Name: rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00
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Este trabajo fue financiado por el Centro Oncológico de Hollings Cancer Center Grant P30 CA138313 fondos piloto de investigación de los Institutos Nacionales de Salud<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">(https://www.nih.gov/),</a>y fondos del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad Médica de Carolina del Sur. Nos gustaría dar las gracias a Marijne Smiths por grabar las declaraciones de la entrevista.

Todos los animales fueron alojados y mantenidos en una instalación aprobada por la AAALAC, y los experimentos descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) MUSC. Los animales para su uso en trasplantes recíprocos deben ser una cepa endogámica o isogénica, con estado congénico preferido o cruzado durante al menos 6 generaciones.
1. Cosecha de epitelio de la glándula mamaria de la rata donante
<ol><li>Determinar el...

Este protocolo describe una técnica de trasplante de células epiteliales mamarias optimizada para trabajar con ratas. Los organoides epiteliales mamarios aislados de ratas donantes (3-5 semanas de edad) se injertan en la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas receptoras (también de 3 a 5 semanas de edad). Los resultados pueden ser interpretados tan poco como 4-6 semanas más tarde, utilizando microscopía de luz para examinar el tejido injertado; sin embargo, la cantidad óptima de tiempo entre el traspla...

El desarrollo de la glándula mamaria postnatal y la morfogénesis ductal son procesos influenciados en gran medida por la señalización hormonal al inicio de la pubertad. En ratones y ratas, comúnmente utilizados organismos modelo de la biología de la glándula mamaria, este proceso comienza alrededor de 3 semanas de edad, donde la rápida proliferación y diferenciación resultan en la formación del parénquima maduro. La glándula mamaria madura puede sufrir numerosas rondas de expansión e involución, una propiedad que ha estado siendo investigada desde principios delsiglo XX. En el contexto de la hiperproliferación y el desarrollo del cáncer, las técnicas de trasplante de glándulas mamarias se desarrollaron en la década de 19501,y se mejoraron con la metodología cuantitativa aportada por Gould et al. en 19772,3,4. El refinamiento de la técnica de trasplante en roedores ha contribuido a grandes avances en la comprensión de la biología normal de la glándula mamaria que todavía se utilizan ampliamente para estudiar el efecto de varios tratamientos y la manipulación genética en el desarrollo normal de la glándula mamaria y los estados de enfermedad.
Muchas hipótesis se han generado y probado posteriormente utilizando el trasplante de glándulas mamarias, descrito por primera vez por DeOme et al. en 19591. Los experimentos a lo largo de varias décadas mostraron la propensión del tejido ducal extirpado de las glándulas mamarias del donante a repoblar toda la almohadilla de grasa5,6,7 e indicaron que un componente crítico del desarrollo de la glándula mamaria reside en estas estructuras epiteliales. Estudios posteriores en ratones mostraron que una sola célula madre mamaria puede repoblar una almohadilla de grasa aclarada y contribuyó al descubrimiento de un progenitor único y común de células epiteliales mamarias basales y luminales8,9,10. En línea con estas conclusiones, se ha sugerido que el trasplante aumenta el conjunto de células con potencial de repoblación multilineaje como resultado de la plasticidad, permitiendo que las células injertadas crezcan una glándula mamaria funcional7,10,11,12,13. Es importante destacar que el uso de técnicas de trasplante en roedores supera las limitaciones de las anomalías inducidas por el cultivo celular14 y a menudo proporciona resultados en cuestión de semanas.
Mientras que el procedimiento fue descrito originalmente en el contexto de lesiones preneoplásicas en ratones, pronto se amplió a ratas y se utilizó junto con el tratamiento de carcinógenos para establecer la multiplicidad como una medida de la susceptibilidad al cáncer15,pero la popularidad de las técnicas de trasplante ha seguido el desarrollo de herramientas genéticas para cada especie. Aunque los estudios de ratón que incorporan trasplantes han contribuido con muchos hallazgos traslacionales, el parénquima de la glándula mamaria de la rata se asemeja más al humano más de16,17 y ofrece ventajas distintas para el estudio del cáncer de mama receptor-positivo de estrógeno (ER+). Los tumores mamarios son inducibles en ambas especies, pero difieren en términos de sensibilidad hormonal y perfiles de expresión génica. Una diferencia principal es que los tumores mamarios de ratas expresan y dependen de la función de los receptores de hormonas ováricas y pituitarias, a saber, estrógeno y progesterona (PR), similar al subtipo luminal-A del cáncer de mama humano. De hecho, el trasplante de células epiteliales mamarias, como se describe en este protocolo, se ha utilizado para estudiar las variantes genéticas implicadas en el cáncer de mama y determinar la autonomía celular de los efectos sobre las células epiteliales mamarias18.
Además de la biología tumoral, el epitelio ductal de la glándula mamaria de rata normal presenta un nivel más alto de ramificación y está flanqueado por una capa más gruesa de estroma que el ratón. La importancia del estroma está bien documentada en estudios de trasplante epitelial mamario. El epitelio mamario debe interactuar con el estroma graso, e idealmente su propio mesenquima, para someterse a su característica morfogénesis19,20. El injerto de tejido en una glándula mamaria receptora proporciona un ambiente óptimo; sin embargo, la presencia de epitelio endógeno puede interferir con los resultados. La prelimpieza de la glándula mamaria del epitelio endógeno se realiza comúnmente en ensayos de trasplante de ratón y requiere la escisión quirúrgica del tejido mamario endógeno y/o la extirpación del pezón1,21,22. Aunque es posible, prelimpiar el epitelio mamario en ratas post-destetaderas no es tan ampliamente realizado, principalmente debido a la ineficacia de limpiar el árbol mamario en crecimiento en ratas post-destete. Dado que se ha demostrado que las regiones de tejido adiposo en otras partes del cuerpo podrían apoyar el crecimiento del epitelio mamario trasplantado21,23,24, el proceso de prelimpieza se puede evitar fácilmente en ratas injertando tejido en la almohadilla de grasa blanca interescapular.
