Name: rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad at JoVE.com

Detta arbete finansierades av Hollings Cancer Center's Cancer Center Support Grant P30 CA138313 pilot forskningsfinansiering från National Institutes of Health<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">(https://www.nih.gov/</a>), och medel från Institutionen för patologi & laboratoriemedicin vid Medical University of South Carolina. Vi vill tacka Marijne Smiths för att ha spelat in intervjuuttalandena.

Alla djur var inrymt och underhålls i en AAALAC-godkänd anläggning, och experiment som beskrivs i detta protokoll godkändes av MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Djur för användning vid ömsesidig transplantation bör vara en inavlad eller isogen stam, med kongen status föredras eller backcrossed i minst 6 generationer.
1. Skörd givare råtta mammary körtel epitel
<ol><li>Bestäm hur många donatorråttor som behövs för transplantation. OBS: I allmänhet ka...

Detta protokoll beskriver en däggdjur epitelcell transplantation teknik optimerad för att arbeta med råttor. Isolerade däggdjur epitel organoider från givare råttor (3-5 veckors ålder) ympas in i interscapular vit fett pad av mottagarråttor (även 3-5 veckors ålder). Resultaten kan tolkas så lite som 4-6 veckor senare, med hjälp av ljusmikroskopi för att undersöka den ympade vävnaden; Den optimala tiden mellan transplantation och uppoffring måste dock bestämmas innan ett fullständigt experiment genomför...

