
Tot op heden, de procedure hier beschreven is de meest robuuste methode van het uitvoeren van borstklier transplantatie in de rat met een algemeen doel van het bestuderen van borstklier ontwikkeling en mechanismen die ten grondslag liggen borstkanker ontwikkeling. Vaak worden de donor- en/of ontvangende dieren vóór, tijdens of na de epitheeltransplantatie blootgesteld aan verschillende variabelen. Voorbeelden hiervan zijn enkelgenstudies met chemische carcinogenese30, straling28,31,32, genetische manipulatie van gastheer/donorgenoom18en hormonale manipulatie12. Een groot voordeel van de enzymatische dissociatie beschreven in dit protocol is de mogelijkheid om epitheliale organoïden of monodispersed cellen te isoleren voor complementaire experimenten met flow cytometrie, 3-D cultuur, genbewerking, en nog veel meer. Toekomstige toepassingen van deze techniek zullen aanvullende manipulatie van donor- en/of gastheerweefsel met genetische manipulatie omvatten. Donorcellen kunnen bijvoorbeeld genetisch worden gewijzigd ex vivo op elke gekozen genomische locus met behulp van het CRISPR-Cas9 genbewerkingssysteem. Op dezelfde manier kunnen ontvangers ratten ook genetisch worden gewijzigd om de interactie tussen donor en ontvanger gemanipuleerde genetische factoren te bestuderen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;M syringe filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-715G</td>
			<td>sterile-filtering collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td>filtering brain homogenate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 uL gastight syringes with 25 gauge needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81001 &#38; 90525</td>
			<td>For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 uL pipette tips + pipette</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>transferring cells/mixtures/tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352196</td>
			<td>brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td>filtering organoids after washing the cell pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td>for collagenase digestion of donor mammary gland tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130181</td>
			<td>for mincing tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alum Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>243361/237086</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer for veterinary use</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-dine or iodine</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass culture tube for homogenization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carmine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6152/1022</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting apparatus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean animal cages for recovery</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 3</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS004183</td>
			<td>enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for chemical solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11320033</td>
			<td>for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705/2701</td>
			<td>mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>-</td>
			<td>inactivation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-212</td>
			<td>use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pads</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets (x2)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital rotation</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>must be capable of maintaining 37&#176;C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthesia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope or digital camera</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>TissueMiser or alternative models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>long-term storage of cleared mammary gland whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks for anesthesia vaporizer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels or delicate task wipes</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively-charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P4981-001</td>
			<td>mammary gland tissue whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postoperative analgesic</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>electric clippers, or other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jars</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile field drapes</td>
			<td>IMCO</td>
			<td>4410-IMC</td>
			<td>used during transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclave surgical tools used for donors and recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes: 5 mL (or greater)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for sterile filtration of collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td></td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier, clips, and removal tool</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12020-00</td>
			<td>Closing the skin incision over the interscapular white pad pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>clearing mammary gland whole mount slides after staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad

Al in de jaren 1970 hebben onderzoekers met succes getransplanteerde borstepitheelcellen in de interscapulaire witte vet pad van ratten. Enten van borstepitheel met behulp van transplantatietechnieken maakt gebruik van de hormonale omgeving die wordt geboden door de adolescente knaagdiergastheer. Deze studies zijn bij uitstek geschikt om de impact van verschillende biologische manipulaties op de ontwikkeling van de borstklier te onderzoeken en vele aspecten van de borstklierbiologie te ontleden. Een gemeenschappelijk, maar beperkend kenmerk is dat getransplanteerde epitheelcellen sterk worden beïnvloed door de omringende stroma en worden overconcurreerd door endogene epitheel; om inheemse borstweefsel te gebruiken, moet het buik-inguinale witte vetpad worden gewist om gastheer borstepitheel voorafgaand aan de transplantatie te verwijderen. Een belangrijk obstakel bij het gebruik van het rattenmodel organisme is dat het opruimen van de zich ontwikkelende borstboom in post-gesaneerde ratten niet efficiënt is. Wanneer getransplanteerd in kliervrije vetpads, donor epitheliale cellen kunnen herbevolken de gewiste gastheer vet pad en vormen een functionele borstklier. De interscapulaire vet pad is een alternatieve locatie voor deze grafts. Een groot voordeel is dat het geen ductalstructuren heeft, maar de normale stroma biedt die nodig is om epitheeluitgroei te bevorderen en gemakkelijk toegankelijk is in de rat. Een ander groot voordeel van deze techniek is dat het minimaal invasief is, omdat het de noodzaak elimineert om de groeiende endogene borstboom te cauteriseren en te verwijderen. Bovendien bevat de interscapulaire vetpad een mediale bloedvat dat kan worden gebruikt om plaatsen voor enting te scheiden. Omdat de endogene klieren intact blijven, kan deze techniek ook worden gebruikt voor studies die de endogene borstklier vergelijken met de getransplanteerde klier. Dit document beschrijft de methode van borstepitheelceltransplantatie in het interscapulaire witte vetstootkussen van ratten.

