Name: rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Apoio ao Câncer do Hollings Cancer Center Grant P30 CA138313 financiamento de pesquisa piloto dos Institutos Nacionais de Saúde (<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">https://www.nih.gov/),</a>e recursos do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade Médica da Carolina do Sul. Gostaríamos de agradecer marijne Smiths por gravar as declarações da entrevista.

Todos os animais foram alojados e mantidos em uma instalação aprovada pela AAALAC, e experimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do MUSC (IACUC). Os animais para uso em transplante recíproco devem ser uma cepa intérmata ou isogênica, com status congênico preferido ou recuado por pelo menos 6 gerações.
1. Colheita do doador de mammary glândula epitélio
<ol><li>Determine o número de ratos doadores necessários para t...

Este protocolo descreve uma técnica de transplante de células epiteliais mamáriaotimizada para trabalhar com ratos. Organoides epiteliais mamários isolados de ratos doadores (3-5 semanas de idade) são enxertados na almofada de gordura branca interscapular de ratos receptores (também de 3 a 5 semanas de idade). Os resultados podem ser interpretados apenas 4-6 semanas depois, usando microscopia leve para examinar o tecido enxertado; no entanto, a quantidade ideal de tempo entre transplante e sacrifício deve ser dete...

O desenvolvimento da glândula mamária pós-natal e a morfogênese ductal são processos em grande parte influenciados pela sinalização hormonal no início da puberdade. Em camundongos e ratos, comumente utilizados organismos modelo saem da biologia da glândula mamária, esse processo começa por volta de 3 semanas de idade, onde a rápida proliferação e diferenciação resultam na formação do parenchyma maduro. A glândula mamária madura pode passar por inúmeras rodadas de expansão e involução, uma propriedade que está investigação desde o início do séculoXX. No contexto de hiperproliferação e desenvolvimento do câncer, foramdesenvolvidastécnicas de transplante de glândulas mamárias na década de 1950 , e reforçadas pela metodologia quantitativa contribuída por Gould et al. em 19772,3,4. O refinamento da técnica de transplante em roedores tem contribuído para grandes avanços na compreensão da biologia da glândula mamária normal que ainda são amplamente utilizados para estudar o efeito de vários tratamentos e manipulação genética em estados normais de desenvolvimento de glândulas mamárias e doenças.
Muitas hipóteses foram geradas e posteriormente testadas usando transplante de glândula mamária, descrita pela primeira vez por DeOme et al. em 19591. Experimentos ao longo de várias décadas mostraram a propensão do tecido ductal excida das glândulas mamárias doadoras para repovoar todo o bloco de gordura5,6,7 e indicou que um componente crítico do desenvolvimento da glândula mamária reside nessas estruturas epiteliais. Estudos posteriores em camundongos mostraram que uma única célula-tronco mamária pode repovoar um bloco de gordura limpo e contribuiu para a descoberta de um único progenitor comum de células epiteliais mamárias basais e luminal8,9,10. De acordo com essas conclusões, foi sugerido que o transplante aumenta o pool de células com potencial multilineage-repopulando como resultado da plasticidade, permitindo que as células enxertadas cresçam uma glândula mamária funcional7,10,11,12,13. É importante ressaltar que o uso de técnicas de transplante em roedores supera as limitações das anormalidades induzidas pela cultura celular14 e muitas vezes fornece resultados em apenas uma questão de semanas.
Embora o procedimento tenha sido originalmente descrito no contexto de lesões pré-neoplásticas em camundongos, logo foi expandido para ratos e utilizado em conjunto com o tratamento cancerígeno para estabelecer a multiplicidade como medida de suscetibilidade do câncer15,mas a popularidade das técnicas de transplante tem acompanhado o desenvolvimento de ferramentas genéticas para cada espécie. Embora estudos de camundongos que incorporem o transplante tenham contribuído com muitos achados translacionais, o parenchyma da glândula mamária ratana se assemelha ao humano mais de perto16,17 e oferece vantagens distintas para estudar o câncer de mama receptor-positivo (ER+) de estrogênio. Os tumores mamários são indutíveis em ambas as espécies, mas diferem em termos de sensibilidade hormonal e perfis de expressão genética. A principal diferença é que os tumores mamários de ratos expressam e dependem da função dos receptores hormonais ovarianos e pituitários, ou seja, estrogênio e progesterona (PR), semelhante ao subtipo luminal-A do câncer de mama humano. De fato, o transplante de células epiteliais mamárias, como descrito neste protocolo, tem sido usado para estudar variantes genéticas envolvidas no câncer de mama e determinar a autonomia celular dos efeitos sobre as células epiteliais mamárias18.
Além da biologia tumoral, o epitélio ductal da glândula mamária normal exibe um nível mais alto de ramificação e é ladeado por uma camada mais grossa de estromatário do que o rato. A importância do estroma está bem documentada nos estudos de transplante epitelial mamária. O epitélio mamário deve interagir com estroma gorduroso, e idealmente seu próprio mesenchyme, para se submeter à sua morfogênese característica19,20. O tecido de enxerto em uma glândula mamária receptora fornece um ambiente ideal; no entanto, a presença de epitélio endógeno pode interferir nos resultados. A pré-limpeza da glândula mamária do epitélio endógeno é comumente realizada em ensaios de transplante de camundongos e requer excisão cirúrgica de tecido mamário endógeno e/ou remoção do mamilo1,21,22. Embora possível, a pré-compensação do epitélio mamário em ratos pós-desagrecidos não é tão amplamente realizada, principalmente devido à ineficácia de limpar a crescente árvore mamária em ratos pós-desagrecidos. Uma vez demonstrado que regiões de tecido adiposo em outros lugares do corpo poderiam apoiar o crescimento do epitélio mamário transplantado21,23,24, o processo de pré-limpeza pode ser facilmente evitado em ratos enxertando tecido no bloco de gordura branca interscapular.