Postnatal bröstkörtel utveckling och duktal morfogenes är processer till stor del påverkas av hormonell signalering i början av puberteten. Hos möss och råttor, vanliga modellorganismer av bröstkörtelbiologi, börjar denna process runt 3 veckors ålder, där snabb spridning och differentiering resulterar i bildandet av den mogna parenkymen. Den mogna bröstkörteln kan genomgå många omgångar av expansion och involution, en fastighet som har varit under utredning sedan början av20-talet. Inom ramen för hyperproliferation och cancerutveckling utvecklades mammary körteltransplantationstekniker på 1950-talet1, och förstärktes avden kvantitativa metod som Gould m.fl. Förfining av transplantationstekniken hos gnagare har bidragit till stora framsteg när det gäller att förstå normala bröstkörtelbiologi som fortfarande används i stor utsträckning för att studera effekten av olika behandlingar och genetisk manipulation på normala bröstkörtelutveckling och sjukdomstillstånd.
Många hypoteser har genererats och därefter testats med hjälp av mammary körtel transplantation, först beskrivs av DeOme et al. 19591. Experiment under flera decennier visade benägenheten hos duktal vävnad strukits från givare bröstkörtlar att återbefolka hela fettpad5,6,7 och visade att en kritisk del av mammary körtel utveckling finns i dessa epitel strukturer. Senare studier på möss visade att en enda bröststamceller kan återbefolka en rensad fettpad och bidragit till upptäckten av en enda, gemensam stamfader av basala och luminal bröst epitelceller8,9,10. I linje med dessa slutsatser har det föreslagits att transplantation ökar poolen av celler med flerkantsrepopulering potential som ett resultat av plasticitet, vilket gör att ympade celler att växa en funktionell bröstkörtel7,10,11,12,13. Viktigt, användningen av transplantation tekniker hos gnagare övervinner begränsningarna i cellodling-inducerad avvikelser14 och ger ofta resultat på bara några veckor.
Medan förfarandet ursprungligen beskrevs i samband med preneoplastiska skador hos möss, var det snart utvidgas till råttor och används tillsammans med cancerframkallande behandling för att etablera multiplicity som ett mått på cancer känslighet15, men populariteten av transplantation tekniker har följt utvecklingen av genetiska verktyg för varje art. Även mus studier som innehåller transplantation har bidragit många translationella resultat, parenkymen av råttan bröstkörteln liknar människan närmare16,17 och erbjuder tydliga fördelar för att studera östrogen receptor-positiva (ER +) bröstcancer. Brösttumörer är förtrogna i båda arterna, men de skiljer sig när det gäller hormonkänslighet och genuttrycksprofiler. En primär skillnad är att råtta brösttumörer uttrycker och beror på funktionen av äggstocks- och hypofyshormonreceptorer, nämligen östrogen och progesteron (PR), liknande den luminal-A subtyp av bröstcancer hos människa. Faktum är att däggdjurepitelcelltransplantation, som beskrivs i detta protokoll, har använts för att studera genetiska varianter som är involverade i bröstcancer och bestämma den cellulära autonomin av effekter på däggdjurepitelceller18.
Förutom tumörbiologin uppvisar den dukta epitelen hos den normala råttets körtel en högre nivå av förgrening och flankeras av ett tjockare lager av stroma än musen. Stroma vikten är väldokumenterad i studier av epiteltransplantation. Däggdjur epitel måste interagera med fet stroma, och helst sin egen mesenchyme, att genomgå sin karakteristiska morfogenes19,20. Ympning vävnad i en mottagare bröstkörtel ger en optimal miljö; Förekomsten av endogen epitel kan dock störa resultaten. Preclearing bröstkörteln av endogen epitel utförs ofta i mus transplantation analyser och kräver kirurgiska excision av endogena bröstvävnad och / eller avlägsnande av bröstvårtan1,21,22. Även om det är möjligt, preclearing bröst epitel i post-weanling råttor är inte så allmänt utförs, främst på grund av ineffektiviteten i clearing den växande bröstträd i post-weanling råttor. Eftersom det har visat sig att regioner av fettvävnad någon annanstans i kroppen skulle kunna stödja tillväxten av transplanterade däggdjur epitel21,23,24,processen för preclearing kan lätt undvikas hos råttor genom ympning vävnad i interscapular vit fett pad.
Transplantationsmetoden som beskrivs i detta dokument innebär injektion av enzymatiskt separerade bröstkörtelorganoider (fragment av bröstduksepitel och andra celler typer som kan morfogenes) eller monodispersed celler i interscapular fettpad inavlade, isogenic eller kongena stammar av råttor laboratorium2. Eftersom interscapular fett pad normalt saknar bröstvävnad, det ger en lämplig miljö för flera transplantation platser utan att behöva pre-clear endogena epitel. Som ett resultat är värddjurets endogena, bukljumskar inte föremål för kirurgisk manipulation, utvecklas normalt och kan inte störa tolkningen av resultaten. Dessutom kan intakta bröstkörtlar användas för jämförelse för att utvärdera värd kontra givareffekter på bröstepitel utveckling och tumorigenesis18,25. Även om återpopulationen av bröstkörteln från en enda stamceller är tillgänglig för möss, har det ännu inte utvecklats för råtta, främst på grund av bristen på tillgång till antikroppar att välja för råtta däggdjur stamceller25,26,27. Trots detta kan transplantation av monodispersed bröst epitelceller för att kvantifiera repopulating potential framgångsrikt utföras, och dessa celler kommer att utvecklas normalt när ympade i lämplig ram2,3,4. Medan organoider är bra för många ändamål, monodispersed celler krävs för kvantitativa tillämpningar, till exempel för att bestämma antalet däggdjur epitelceller som krävs för cancer inledande efter joniserande strålbehandling28 eller för att jämföra egenskaper flöde cytometrically utvalda däggdjur epitelcell populationer29.