Donor en ontvanger borstklieren De stappen om rattenborstepitheelcellen te isoleren en voor te bereiden op transplantatie zijn weergegeven in figuur 1A. Op de leeftijd van 4 weken is de endogene borstklier van de donorrat begonnen met rijping en kan epitheel op geheel gemonteerde glijbanen worden gevisualiseerd die zijn gekleurd met aluincarmine(figuur 1B)....

Watch this Scientific Journal Video about Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad at JoVE.com

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad (Video) | JoVE

Dit artikel beschrijft een transplantatiemethode om donorrattenborstepitheelcellen te transplanteren in het interscapulaire witte vetkussen van de ontvangende dieren. Deze methode kan worden gebruikt om gastheer- en/of donoreffecten op de ontwikkeling van borstepitheel te onderzoeken en elimineert de noodzaak van pre-clearing, waardoor het nut van deze techniek wordt uitgebreid.

Rat Mammary Epitheliale Celtransplantatie in de Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Dit protocol wordt al meer dan 40 jaar gebruikt en blijft de enige betrouwbare methode voor borstceltransplantatietesten bij de rat. Deze methode wordt veel gebruikt om borstcel autonome versus gastheer effecten in borstkanker gevoeligheid onderzoek te ondervragen. Door in het interscapulaire vetpad te enten, omzeilt deze methode het moeten wissen van het endogene membraaneptheel dat niet effectief is bij ratten.De methode is daarom minder invasief en de endogene borstklieren kunnen worden gebruikt als een interne controle. Om deze procedure te beginnen, plaats een geëuthanaseerde vrouwelijke rat op zijn rug en beveilig het met pinnen. Besproei het gehele ventrale oppervlak met 70% ethanol.Maak een sagittale Y-vormige incisie waardoor toegang tot thoracale, buik- en inguinale borstklieren. Gebruik een schaar om al het borstklierweefsel van de donorrat te ontleden en alle zichtbare lymfeklieren te verwijderen. Gebruik vervolgens tangen om het borstweefsel te extraheren.Plaats het in een gelabelde 60 millimeter schotel met 500 microliters van serum-vrije DMEM F12 media en houd het op ijs. Gebruik dan een schaar om het borstweefsel fijn te gehakt. Draai eerst voorzichtig het lichaam van het donordier om om het in een gevoelige positie te plaatsen en vast te zetten met pinnen.Spray de kop en bovenrug met 70% ethanol. Zoek de basis van de schedel en maak een incisie onder de occipitale condyles, steek een scherpe schaar onder de huid en snijd de huid uit de buurt van de schedel met inbegrip van de zijkanten van het hoofd. Gebruik vervolgens botsnijders of sterke scharen om de schedel langs de middellijn te snijden van de occipital tot frontale botten, terwijl u ervoor zorgt dat het blad zo oppervlakkig mogelijk en schuin omhoog te houden om de vernietiging van het onderliggende hersenweefsel te voorkomen.Gebruik Rongeurs of sterke tangen om het bot weg te pellen. Plaats het gereedschap lateraal in het cerebellum om het bot aan weerszijden te breken. Verbreken de verbindingen met de hersenvliezen door het gehoorkanaal volledig bloot te stellen.Gebruik gebogen fijngebogen tangen om de hersenen uit de schedel te tillen en het gewicht vast te leggen. Gebruik een nieuwe start van de leveringen voor extra donor hersenen. Breng het onmiddellijk over naar een buis van 15 milliliter met een gelijke hoeveelheid media die op ijs is opgeslagen.Homogenize de hersenen voor 10 tot 15 seconden op een lage snelheid. Vervolgens filter het homogenaat om grote stukken te verwijderen. Bewaar de vloeistof op ijs tot dat nodig is.Snijd eerst een centimeter van het einde van een 1.000 microliter pipetpunt en plaats deze handmatig op de pipet. Gebruik een gesneden pipettip om het gehakte donorweefsel van elke 60 millimeter schotel over te brengen naar de collagenase spijsverteringsbuis. Meng het gehakt weefsel voorzichtig door het een tot twee keer op en neer te pipetten.Zet