O método de transplante descrito neste artigo envolve a injeção de organoides de glândula mamária enzimática (fragmentos de epitélio ductal mamário e outros tipos de células capazes de morfogênese) ou células monodispersas na almofada de gordura interscapular em cepas de ratos de laboratório, isogênicos ou congênicos de ratos de laboratório2. Como a almofada de gordura interscapular é normalmente desprovida de tecido mamário, fornece um ambiente adequado para múltiplos locais de transplante sem a necessidade de pré-limpar o epitélio endógeno. Como resultado, as glândulas mamárias endógenas e abdominais do animal hospedeiro não estão sujeitas à manipulação cirúrgica, desenvolver-se normalmente e não podem interferir na interpretação dos resultados. Além disso, as glândulas mamárias intactas podem ser usadas para comparação para avaliar os efeitos do hospedeiro versus doador no desenvolvimento de epitélio mamário e tumorigênese18,25. Embora a repopulação da glândula mamária de uma única célula-tronco esteja disponível para ratos, ela ainda não foi desenvolvida para ratos, principalmente devido à falta de disponibilidade de anticorpos para selecionar para células-tronco mamárias de ratos25,26,27. Apesar disso, o transplante de células epiteliais mamárias monodispersas para quantificar o potencial de repopulação pode ser realizado com sucesso, e essas células se desenvolverão normalmente quando enxertadas na estrutura apropriada2,3,4. Embora os organoides sejam bons para muitos propósitos, as células monodispersas são necessárias para aplicações quantitativas, por exemplo, para determinar o número de células epiteliais mamárias necessárias para a iniciação do câncer após o tratamento ionizante de radiação28 ou para comparar características do fluxo citometricamente selecionados populações epiteliais epiteliais29.
Até o momento, o procedimento descrito aqui é o método mais robusto de realização do transplante de glândula mamária no rato com o objetivo geral de estudar o desenvolvimento da glândula mamária e os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do câncer de mama. Muitas vezes, os animais doadores e/ou receptores são expostos a diferentes variáveis antes, durante ou após o transplante epitelial. Exemplos incluem estudos genéticos únicos envolvendo carcinogênese química30, radiação28,31,32, manipulação genética do genoma hospedeiro/doador18, e manipulação hormonal12. Uma grande vantagem da dissociação enzimática descrita neste protocolo é a oportunidade de isolar organoides epiteliais ou células monodispersas para experimentos complementares envolvendo citometria de fluxo, cultura 3D, edição de genes e muito mais. Aplicações futuras desta técnica incluirão manipulação adicional de tecido doador e/ou hospedeiro com engenharia genética. Por exemplo, as células doadoras podem ser geneticamente alteradas ex vivo em qualquer lócus genômico escolhido usando o sistema de edição de genes CRISPR-Cas9. Da mesma forma, os ratos receptores também podem ser geneticamente alterados para estudar a interação entre doadores e fatores genéticos projetados por doadores e receptores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;M syringe filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-715G</td>
			<td>sterile-filtering collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td>filtering brain homogenate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 uL gastight syringes with 25 gauge needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81001 &#38; 90525</td>
			<td>For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 uL pipette tips + pipette</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>transferring cells/mixtures/tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352196</td>
			<td>brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td>filtering organoids after washing the cell pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td>for collagenase digestion of donor mammary gland tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130181</td>
			<td>for mincing tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alum Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>243361/237086</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer for veterinary use</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-dine or iodine</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass culture tube for homogenization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carmine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6152/1022</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting apparatus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean animal cages for recovery</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 3</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS004183</td>
			<td>enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for chemical solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11320033</td>
			<td>for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705/2701</td>
			<td>mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>-</td>
			<td>inactivation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-212</td>
			<td>use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pads</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets (x2)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital rotation</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>must be capable of maintaining 37&#176;C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthesia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope or digital camera</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>TissueMiser or alternative models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>long-term storage of cleared mammary gland whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks for anesthesia vaporizer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels or delicate task wipes</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively-charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P4981-001</td>
			<td>mammary gland tissue whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postoperative analgesic</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>electric clippers, or other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jars</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile field drapes</td>
			<td>IMCO</td>
			<td>4410-IMC</td>
			<td>used during transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclave surgical tools used for donors and recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes: 5 mL (or greater)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for sterile filtration of collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td></td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier, clips, and removal tool</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12020-00</td>
			<td>Closing the skin incision over the interscapular white pad pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>clearing mammary gland whole mount slides after staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad

Já na década de 1970, pesquisadores transplantaram com sucesso células epiteliais mamárias na almofada de gordura branca interscapular de ratos. Enxerto de epitélio mamário usando técnicas de transplante aproveita o ambiente hormonal fornecido pelo hospedeiro adolescente roedor. Esses estudos são idealmente adequados para explorar o impacto de várias manipulações biológicas no desenvolvimento da glândula mamária e dissecam muitos aspectos da biologia da glândula mamária. Uma característica comum, mas limitante, é que as células epiteliais transplantadas são fortemente influenciadas pelo estroma circundante e superadas pelo epitélio endógeno; para utilizar tecido mamário nativo, a almofada de gordura branca abdominais deve ser liberada para remover o epitélio mamário hospedeiro antes do transplante. Um grande obstáculo ao usar o organismo modelo de rato é que limpar a árvore mamária em desenvolvimento em ratos pós-desacidos não é eficiente. Quando transplantadas em almofadas de gordura sem glândulas, as células epiteliais doadora podem repovoar o bloco de gordura de hospedeiro limpo e formar uma glândula mamária funcional. O bloco de gordura interscapular é um local alternativo para esses enxertos. Uma grande vantagem é que ele carece de estruturas ductais, mas fornece o estroma normal necessário para promover o crescimento epitelial e é facilmente acessível no rato. Outra grande vantagem dessa técnica é que ela é minimamente invasiva, pois elimina a necessidade de cauterizar e remover a crescente árvore mamária endógena. Além disso, a almofada de gordura interscapular contém um vaso sanguíneo medial que pode ser usado para separar locais para enxerto. Como as glândulas endógenas permanecem intactas, essa técnica também pode ser usada para estudos comparando a glândula mamária endógena à glândula transplantada. Este artigo descreve o método de transplante de células epiteliais mamárias na almofada de gordura branca interscapular de ratos.

Doadores e receptores mammary glândulas As etapas para isolar e preparar células epiteliais mamárias de ratos para transplante são mostradas na Figura 1A. Com 4 semanas de idade, a glândula mamária endógena do rato doador começou a amadurecer e o epitélio pode ser visualizado em slides inteiros montados manchados com carmina alum(Figura 1B...

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Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad (Video) | JoVE

Este artigo descreve um método de transplante para enxertar células epiteliais mamárias doadoras na almofada de gordura branca interscapular de animais receptores. Este método pode ser usado para examinar os efeitos do hospedeiro e/ou doador no desenvolvimento do epitélio mamário e elimina a necessidade de pré-compensação, estendendo assim a utilidade desta técnica.