Hittills är det förfarande som beskrivs här den mest robusta metoden för att utföra mammary körtel transplantation i råtta med ett övergripande mål att studera bröstkörtel utveckling och mekanismer underliggande bröstcancer utveckling. Ofta exponeras donatorn och/eller mottagardjuren för olika variabler före, under eller efter epiteltransplantationen. Exempel är enskilda genstudier som involverar kemiska cancerframkallandeämnen 30,strålning28,31,32,genetisk manipulering av värd/donatorgenom18, och hormonell manipulation12. En stor fördel med den enzymatiska dissociation som beskrivs i detta protokoll är möjligheten att isolera epitelial organoider eller monodispersed celler för kompletterande experiment med flödecytometri, 3D-kultur, genredigering och mycket mer. Framtida tillämpningar av denna teknik kommer att omfatta ytterligare manipulering av givare och / eller värdvävnad med genteknik. Till exempel kan givarceller vara genetiskt modifierade ex vivo på alla valda genomiska locus med hjälp av CRISPR-Cas9 genredigeringssystem. På samma sätt kan mottagarråttor också ändras genetiskt för att studera samspelet mellan givare och mottagarkonstruerade genetiska faktorer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;M syringe filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-715G</td>
			<td>sterile-filtering collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td>filtering brain homogenate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 uL gastight syringes with 25 gauge needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81001 &#38; 90525</td>
			<td>For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 uL pipette tips + pipette</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>transferring cells/mixtures/tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352196</td>
			<td>brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td>filtering organoids after washing the cell pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td>for collagenase digestion of donor mammary gland tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130181</td>
			<td>for mincing tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alum Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>243361/237086</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer for veterinary use</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-dine or iodine</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass culture tube for homogenization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carmine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6152/1022</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting apparatus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean animal cages for recovery</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 3</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS004183</td>
			<td>enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for chemical solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11320033</td>
			<td>for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705/2701</td>
			<td>mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>-</td>
			<td>inactivation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-212</td>
			<td>use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pads</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets (x2)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital rotation</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>must be capable of maintaining 37&#176;C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthesia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope or digital camera</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>TissueMiser or alternative models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>long-term storage of cleared mammary gland whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks for anesthesia vaporizer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels or delicate task wipes</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively-charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P4981-001</td>
			<td>mammary gland tissue whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postoperative analgesic</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>electric clippers, or other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jars</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile field drapes</td>
			<td>IMCO</td>
			<td>4410-IMC</td>
			<td>used during transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclave surgical tools used for donors and recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes: 5 mL (or greater)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for sterile filtration of collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td></td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier, clips, and removal tool</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12020-00</td>
			<td>Closing the skin incision over the interscapular white pad pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>clearing mammary gland whole mount slides after staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad

Redan på 1970-talet har forskare framgångsrikt transplanterat däggdjursepitelceller i interscapular vita fettpad av råttor. Ympning bröst epitel med transplantation tekniker drar nytta av hormonell miljö som tillhandahålls av ungdomar gnagare värd. Dessa studier är idealiska för att utforska effekterna av olika biologiska manipulationer på bröstkörtel utveckling och dissekera många aspekter av bröstkörtelbiologi. En vanlig, men begränsande, funktion är att transplanterade epitelceller är starkt påverkade av den omgivande stroma och konkurreras ut av endogen epitel; För att använda inhemska bröstvävnad måste bukningsfettplattan rensas för att ta bort värdbröstepitel före transplantationen. Ett stort hinder när du använder råttmodellorganismen är att det inte är effektivt att rensa det utvecklande bröstträdet i postavväjt råttor. När transplanteras i körtelfria fett kuddar, givare epitelceller kan återbefolka den rensade värd fett pad och bilda en funktionell bröstkörtel. Den interscapular fett pad är en alternativ plats för dessa transplantat. En stor fördel är att den saknar kanalstrukturer men ger den normala stroma som är nödvändig för att främja epitelial utväxt och är lättillgänglig i råtta. En annan stor fördel med denna teknik är att det är minimalt invasiv, eftersom det eliminerar behovet av att kauterisera och ta bort den växande endogena bröstträd. Dessutom innehåller interscapular fett pad ett medial blodkärl som kan användas för att separera platser för ympning. Eftersom de endogena körtlarna förblir intakta kan denna teknik också användas för studier som jämför den endogena bröstkörteln med den transplanterade körteln. Detta dokument beskriver metoden för däggdjur epitelcell transplantation i interscapular vit fett pad av råttor.