El método de trasplante descrito en este documento consiste en la inyección de organoides de la glándula mamaria disociadas enzimáticamente (fragmentos de epitelio ductal mamario y otros tipos de células capaces de morfogénesis) o células monodispersas en la almohadilla de grasa interescapular en cepas endogámicas, isogénicas o congénicas de ratas de laboratorio2. Debido a que la almohadilla de grasa interescapular normalmente está desprovista de tejido mamario, proporciona un entorno adecuado para múltiples sitios de trasplante sin la necesidad de pre-borrar epitelio endógeno. Como resultado, las glándulas mamarias endógenas, de la inguinal abdominal-inguinal del animal huésped no están sujetas a manipulación quirúrgica, se desarrollan normalmente y no pueden interferir con la interpretación de los resultados. Además, las glándulas mamarias intactas se pueden utilizar para la comparación para evaluar los efectos del huésped frente al donante en el desarrollo del epitelio mamario y la tumorigenesis18,25. Aunque la repoblación de la glándula mamaria a partir de una sola célula madre está disponible para ratones, todavía no se ha desarrollado para ratas, principalmente debido a la falta de disponibilidad de anticuerpos para seleccionar para las células madre mamarias de rata25,26,27. A pesar de esto, el trasplante de células epiteliales mamarias monodispersas para cuantificar el potencial de repoblación se puede realizar con éxito, y esas células se desarrollarán normalmente cuando se injerten en el marco apropiado2,3,4. Si bien los organoides son buenos para muchos propósitos, se requieren células monodispersas para aplicaciones cuantitativas, por ejemplo, para determinar el número de células epiteliales mamarias necesarias para la iniciación del cáncer tras el tratamiento de radiación ionizante28 o para comparar las características de las poblaciones de células epiteliales mamarias seleccionadas citométricamente29.
Hasta la fecha, el procedimiento descrito aquí es el método más robusto para realizar el trasplante de glándula sómariaense en la rata con un objetivo general de estudiar el desarrollo de la glándula mamaria y los mecanismos subyacentes al desarrollo del cáncer de mama. A menudo, el donante y/o los animales receptores están expuestos a diferentes variables antes, durante o después del trasplante epitelial. Algunos ejemplos son los estudios de un solo gen que implican carcinogénesis química30,radiación28,31,32,manipulación genética del genoma del huésped/donante18y manipulación hormonal12. Una de las principales ventajas de la disociación enzimática descrita en este protocolo es la oportunidad de aislar organoides epiteliales o células monodispersas para experimentos complementarios que implican citometría de flujo, cultivo 3D, edición de genes y más. Las aplicaciones futuras de esta técnica incluirán la manipulación adicional del donante y/o tejido huésped con ingeniería genética. Por ejemplo, las células del donante pueden ser alteradas genéticamente ex vivo en cualquier locus genómico elegido utilizando el sistema de edición de genes CRISPR-Cas9. Del mismo modo, las ratas receptoras también pueden ser alteradas genéticamente para estudiar la interacción entre los factores genéticos diseñados por donantes y receptores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;M syringe filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-715G</td>
			<td>sterile-filtering collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td>filtering brain homogenate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 uL gastight syringes with 25 gauge needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81001 &#38; 90525</td>
			<td>For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 uL pipette tips + pipette</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>transferring cells/mixtures/tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352196</td>
			<td>brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td>filtering organoids after washing the cell pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td>for collagenase digestion of donor mammary gland tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130181</td>
			<td>for mincing tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alum Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>243361/237086</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer for veterinary use</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-dine or iodine</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass culture tube for homogenization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carmine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6152/1022</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting apparatus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean animal cages for recovery</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 3</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS004183</td>
			<td>enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for chemical solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11320033</td>
			<td>for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705/2701</td>
			<td>mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>-</td>
			<td>inactivation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-212</td>
			<td>use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pads</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets (x2)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital rotation</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>must be capable of maintaining 37&#176;C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthesia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope or digital camera</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>TissueMiser or alternative models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>long-term storage of cleared mammary gland whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks for anesthesia vaporizer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels or delicate task wipes</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively-charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P4981-001</td>
			<td>mammary gland tissue whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postoperative analgesic</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>electric clippers, or other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jars</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile field drapes</td>
			<td>IMCO</td>
			<td>4410-IMC</td>
			<td>used during transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclave surgical tools used for donors and recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes: 5 mL (or greater)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for sterile filtration of collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td></td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier, clips, and removal tool</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12020-00</td>
			<td>Closing the skin incision over the interscapular white pad pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>clearing mammary gland whole mount slides after staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad

Ya en la década de 1970, los investigadores han trasplantado con éxito las células epiteliales mamarias a la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas. El injerto de epitelio mamario mediante técnicas de trasplante aprovecha el entorno hormonal proporcionado por el huésped adolescente. Estos estudios son ideales para explorar el impacto de varias manipulaciones biológicas en el desarrollo de la glándula mamaria y diseccionar muchos aspectos de la biología de la glándula mamaria. Una característica común, pero limitante, es que las células epiteliales trasplantadas están fuertemente influenciadas por el estroma circundante y son sube a la competencia por epitelio endógeno; para utilizar tejido mamario nativo, la almohadilla de grasa blanca abdominal-inguinal debe eliminarse para eliminar el epitelio mamario huésped antes del trasplante. Un obstáculo importante cuando se utiliza el organismo modelo de rata es que limpiar el árbol mamario en desarrollo en ratas post-dedianas no es eficiente. Cuando se trasplantan en almohadillas de grasa libres de glándulas, las células epiteliales del donante pueden repoblar la almohadilla de grasa del huésped limpiada y formar una glándula mamaria funcional. La almohadilla de grasa interescapular es un lugar alternativo para estos injertos. Una ventaja importante es que carece de estructuras ductales, pero proporciona el estroma normal que es necesario para promover el crecimiento epitelial y es fácilmente accesible en la rata. Otra ventaja importante de esta técnica es que es mínimamente invasiva, ya que elimina la necesidad de cauterizar y eliminar el creciente árbol mamario endógeno. Además, la almohadilla de grasa interescapular contiene un vaso sanguíneo medial que se puede utilizar para separar sitios para el injerto. Debido a que las glándulas endógenas permanecen intactas, esta técnica también se puede utilizar para estudios que comparan la glándula mamaria endógena con la glándula trasplantada. Este artículo describe el método de trasplante de células epiteliales mamarias en la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas.