de monsters vervolgens in een horizontale positie in de schuddende couveuse. Laat de monsters 1,5 tot twee uur verteren bij 37 graden Celsius terwijl u schudt bij een snelheid tussen 200 en 220 rpm. Wanneer het donorklierweefsel volledig wordt verteerd, centrifugeren de suspensie op 1,200 keer g en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Nadat u ervoor hebt gezorgd dat een pellet is gevormd, gebruikt u een pipet om de vetlaag te verwijderen of giet u voorzichtig de supernatant af. Voorzichtig resuspend de pellet in 10 milliliter verse DMEM F12 media. Herhaal dit proces om de cellen grondig te wassen.Bereid een 50 milliliter buis met een 40 micrometer zeef voor elk donordier. Pre-nat de zeef met ten minste een milliliter van DMEM F12 media. Gebruik vervolgens een pipet om de celsuspensie door het filter te laten gaan om ductale fragmenten of organoïden te verzamelen.Voor organoïden, bewaar alleen de cellen die in het filter blijven. Keer de celzeef over een nieuwe buis van 50 milliliter en spoel af met elk volume steriele media dat nodig is om alle cellen te verzamelen. Na deze, pellet de cellen nogmaals en resuspend in een klein volume van de media voor het tellen.Bereid enkele partijen donormateriaal voor alle transplantatieontvangers door gelijke volumes van de celsuspensie te combineren met 50% hersenhomogenaat voor elke plaats van transplantatie. Identificeer eerst de basis van de schedel en begin van de wervelkolom op een ontvangend dier. Ongeveer een derde van de weg langs de wervelkolom, scheer een drie centimeter bij twee centimeter gebied op de bovenste thoracale gedeelte van de rug.Bereid vervolgens het steriele veld voor dat zal worden gebruikt voor een operatie en schik alle benodigde benodigdheden. Spoel de Hamilton spuiten met steriele DMEM F12 media om het verlies van cellen te voorkomen. Laad het volledige volume donormateriaal in een aparte spuit voor elke aandoening.Nadat de spuit volledig is geladen, omkeren en druk op de zuiger iets om luchtbellen te verwijderen aan het uiteinde van de naald. Houd de spuit op ijs gedurende de procedure. Zorg ervoor dat het dier niet reageert op diepe prikkels met een stevige teensnuifje.Gebruik vervolgens een scherp chirurgisch mes om een kleine interscapulaire incisie te maken. Zoek het mediale bloedvat voor oriëntatie en gebruik tangen om de huid op te heffen aan de ene kant van de incisie. Houd de huid uit de buurt van het vetpad en vermijd het onderliggende bruine vet terwijl de transplantatie wordt uitgevoerd.Steek vervolgens de naald in de graftplaats. Injecteer voorzichtig 40 microliter van het celmengsel in het interscapulaire witte vetstootkussenweefsel. Verwijder de naald langzaam.Houd het weefsel op zijn plaats en laat de getransplanteerde cellen drie tot vijf seconden regelen. Herhaal de volledige injectieprocedure zoals eerder beschreven op de tweede plaats van transplantatie. Sluit hierna de chirurgische wond met wondklemmen of hechtingen en stop vervolgens met de anesthesie.Na het offeren van het dier, bereid het voor op dissectie. Identificeer het mediale bloedvat dat de graft sites in de interscapulaire vetpad scheidt. Accijns het hele pad als een enkel stuk weefsel.Plaats het weefsel op een positief geladen microscoop dia voor hele mount. Plaats de dia's in 70%ethanol gedurende zeven tot 10 dagen om het weefsel te de-vet. Bereid vervolgens de aluinkarmijnvlek voor en verwerk de glijbanen wanneer het weefsel voldoende ondoorzichtig is.Wanneer de verwerking is voltooid en het weefsel op de dia is gewist, gebruik maken van low powered light microscopie of hoge resolutie digitale fotografie om beelden van de dia's te verwerven voor analyse. In deze studie worden borstepstelcellen getransplanteerd met behulp van een techniek die is geoptimaliseerd voor het werken met ratten waarbij de geïsoleerde borsteppitheelorganoïden van donorratten worden geënt in het interscapulaire witte