Name: rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00
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この研究は、国立衛生研究所<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">(https://www.nih.gov/)</a>からのホリングスがんセンター支援助成金P30 CA138313パイロット研究資金とサウスカロライナ医科大学病理学研究所医学部からの資金によって資金提供されました。インタビューの声明を録音してくれたマリイネ・スミスに感謝します。

すべての動物はAAALAC認可施設に収容され、維持され、このプロトコルに記載された実験は、MUSC機関動物保護および使用委員会(IACUC)によって承認されました。相互移植に使用する動物は近親交配または等原性株であるべきであり、少なくとも6世代のコンジェニック状態が好ましいまたは後方交差する。
1. ドナーラット乳腺上皮の収穫
<ol><li>移植に必要なドナーラットの...

このプロトコルは、ラットを操作するために最適化された乳腺上皮細胞移植技術を記述する。ドナーラットから単離された乳腺上皮オルガノイド(3〜5週齢)は、レシピエントラットの間肩膜白色脂肪パッド(また3〜5週齢)に移植される。結果は、わずか4〜6週間後に、移植された組織を調べるために軽顕微鏡を使用して解釈することができる。しかし、移植と犠牲の間の最適な時間は、完全な実...

出生後の乳腺の発生および乳管形態形成は、主に思春期の発症時のホルモンシグナル伝達の影響を受けるプロセスである。乳腺生物学の一般的に使用されるモデル生物であるマウスおよびラットでは、このプロセスは約3週齢から始まり、急速な増殖と分化が成熟したパレンチマの形成をもたらす。成熟した乳腺は、20世紀初頭から調査中の拡張とインボル化の多数のラウンドを受けることができます。過剰増殖と癌の発症の文脈の中で、乳腺移植技術は1950年代1に開発され、1977年2、3、4年にGouldらによって寄与された定量的方法論によって増強された。げっ歯類の移植技術の改良は、正常な乳腺の発達および疾患状態に対する様々な治療および遺伝子操作の効果を研究するためにまだ広く使用されている正常な乳腺生物学を理解する上で大きな進歩に貢献している。
多くの仮説が生成され、その後、乳腺移植を使用してテストされています,最初にDeOmeらによって記述されました 1 . 1.数十年にわたる実験は、ドナー乳腺から切除された乳腺の切断の傾向を示し、脂肪パッド5、6、7全体を再移植し、乳腺発達の重要な成分がこれらの上皮構造に存在することを示した。マウスの後の研究は、単一の乳腺幹細胞がクリアされた脂肪パッドを再取り込みできることを示し、基底および明尿乳上皮細胞8、9、10の単一の共通の前駆細胞の発見に寄与した。これらの結論に沿って、移植は可塑性の結果として多系統的に再人口化する可能性を有する細胞のプールを増加させ、移植された細胞が機能的な乳腺7、10、11、12、13を成長させることが示唆されている。重要なことに、げっ歯類における移植技術の使用は、細胞培養誘発異常14の限界を克服し、多くの場合、わずか数週間で結果を提供する。
この処置はもともとマウスの前生性病変の文脈で説明されていたが、すぐにラットに拡大され、癌感受性15の尺度として多重性を確立するために発がん性治療と組み合わせて使用されたが、移植技術の人気は各種の遺伝的ツールの開発に続いている。移植を組み込んだマウス研究は多くの翻訳所見を占めているが、ラット乳腺のまん性はヒトに似ている16,17で、エストロゲン受容体陽性(ER+)乳癌を研究する上で明確な利点を提供する。乳腺腫瘍は両方の種で誘導可能であるが、それらはホルモン感受性および遺伝子発現プロファイルの点で異なる。主な違いは、ラット乳腺腫瘍が、ヒト乳癌の発光A亜型と同様に、卵巣および下垂体ホルモン受容体、すなわちエストロゲンおよびプロゲステロン(PR)の機能を発現し、依存することである。実際、乳腺上皮細胞移植は、このプロトコルに記載されているように、乳癌に関与する遺伝的変異体を研究し、乳腺上皮細胞18に及ぼす効果の細胞自律性を決定するために使用されている。
腫瘍生物学に加えて、正常ラット乳腺の管上皮は、より高いレベルの分岐を示し、マウスよりも深い間質層によって横たわっている。間質の重要性は、乳腺上皮移植研究において十分に文書化されている。乳腺上皮は脂肪間質と相互作用しなければならず、理想的には、その特徴的な形態形成19、20を受けるために、それ自身の間感覚と相互作用しなければならない。レシピエント乳腺に組織を移植することは最適な環境を提供します。しかし、内因性上皮の存在は結果を妨げる可能性があります。内因性上皮の乳腺を事前にクリアすることは、マウス移植アッセイで一般的に行われ、内因性乳腺組織の外科的切除および/または乳頭1、21、22の除去を必要とする。可能であるが、後の乳腺の前皮を前取りするラットは、主に後乳枝ラットの成長する乳腺の木を取り除く効果がないため、それほど広く行われない。体の他の場所で脂肪組織の領域が移植乳上皮21、23、24の成長を支えることができることが示されているので、プリクリアリングのプロセスは、組織を中小体白脂肪パッドに移植することによってラットで容易に回避することができる。
本論文に記載された移植方法は、酵素的に解ソシエアされた乳腺オルガノイド(乳管上皮および形態形成が可能な他の細胞タイプの断片)または単分散細胞を近交交型の間帯脂肪パッドに注射することを含む、実験室ラット2の間蓋脂肪パッドへの単分散性株。間肩甲膜脂肪パッドは通常乳腺組織を欠いているため、内因性上皮を事前に透明にする必要なしに、複数の移植部位に適した環境を提供する。その結果、宿主動物の内因性、腹部を肛門の乳腺は外科的操作の対象とならず、正常に発達し、結果の解釈を妨げることはできない。さらに、無傷の乳腺は、乳腺上皮発生および腫瘍形成18、25に対する宿主対ドナー効果を評価するための比較に使用することができる。単一幹細胞からの乳腺の再集団化はマウスに利用可能であるが、ラットに対してはまだ開発されておらず、主にラット乳腺幹細胞25、26、27に対して選択する抗体の入手可能性の欠如のためである。それにもかかわらず、単分散乳上皮細胞の移植は、再入可能な可能性を定量するためには成功し、それらの細胞は適切なフレームワーク2、3、4に移植すると正常に発達する。オルガノイドは多くの目的に適しているが、単分散細胞は定量的用途に必要であり、例えば、イオン化放射線治療28の後の癌開始に必要な乳腺上皮細胞の数を決定するか、または細胞学的に選択されたリンパ球上皮細胞集団29のフローの特性を比較する。
現在までに、ここで説明されている手順は、乳腺の発達と乳癌の発達の根底にあるメカニズムを研究するという全体的な目標を持つラットで乳腺移植を行う最も堅牢な方法である。多くの場合、ドナーおよび/またはレシピエント動物は、上皮移植の前、中、または後に異なる変数にさらされる。例としては、化学発癌30、放射線28、31、32、宿主/ドナーゲノム18の遺伝子操作、およびホルモン操作12を含む単一遺伝子研究が含まれる。本プロトコルに記載されている酵素解離の主な利点は、フローサイトメトリー、3D培養、遺伝子編集などを伴う相補的実験のために上皮オルガノイドまたは単分散細胞を単離する機会である。この技術の将来の応用には、遺伝子工学によるドナーおよび/または宿主組織の追加操作が含まれる。例えば、ドナー細胞はCRISPR−Cas9遺伝子編集システムを用いて選択されたゲノム遺伝子座において、任意のゲノム座座において遺伝的に改変され得る。同様に、レシピエントラットは、ドナーとレシピエントの遺伝子因子の相互作用を研究するために遺伝子的に改変することもできる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;M syringe filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-715G</td>
			<td>sterile-filtering collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td>filtering brain homogenate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 uL gastight syringes with 25 gauge needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81001 &#38; 90525</td>