Glándulas mamarias de donantes y receptores Los pasos para aislar y preparar las células epiteliales mamarias de ratas para el trasplante se muestran en la Figura 1A. A las 4 semanas de edad, la glándula mamaria endógena de la rata donante ha comenzado la maduración y el epitelio se puede visualizar en diapositivas montadas enteras teñidas con carmín de alumbre(Figur...

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Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Este artículo describe un método de trasplante para injertar células epiteliales mamarias de ratas de donantes en la almohadilla de grasa blanca interescapular de los animales receptores. Este método se puede utilizar para examinar los efectos del huésped y/o del donante en el desarrollo del epitelio mamario y elimina la necesidad de pre-clearing, extendiendo así la utilidad de esta técnica.

Trasplante de células epiteliales de rata mamaria en la almohadilla de grasa blanca interescapular

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Este protocolo se ha utilizado durante más de 40 años y sigue siendo el único método fiable para los ensayos de trasplante de células mamarias en la rata. Este método se utiliza ampliamente para interrogar los efectos autónomos de células mamarias frente a los efectos del huésped en la investigación de la susceptibilidad al cáncer de mama. Mediante el injerto en la almohadilla de grasa interescapular, este método elude tener que limpiar el epitelio de membrana endógena que no es eficaz en ratas.Por lo tanto, el método es menos invasivo y las glándulas mamarias endógenas se pueden utilizar como control interno. Para comenzar este procedimiento, coloque una rata hembra eutanasia en su espalda y fíjela con alfileres. Rocíe toda la superficie ventral con 70% de etanol.Haga una incisión en forma de Y sagital que permita el acceso a las glándulas mamarias torácicas, abdominales e inguinales. Usa tijeras para diseccionar todo el tejido de la glándula mamaria de la rata donante y eliminar todos los ganglios linfáticos visibles. A continuación, utilice fórceps para extraer el tejido mamario.Colóquelo en un plato etiquetado de 60 milímetros que contenga 500 microlitros de medios DMEM F12 sin suero y manténgalo en hielo. Luego usa tijeras para picar finamente el tejido mamario. Primero, gire cuidadosamente el cuerpo del animal donante para colocarlo en una posición propensa y asegurarlo con alfileres.Rocíe la cabeza y la parte superior de la espalda con 70% de etanol. Localiza la base del cráneo y haz una incisión debajo de los cóndilos occipitales, inserta tijeras afiladas debajo de la piel y corta la piel lejos del cráneo incluyendo los lados de la cabeza. A continuación, utilice cortadores óseos o tijeras fuertes para cortar el cráneo a lo largo de la línea media desde el occipital hasta los huesos frontales, asegurándose de mantener la hoja lo más superficial posible y en ángulo hacia arriba para evitar la destrucción del tejido cerebral subyacente.Usa Rongeurs o fórceps fuertes para despegar el hueso. Inserte la herramienta lateralmente al cerebelo para romper el hueso a cada lado. Cortar las conexiones con las meninges exponiendo completamente el canal auditivo.Usa fórceps curvados de punta fina para sacar el cerebro del cráneo y registrar su peso. Use un nuevo comienzo de suministros para cerebros de donantes adicionales. Transfiera inmediatamente a un tubo de 15 mililitros que contenga la misma cantidad de medios que se almacena en hielo.Homogeneizar el cerebro durante 10 a 15 segundos a baja velocidad. A continuación, filtre el homogeneizar para eliminar piezas grandes. Almacene el líquido sobre hielo hasta que sea necesario.En primer lugar, corte un centímetro del extremo de una punta de pipeta de 1.000 microlitrotro y colóquela manualmente en el pipeteador. Utilice una punta de pipeta cortada para transferir el tejido del donante picado de cada plato de 60 milímetros al tubo de digestión de la colagenasa. Mezcle suavemente el tejido picado pipeteándolo hacia arriba y hacia abajo de una a dos veces.A continuación, fije las muestras en una posición horizontal en la incubadora de agitación. Permita que las muestras digieren durante 1,5 a dos horas a 37 grados centígrados