vetpad van ontvangende ratten. De aanwezigheid, afwezigheid of overvloed aan epitheel kan worden geëvalueerd om het succes van het experiment te bepalen, evenals de autonomie van effecten in verband met experimentele variabelen.Een wederkerig transplantatie experiment waarbij elke factor heeft twee niveaus, zoals wilde type versus knock-out zal leiden tot vier transplantatie groepen voor hypothese testen. De representatieve hele gemonteerde interscapulaire vet pad hier getoond bevat positieve epitheliale uitgroei op beide plaatsen van transplantatie. Bij het analyseren van de dia's kan het ontbreken van epitheel in het interscapulaire vetpad in veel monsters wijzen op een technisch probleem met de procedure en moet het worden behandeld als een negatief resultaat.Donor epitheeluitgroei kan ook worden vergeleken met de endogene borstklier en kan vergemakkelijken aanvullende conclusies. In het hier getoonde voorbeeld suggereerden de resultaten van wederzijdse transplantatie met behulp van wildtype- en CDKN1B-knock-outratten autonome effecten van niet-borstcel op de ontwikkeling van borstklieren. Vergeet niet donor epitheelcellen en organoïden moet zorgvuldig worden voorbereid en in leven gehouden totdat geïnjecteerd in de ontvanger dier.Het is absoluut noodzakelijk om vooruit te plannen en de procedure zorgvuldig en zonder onderbrekingen uit te voeren. Primaire carcinogenese testen kunnen worden uitgevoerd na transplantatie om de autonomie van de borstcel in de etiologie of behandeling van borstkanker te ondervragen. Genbewerking kan ook worden opgenomen om de donorcellen of de ontvangende rat genetisch te technicusen.Als enige methode voor het uitvoeren van borstepitheelceltransplantatie bij ratten, vergemakkelijkt deze procedure de ontwikkeling van borstklieren en carcinogenese studies. Deze techniek is vooral belangrijk voor het onderzoeken van interacties tussen borstkankercellen en/of borstepstelcellen met de gastheermicro-omgeving. Het maakt studies in borstklier ontwikkeling en borstkanker onderzoek.Degenen die deze techniek voor de eerste keer proberen, moeten de preparaten van donorcellen optimaliseren om een maximale celopbrengst en levensvatbaarheid te garanderen, vervolgens kleine proefexperimenten uitvoeren om chirurgische ingrepen te oefenen en celnummers te bepalen om te injecteren en ook postchirurgische incubatietijden bepalen die nodig zijn voor experimenten.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis (Video) | JoVE

Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van<em&gt; De Novo</em&gt; Maagkanker Metastase

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response (Video) | JoVE

Transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60 (Video) | JoVE

Live-imaging van borst epitheliale cel migratie na de voorbijgaande uitputting van TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE

Voorwaardelijke Knockdown van genexpressie in kanker cellijnen te bestuderen van de aanwerving van monocyten/macrofagen naar de Tumor communicatie

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation (Video) | JoVE

Een muismodel van Syngeneic Pancreatic kanker te bestuderen van de gevolgen van onomkeerbaar Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad (Video) | JoVE

Orthotopic injectie van borstkankercellen in de borstklier vet Pad muizen

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function (Video) | JoVE

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland (Video) | JoVE

Het modelleren van borstkanker via een Intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in de muis borstklier

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture (Video) | JoVE

Evaluatie van de differentiatie capaciteit van muizen prostaat epitheelcellen met behulp van Organoid cultuur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells (Video) | JoVE

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...