			<td>For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 uL pipette tips + pipette</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>transferring cells/mixtures/tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352196</td>
			<td>brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td>filtering organoids after washing the cell pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td>for collagenase digestion of donor mammary gland tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130181</td>
			<td>for mincing tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alum Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>243361/237086</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer for veterinary use</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-dine or iodine</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass culture tube for homogenization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carmine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6152/1022</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting apparatus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean animal cages for recovery</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 3</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS004183</td>
			<td>enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for chemical solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11320033</td>
			<td>for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705/2701</td>
			<td>mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>-</td>
			<td>inactivation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-212</td>
			<td>use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pads</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets (x2)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital rotation</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>must be capable of maintaining 37&#176;C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthesia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope or digital camera</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>TissueMiser or alternative models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>long-term storage of cleared mammary gland whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks for anesthesia vaporizer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels or delicate task wipes</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively-charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P4981-001</td>
			<td>mammary gland tissue whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postoperative analgesic</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>electric clippers, or other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jars</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile field drapes</td>
			<td>IMCO</td>
			<td>4410-IMC</td>
			<td>used during transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclave surgical tools used for donors and recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes: 5 mL (or greater)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for sterile filtration of collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td></td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier, clips, and removal tool</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12020-00</td>
			<td>Closing the skin incision over the interscapular white pad pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>clearing mammary gland whole mount slides after staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad

早くも1970年代に、研究者は乳腺上皮細胞をラットの肩甲膜間白い脂肪パッドに移植しました。移植技術を用いた乳腺上皮移植は、思春期のげっ歯類宿主が提供するホルモン環境を利用する。これらの研究は、様々な生物学的操作が乳腺の発達に及ぼす影響を探求し、乳腺生物学の多くの側面を解剖するのに理想的である。一般的な、しかし制限的な特徴は、移植された上皮細胞が周囲の間質によって強く影響され、内因性上皮によって競争されるということです。ネイティブの乳腺組織を利用するには、移植前に宿主乳腺上皮を除去するために腹部の、うろたえの白い脂肪パッドをクリアする必要があります。ラットモデル生物を使用する際の大きな障害は、後産ラットで発達中の乳腺の木を取り除くのが効率的ではないということです。腺のない脂肪パッドに移植すると、ドナー上皮細胞は、クリアされた宿主脂肪パッドを再移植し、機能的な乳腺を形成することができる。間肩甲膜脂肪パッドは、これらの移植片のための代替位置です。主な利点は、それがまだ上皮の成長を促進するために必要であり、ラットで容易にアクセス可能である正常な間質を提供する導管構造を欠いているということです。この技術のもう一つの大きな利点は、それが焼灼し、成長する内因性乳腺の木を除去する必要性を排除するので、それは、最小限の侵襲性であるということです。さらに、中小肩甲膜脂肪パッドは、移植のための部位を分離するために使用することができる内側血管を含む。内因性腺はそのまま残るため、この技術は、内因性乳腺と移植された腺を比較する研究にも使用できます。本論文はラットの間肩甲膜白色脂肪パッドへの乳腺上皮細胞移植法について述べている。

ドナーとレシピエント乳腺 移植用ラット乳腺上皮細胞を単離して調製するステップを図1Aに示す。生後4週齢では、ドナーラットの内因性乳腺が成熟を開始し、上皮は、ミョウバンカルミンで染色された全ての取り付けスライド上で可視化することができる(図1B)。</stro...