mientras agita a una velocidad entre 200 y 220 RPM. Cuando el tejido de la glándula mamaria del donante está completamente digerido, centrifuga la suspensión a 1.200 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Después de asegurarse de que se ha formado un pellet, utilice una pipeta para eliminar la capa de grasa o vierta cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender suavemente el pellet en 10 mililitros de medios DMEM F12 frescos. Repita este proceso para lavar a fondo las células.Prepare un tubo de 50 mililitros con un colador de 40 micrómetros por cada animal donante. Pre-mojar el colador con al menos un mililitro de medios DMEM F12. A continuación, utilice una pipeta para pasar la suspensión celular a través del filtro para recoger fragmentos ductales u organoides.Para los organoides, mantenga solo las células que permanecen en el filtro. Invierta el colador celular sobre un nuevo tubo de 50 mililitros y enjuague con cualquier volumen de medios estériles necesarios para recoger todas las células. Después de esto, peletizar las células una vez más y resuspend en un pequeño volumen de medios para el conteo.Preparar lotes únicos de material de donante para todos los receptores de trasplante combinando volúmenes iguales de la suspensión celular con 50% de homogeneización cerebral para cada lugar de trasplante. Primero, identifique la base del cráneo y el inicio de la columna vertebral en un animal receptor. Aproximadamente un tercio del camino por la columna vertebral, afeite un área de tres centímetros por dos centímetros en la parte torácica superior de la espalda.A continuación, prepare el campo estéril que se utilizará para la cirugía y organice todos los suministros necesarios. Enjuague las jeringas Hamilton con medios DMEM F12 estériles para evitar la pérdida de células. Cargue todo el volumen de material del donante en una jeringa separada para cada condición.Después de que la jeringa esté completamente cargada, invierta y presione ligeramente el émbolo para eliminar las burbujas de aire en la punta de la aguja. Mantenga la jeringa sobre hielo durante todo el procedimiento. Asegúrese de que el animal no responde a estímulos profundos con un pellizco firme en los dedos del dedo.Luego usa una cuchilla quirúrgica afilada para hacer una pequeña incisión interescapular. Localice el vaso sanguíneo medial para orientación y utilice fórceps para levantar la piel en un lado de la incisión. Mantenga la piel alejada de la almohadilla de grasa y evite la grasa marrón subyacente mientras se realiza el trasplante.A continuación, inserte la aguja en el sitio del injerto. Inyecte cuidadosamente 40 microlitros de la mezcla celular en el tejido de la almohadilla de grasa blanca interescapular. Retire la aguja lentamente.Mantenga el tejido en su lugar y permita que las células trasplantadas se asienten durante tres a cinco segundos. Repita todo el procedimiento de inyección como se describió anteriormente en el segundo sitio de trasplante. Después de esto, cierre la herida quirúrgica con clips de la herida o suturas y luego interrumpa la anestesia.Después de sacrificar al animal, prepáralo para la disección. Identifique el vaso sanguíneo medial que separa los sitios del injerto en la almohadilla de grasa interescapular. Exéminar toda la almohadilla como una sola pieza de tejido.Coloque el tejido en una corredera de microscopio cargada positivamente para todo el montaje. Coloque los portaobjetos en 70%etanol durante siete a 10 días para des-grasa el tejido. A continuación, prepare la mancha de carmín de alumna y procese las diapositivas cuando el tejido sea lo suficientemente opaco.Cuando el procesamiento se haya completado y el tejido de la diapositiva se haya despejado, utilice microscopía de luz de baja potencia o fotografía digital de alta resolución para adquirir imágenes de las diapositivas para su análisis. En este estudio, las células epiteliales mamarias se trasplantan utilizando una técnica optimizada para trabajar con ratas donde los organoides epiteliales mamarios aislados de ratas donantes se injertan en la almohadilla de grasa blanca interescapular de las ratas receptoras. La presencia, ausencia o abundancia de epitelio se puede evaluar para