Transplante de células epiteliais mamárias no Bloco de Gordura Branca Interscapular

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Este protocolo tem sido usado por mais de 40 anos e continua sendo o único método confiável para ensaios de transplante de células mamárias no rato. Este método é amplamente utilizado para interrogar efeitos autônomos de células mamárias versus hospedeiros na pesquisa de suscetibilidade ao câncer de mama. Ao enxertar na almofada de gordura interscapular, este método contorna ter que limpar o epitélio de membrana endógena que não é eficaz em ratos.O método é, portanto, menos invasivo e as glândulas mamárias endógenas podem ser usadas como controle interno. Para começar este procedimento, coloque um rato fêmea eutanizado em suas costas e fixe-o com pinos. Pulverize toda a superfície ventral com 70% de etanol.Faça uma incisão em forma de Y sagital permitindo o acesso a glândulas mamárias torácicas, abdominais e inguinais. Use uma tesoura para dissecar todo o tecido mamário da glândula mamária do rato doador e remover todos os linfonodos visíveis. Em seguida, use fórceps para extrair o tecido mamário.Coloque-o em um prato de 60 milímetros rotulado contendo 500 microliters de mídia DMEM F12 sem soro e mantenha-o no gelo. Em seguida, use uma tesoura para picar finamente o tecido mamário. Primeiro, vire cuidadosamente o corpo do animal doador para colocá-lo em uma posição propensa e fixá-lo com pinos.Pulverize a cabeça e a parte superior das costas com 70% de etanol. Localize a base do crânio e faça uma incisão sob os condyles occipitais, insira tesouras afiadas sob a pele e corte a pele longe do crânio, incluindo os lados da cabeça. Em seguida, use cortadores ósseos ou tesouras fortes para cortar o crânio ao longo da linha média do occipital para os ossos frontais, certificando-se de manter a lâmina o mais superficial possível e inclinada para cima para evitar a destruição do tecido cerebral subjacente.Use Rongeurs ou fórceps fortes para descascar o osso. Insira a ferramenta lateral ao cerebelo para quebrar o osso de ambos os lados. Corte as conexões com as meninges expondo totalmente o canal auditivo.Use fórceps de ponta fina curvas para levantar o cérebro do crânio e registrar seu peso. Use um novo começo de suprimentos para cérebros de doadores adicionais. Transfira imediatamente para um tubo de 15 mililitros contendo uma quantidade igual de mídia armazenada no gelo.Homogeneize o cérebro por 10 a 15 segundos em baixa velocidade. Em seguida, filtrar o homogeneado para remover peças grandes. Guarde o líquido no gelo até que seja necessário.Primeiro, corte um centímetro da extremidade de uma ponta de pipeta de 1.000 microliteres e coloque-a manualmente no pipettor. Use uma ponta de pipeta cortada para transferir o tecido doador picado de cada prato de 60 milímetros para o tubo de digestão da colagemnase. Misture suavemente o tecido picado, pipetando-o para cima e para baixo uma a duas vezes.Em seguida, fixe as amostras em uma posição horizontal na incubadora de agitação. Deixe as amostras digerirem por 1,5 a 2 horas a 37 graus Celsius enquanto tremem a uma velocidade entre 200 e 220 RPM. Quando o tecido mamário doador estiver totalmente digerido, centrifute a suspensão a 1.200 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos.Depois de garantir que uma pelota tenha se formado, use uma pipeta para remover a camada de gordura ou despeje cuidadosamente o sobrenante. Levemente resuspenque a pelota em 10 mililitros de mídia DMEM F12 fresca. Repita este processo para lavar completamente as células.Prepare um tubo de 50 mililitros com um coador de 40 micrômetros para cada animal doador. Pré-molhar o coador com pelo menos um mililitro de mídia DMEM F12. Em seguida, use uma pipeta para passar a suspensão celular através do filtro para coletar fragmentos ductais ou organoides.Para organoides, mantenha apenas as células que permanecem no filtro. Inverta o coador celular sobre um novo tubo de 50 mililitros e enxágue com qualquer volume de mídia estéril necessária para coletar todas as células. Depois disso, pelota as células mais uma vez e resuspend em um pequeno volume de mídia para contar.Prepare lotes únicos de material doador para todos os receptores transplantados, combinando volumes iguais da suspensão celular com homogeneização cerebral de 50% para cada local de transplante. Primeiro, identifique a base do crânio e o início da coluna vertebral em um animal receptor. Aproximadamente um terço do caminho para baixo da coluna vertebral, raspe um centímetro por dois centímetros de área na parte torácica superior da parte de trás.Em seguida, prepare o campo estéril que será usado para cirurgia e providencie todos os suprimentos necessários. Lave as seringas Hamilton com mídia Estéril DMEM F12 para evitar a perda de células. Carregue todo o volume do material doador em uma seringa separada para cada condição.Depois que a seringa estiver totalmente carregada, inverta-a e pressione ligeiramente o êmbolo para remover bolhas de ar na ponta da agulha. Mantenha a seringa no gelo durante todo o procedimento. Certifique-se de que