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Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

本稿では、レシピエント動物の間肩甲膜白色脂肪パッドにドナーラット乳腺上皮細胞を移植する移植方法について説明する。この方法は、乳腺上皮発生に対する宿主および/またはドナーの影響を調べるために使用することができ、事前にクリアする必要がなくなり、この技術の有用性を拡張する。

間肩甲膜白脂肪パッドへのラット乳腺上皮細胞移植

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

このプロトコルは40年以上使用されており、ラットの乳腺細胞移植アッセイの唯一の信頼できる方法です。この方法は、乳がん感受性研究における乳腺細胞自律対宿主効果を問い取るために広く使用されている。この方法は、肩間脂肪パッドで移植することにより、ラットに有効でない内因性膜上皮をクリアする必要がある。したがって、この方法は侵襲性が低く、内因性乳腺を内部制御として使用することができる。この手順を開始するには、安楽死させた雌のラットを背中に置き、ピンで固定します。腹側表面全体に70%エタノールをスプレーします。矢状のY字型切開を行い、胸部、腹部、およびインギナル乳腺へのアクセスを可能にする。ドナーラットからすべての乳腺組織を解剖し、目に見えるすべてのリンパ節を除去するためにはさみを使用してください。次に、鉗子を使用して乳腺組織を抽出する。500マイクロリットルの無血清DMEM F12培地を含むラベル付き60ミリメートル皿に入れ、氷の上に保管します。その後、はさみを使用して乳腺組織を細かくミンチします。まず、ドナー動物の体を慎重にひっくり返して、それを起こしやすい位置に置き、ピンで固定します。ヘッドと上部の背部に70%エタノールを吹き付けます。頭蓋骨の基部を見つけ、後頭部コンディルの下に切開を行い、皮膚の下に鋭いはさみを挿入し、頭の側面を含む頭蓋骨から皮膚を切り取ります。次に、骨カッターまたは強いはさみを使用して、後頭部から前頭骨に沿って頭蓋骨を切断し、ブレードを可能な限り表面的に保ち、基礎となる脳組織の破壊を防ぐために上向きに傾けます。骨を剥がすために、ロンガまたは強い鉗子を使用してください。小脳にツールを横に挿入して、両側の骨を折ります。完全に聴覚運河を露出させることによって髄液への接続を切断します。頭蓋骨から脳を持ち上げ、その重量を記録するために湾曲した細かい先端の鉗子を使用してください。追加のドナーの脳のための供給の新しいスタートを使用してください。すぐに氷の上に保存されているメディアの同じ量を含む15ミリリットルのチューブにそれを転送します。低速で10〜15秒間脳を均質化します。次に、ホモジュネートをフィルターして大きな部分を取り除きます。必要になるまで氷の上に液体を保管してください。まず、1,000マイクロリットルのピペットチップの端から1センチメートルを切り取り、手動でピペットの上に置きます。カットピペットチップを使用して、各60ミリメートル皿からコラゲターゼ消化管にひき肉ドナー組織を移します。みじん切り組織を1~2回上下にピペット化して軽く混ぜます。次に、振盪インキュベーター内の水平位置にサンプルを固定します。200~220RPMの速度で振りながら、37°Cで1.5~2時間消化します。ドナー乳腺組織が完全に消化されると、懸濁液を1,200倍g、摂氏4度で10分間遠心分離する。ペレットが形成されたことを確認した後、ピペットを使用して脂肪層を取り除くか、上清を慎重に注ぎます。新鮮なDMEM F12培地の10ミリリットルにペレットを静かに再懸濁します。このプロセスを繰り返して、細胞を完全に洗浄します。すべてのドナー動物のための40マイクロメートルのストレーナーと1つの50ミリリットルの管を準備する。DMEM F12培地の少なくとも1ミリリットルでストレーナーを予湿する。次に、ピペットを使用して細胞懸濁液をフィルターを通して、管状の断片またはオルガノイドを収集します。オルガノイドの場合は、フィルターに残っている細胞のみを保持します。新しい50ミリリットルチューブ上の細胞ストレーナーを反転し、すべての細胞を収集するために必要な無菌培地の任意のボリュームですすいでください。