determinar el éxito del experimento, así como la autonomía de los efectos relacionados con variables experimentales.Un experimento de trasplante recíproco en el que cada factor tiene dos niveles, como el tipo salvaje frente al knockout, creará cuatro grupos de trasplantes para las pruebas de hipótesis. La almohadilla de grasa interescapular montada en todo el representante que se muestra aquí contiene un crecimiento epitelial positivo en ambos sitios de trasplante. Al analizar las diapositivas, la falta de epitelio en la almohadilla de grasa interescapular en muchas muestras puede indicar un problema técnico con el procedimiento y debe tratarse como un resultado negativo.El crecimiento epitelial del donante también se puede comparar con la glándula mamaria endógena y puede facilitar conclusiones adicionales. En el ejemplo que se muestra aquí, los resultados del trasplante recíproco utilizando ratas noqueadoras DE tipo salvaje y DEKN1B sugirieron efectos autónomos de células no mamarias en el desarrollo de la glándula mamaria. Recuerde que las células epiteliales y los organoides del donante deben prepararse cuidadosamente y mantenerse vivos hasta que se inyecten en el animal receptor.Es imperativo planificar con anticipación y realizar el procedimiento cuidadosamente y sin interrupciones. Los ensayos primarios de carcinogénesis se pueden realizar después del trasplante para interrogar la autonomía de las células mamarias en la etiología o el tratamiento del cáncer de mama. La edición génica también se puede incorporar para diseñar genéticamente las células donantes o la rata receptora.Como único método para realizar el trasplante de células epiteliales mamarias en ratas, este procedimiento facilita el desarrollo de la glándula mamaria, así como los estudios de carcinogénesis. Esta técnica es particularmente importante para investigar las interacciones entre las células del cáncer de mama y/o las células epiteliales mamarias con el microambiente huésped. Permite estudios en el desarrollo de la glándula mamaria, así como la investigación del cáncer de mama.Aquellos que intentan esta técnica por primera vez deben optimizar las preparaciones celulares de los donantes para asegurar el máximo rendimiento celular y viabilidad, luego realizar pequeños experimentos piloto para practicar procedimientos quirúrgicos y determinar los números celulares para inyectar y también determinar los tiempos de incubación postquirúrgicos necesarios para los experimentos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Procedimientos quirúrgicos y metodología para un modelo murino preclínico<em&gt; De Novo</em&gt; Metástasis del cáncer mamario

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplante de Tumores cerebrales pediátricos de Zebrafish en huéspedes inmune-competentes para el estudio a largo plazo del comportamiento de la célula de tumor y de la respuesta de la droga

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Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Imágenes en vivo de la migración de células epiteliales de mama después del agotamiento transitorio de TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Condicional Knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del Tumor

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

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Un modelo de ratón de cáncer de páncreas Syngeneic para estudiar los efectos de la electroporación Irreversible

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

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Ortotópico inyección de las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de ratones

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In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

En Vitro Tumor celular Rechallenge de evaluación predictiva de antígeno quimérico del Receptor de la célula T función antitumoral

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de Adenovirus C-expreso en la Glándula Mamaria del Ratón

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluación de la capacidad de diferenciación de las células epiteliales de próstata de ratón utilizando el cultivo organoide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...