o animal permanece sem resposta a estímulos profundos com uma pitada firme do dedo do dedo do dedo.Em seguida, use uma lâmina cirúrgica afiada para fazer uma pequena incisão interscapular. Localize o vaso sanguíneo medial para orientação e use fórceps para levantar a pele de um lado da incisão. Segure a pele longe da almofada de gordura e evite a gordura marrom subjacente enquanto o transplante é realizado.Em seguida, insira a agulha no local do enxerto. Injete cuidadosamente 40 microliters da mistura celular no tecido da almofada de gordura branca interscapular. Remova a agulha lentamente.Mantenha o tecido no lugar e permita que as células transplantadas se acomodem por três a cinco segundos. Repita todo o procedimento de injeção como descrito anteriormente no segundo local do transplante. Depois disso, feche a ferida cirúrgica usando clipes ou suturas de ferida e, em seguida, interrompa a anestesia.Depois de sacrificar o animal, prepare-o para dissecção. Identifique o vaso sanguíneo medial que separa os locais de enxerto na almofada de gordura interscapular. Extir essa almofada inteira como um único pedaço de tecido.Coloque o tecido em um slide de microscópio carregado positivamente para toda a montagem. Coloque os slides em 70% de etanol por sete a 10 dias para desarngodar o tecido. Em seguida, prepare a mancha de carmim de alum e processe as lâminas quando o tecido estiver suficientemente opaco.Quando o processamento estiver concluído e o tecido na lâmina for liberado, use microscopia de luz de baixa potência ou fotografia digital de alta resolução para adquirir imagens dos slides para análise. Neste estudo, as células epiteliais mamárias são transplantadas usando uma técnica otimizada para trabalhar com ratos onde os organoides epiteliais mamários isolados de ratos doadores são enxertados no bloco de gordura branco interscapular de ratos receptores. A presença, ausência ou abundância de epitélio podem ser avaliadas para determinar o sucesso do experimento, bem como a autonomia dos efeitos relacionados às variáveis experimentais.Um experimento de transplante recíproco onde cada fator tem dois níveis, como tipo selvagem versus nocaute, criará quatro grupos de transplante para testes de hipóteses. Toda a almofada de gordura interscapular montada representativa mostrada aqui contém crescimento epitelial positivo em ambos os locais de transplante. Ao analisar os slides, a falta de epitélio na almofada de gordura interscapular em muitas amostras pode indicar um problema técnico com o procedimento e deve ser tratada como um desfecho negativo.O crescimento epitelial do doador também pode ser comparado com a glândula mamária endógena e pode facilitar conclusões adicionais. No exemplo aqui mostrado, os resultados do transplante recíproco usando tipo selvagem e ratos nocauteados CDKN1B sugeriram efeitos autônomos de células não mamárias no desenvolvimento da glândula mamária. Lembre-se que as células epiteliais e organoides do doador devem ser preparados cuidadosamente e mantidos vivos até serem injetados no animal receptor.É imprescindível planejar com antecedência e realizar o procedimento com cuidado e sem interrupções. Ensaios de carcinogênese primária podem ser realizados após transplante para interrogar a autonomia das células mamárias na etiologia ou tratamento do câncer de mama. A edição de genes também pode ser incorporada para projetar geneticamente as células doadoras ou o rato receptor.Como único método de realização do transplante de células epiteliais mamárias em ratos, este procedimento facilita o desenvolvimento da glândula mamária, bem como estudos de carcinogênese. Esta técnica é particularmente importante para a pesquisa de interações entre células cancerígenas de mama e/ou células epiteliais mamárias com o microambiente hospedeiro. Permite estudos em desenvolvimento de glândulas mamárias, bem como pesquisas sobre câncer de mama.Aqueles que tentam essa técnica pela primeira vez devem otimizar as preparações celulares doadoras para garantir o rendimento e a viabilidade das células máximas, em seguida, realizar pequenos experimentos piloto para praticar procedimentos cirúrgicos e determinar números de células para injetar e também determinar os tempos de incubação pós-cirúrgico necessários para experimentos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

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Pesquisa do câncer

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Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad (Video) | JoVE

Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function (Video) | JoVE

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland (Video) | JoVE

Modelagem de câncer de mama através de uma injeção intraductal de CRE-expressando Adenovirus na glândula mamária do mouse

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture (Video) | JoVE

Avaliando a capacidade de diferenciação das células epitelias da próstata do camundongo usando a cultura organóide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells (Video) | JoVE

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...