この後、細胞をもう一度ペレットし、カウント用の少量の培地で再懸濁する。移植の各部位に対して50%の脳ホモジネートと細胞懸濁液の等しい量を組み合わせることによって、すべての移植の受容者のためのドナー材料の単一のバッチを準備する。まず、レシピエント動物の頭蓋骨の基部と椎骨柱の始まりを特定する。背骨の下の約3分の1は、背中の上部胸部に3センチメートル2センチメートルの領域を剃る。次に、手術に使用される無菌フィールドを準備し、必要なすべての物資を手配します。細胞の損失を防ぐために、無菌DMEM F12メディアでハミルトン注射器を洗い流します。各条件に対して、ドナー材料の全容を別々のシリンジにロードします。注射器を完全に装填した後、それを反転し、針の先端にある気泡を取り除くためにプランジャーをわずかに押します。手順を通して氷の上に注射器を保管してください。動物がしっかりとつま先のピンチで深い刺激に反応しないことを確認します。その後、鋭い外科用ブレードを使用して、小さな肩甲間切開を行います。方向のための内側血管を見つけ、切開の片側の皮膚を持ち上げるために鉗子を使用する。脂肪パッドから離れて皮膚を保持し、移植が行われている間、下層の茶色の脂肪を避けます.次に、針を移植部位に挿入する。慎重に細胞混合物の40マイクロリットルを間肩白色脂肪パッド組織に注入する。針をゆっくり取り外します。組織を所定の位置に保持し、移植した細胞が3〜5秒間落ち着くようにします。移植の第2の部位で前述したように、全体の注入手順を繰り返す。この後、創傷クリップまたは縫合を使用して外科的創傷を閉じ、麻酔を中止する。動物を犠牲にした後、解剖のためにそれを準備します。肩甲間脂肪パッドの移植部位を分離する内側血管を特定します。パッド全体をティッシュの一部として物品物品切り出し。ティッシュを正に帯電した顕微鏡スライドに置き、全体のマウントを行います。スライドを70%エタノールに7〜10日間入れ、組織の脂肪を取り出します。その後、ミョウバンカルミン染色を調製し、組織が十分に不透明なときにスライドを処理します。処理が完了し、スライド上の組織がクリアされたら、低出力光顕微鏡または高解像度のデジタル写真を使用して、分析のためにスライドの画像を取得します。本研究では、乳腺上皮細胞を、ドナーラットからの単離された乳腺上皮オルガノイドがレシピエントラットの肩甲骨白色脂肪パッドに移植されるラットの働きに最適化された技術を用いて移植される。上皮の存在、不在、または存在量を評価して、実験の成功と実験変数に関連する効果の自律性を決定することができる。各因子が野生型とノックアウトなどの2つのレベルを有する相互移植実験は、仮説テストのための4つの移植群を作成する。代表的な全体の座付け間肩用脂肪パッドは、移植の両方の部位で陽性の上皮の成長を含んでいます。スライドを分析する際、多くのサンプルにわたる肩間脂肪パッド内の上皮の欠如は、手順に技術的な問題があることを示し、否定的な結果として扱われるべきである。ドナー上皮の成長はまた内因性乳腺と比較することができ、追加の結論を促進するかもしれない。ここに示す例では、野生型およびCDKN1Bノックアウトラットを用いた相互移植の結果は、乳腺の発達に対する非乳腺細胞自律的効果を示唆した。ドナー上皮細胞およびオルガノイドは、慎重に調製し、レシピエント動物に注入されるまで生き続けなければならないことを覚えておいてください。事前に計画を立て、慎重に、中断することなく手順を実行することが不可欠です。原発癌アッセイは、乳癌の病因または治療における乳腺細胞の自律性を問い合わすために移植後に行うことができる。遺伝子編集はまた、ドナー細胞またはレシピエントラットを遺伝子操作するために組み込むことができる。ラットにおける乳腺上皮細胞移植を行う唯一の方法として、この手順は乳腺の発達ならびに発癌研究を促進する。この技術は、乳がん細胞および/または乳腺上皮細胞と宿主微小環境との相互作用を研究する上で特に重要である。乳がん研究だけでなく乳腺の開発の研究も可能にします。この技術を初めて試みる人は、ドナー細胞の調製物を最適化して最大の細胞収量と生存率を確保し、手術手順を練習し、注入する細胞番号を決定し、実験に必要な手術後の潜伏時間を決定する小さなパイロット実験を行う必要があります。

Research

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