Donator- och mottagarkörtlar Stegen för att isolera och förbereda råtta däggdjur epitelceller för transplantation visas i figur 1A. Vid 4 veckors ålder har givarens endogena bröstkörtel börjat mognad och epitel visualiseras på hela monterade diabilder som färgas med alunkarmin(figur 1B). En donatorråtta vid denna ålder kommer att ge c...

Watch this Scientific Journal Video about Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad at JoVE.com

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Denna artikel beskriver en transplantation metod för att transplantera givare råtta däggdjur epitelceller i interscapular vit fett pad av mottagardjur. Denna metod kan användas för att undersöka värd- och/eller givareffekter på däggdjurepitelutveckling och eliminerar behovet av preclearing och därigenom utvidganyttan av denna teknik.

Råtta Mammary Epitel Cell Transplantation i Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Detta protokoll har använts i över 40 år och är fortfarande den enda tillförlitliga metoden för bröstcelltransplantationsanalyser hos råttan. Denna metod används ofta för att förhöra däggdjurscell autonoma kontra värd effekter i bröstcancer känslighet forskning. Genom ympning i den interscapular fett pad kringgår denna metod att behöva rensa endogena membranet epitel som inte är effektivt hos råttor.Metoden är därför mindre invasiv och de endogena bröstkörtlarna kan användas som en intern kontroll. Till att börja detta förfarande, placera en avlivad honråtta på ryggen och säkra den med stift. Spraya hela ventralytan med 70%etanol.Gör en sagittal Y-formad snitt möjliggör tillgång till bröst, buken, och inguinal bröstkörtlar. Använd sax för att dissekera all bröstkörtelvävnad från donatorråttan och avlägsna alla synliga lymfkörtlar. Därefter använder du forceps för att extrahera bröstvävnaden.Placera den i en märkt 60 millimeters maträtt som innehåller 500 mikroliter av serumfria DMEM F12-medier och håll den på is. Använd sedan sax för att finhacka bröstvävnaden. Först, vänd försiktigt kroppen av donatordjuret över för att placera den i ett benägna läge och säkra den med stift.Spraya huvudet och övre ryggen med 70%etanol. Lokalisera skallbasen och gör ett snitt under de occipitala kondylarna, sätt in vassa saxar under huden och skär huden bort från skallen inklusive sidorna av huvudet. Därefter använder ben fräsar eller stark sax för att skära skallen längs mittlinjen från nackben till frontal ben samtidigt se till att hålla bladet så ytlig som möjligt och vinklade uppåt för att förhindra förstörelsen av den underliggande hjärnvävnaden.Använd Rongeurs eller starka tutent för att skala bort benet. Sätt i verktyget lateralt till lillhjärnan för att bryta benet på vardera sidan. Sever anslutningarna till hjärnhinnorna genom att helt exponera hörselgången.Använd böjda finspetsade tyckor för att lyfta hjärnan ur skallen och registrera dess vikt. Använd en nystart av leveranser för ytterligare givare hjärnor. Omedelbart överföra den till en 15 milliliter rör som innehåller en lika stor mängd media som lagras på is.Homogenisera hjärnan i 10 till 15 sekunder på en låg hastighet. Filtrera sedan homogenatet för att ta bort stora bitar. Förvara vätskan på is tills det behövs.Först skär en centimeter från slutet av en 1, 000 microliter pipett spets och manuellt placera den på pipettor. Använd en skuren pipettspets för att överföra den malda givarvävnaden från varje 60 millimeters skål till kollagenass digestionsröret. Blanda försiktigt den malda vävnaden genom pipettering upp och ner en till två gånger.Säkra därefter proverna i horisontellt läge i skakinkubatorn. Låt proverna smälta i 1,5 till två timmar vid 37 grader Celsius medan du skakar med en hastighet mellan 200 och 220 RPM. När givaren bröstkörtelvävnaden är helt smält, centrifug suspensionen vid 1, 200 gånger g och vid fyra grader Celsius i 10 minuter.Efter att ha säkerställt att en pellet har bildats, använd en pipett för att ta bort fettlagret eller häll försiktigt av supernatanten. Försiktigt resuspend pelleten i 10 milliliter färska DMEM F12 media. Upprepa denna process för att noggrant tvätta cellerna.Förbered ett 50 milliliter rör med en 40 mikrometer sil för varje donatordjur. Förväpna silen med minst en milliliter DMEM F12-media. Använd sedan en pipett för att passera cellupphängningen genom filtret för att samla in duktal fragment eller organoider.För organoider, håll endast de celler som finns kvar i filtret. Invertera cellsilen över ett nytt 50 milliliterrör och skölj med vilken volym av sterila medier som krävs för att samla alla celler. Efter detta pellet cellerna en gång till och återanvänds i en liten volym av media för räkning.Förbered enstaka partier av donatormaterial för alla transplantationsmottagare genom att kombinera lika stora volymer av cellfjädringen med 50%hjärnans homogenate för varje plats för transplantation. Identifiera först skallbasen och start av kotpelaren på ett mottagardjur. Ungefär en tredjedel av vägen ner i ryggraden, raka en tre centimeter med två centimeter område på den övre bröstdelen av ryggen.Därefter förbereder steril fältet som kommer att användas för kirurgi och ordna alla nödvändiga leveranser. Spola Hamilton-sprutorna med sterilt DMEM F12-media för att förhindra förlust av celler. Ladda hela volymen av donatormaterial i en separat spruta för varje tillstånd.När sprutan är fullastad, invertera den och tryck på kolven något för att avlägsna luftbubblor vid nålspetsen. Håll sprutan på is under hela proceduren. Se till att djuret förblir svarar inte på djupa stimuli med en fast tå nypa.Använd sedan ett vasst kirurgiskt blad för att göra ett litet interscapular snitt. Lokalisera det mediala blodkärlet för orientering och använd forceps för att lyfta huden på ena sidan av snittet. Håll huden borta från fettdynan och undvik det underliggande bruna fettet medan transplantationen utförs.Därefter för in nålen i transplantatstället. Injicera försiktigt 40 mikroliter av cellblandningen i den interscapular vita fett pad vävnad. Ta bort nålen långsamt.Håll vävnaden på plats och låt de transplanterade cellerna nöja sig med tre till fem sekunder. Upprepa hela injektionsproceduren som tidigare beskrivits vid det andra transplantationsstället. Efter detta, stäng operationssåret med hjälp av sårklämmor eller suturer och sedan avbryta anestesin.Efter att ha offra djuret, förbered det för dissektion. Identifiera det mediala blodkärl som separerar ympställena i den interscapular fettdynan. Punktskatt hela pad som en enda bit vävnad.Placera vävnaden på ett positivt laddat mikroskopglas för hela fästet. Placera diabilderna i 70%etanol i sju till 10 dagar för att defetta vävnaden. Förbered sedan alunkarminfläcken och bearbeta objektglasen när vävnaden är tillräckligt ogenomskinlig.När bearbetningen är klar och vävnaden på bilden har rensat, använd låg strömförsörjd ljusmikroskopi eller högupplöst digital fotografering för att skaffa bilder av bilderna för analys. I denna studie transplanteras bröstepitetelceller med hjälp av en teknik som är optimerad för arbete med råttor där de isolerade däggdjursepitehormonoiderna från donatorråttor ympas in i mottagarråttornas interscapular vita fettdyna. Förekomst, frånvaro, eller överflöd av epitel kan utvärderas för att bestämma framgång för experimentet samt autonomi effekter relaterade till experimentella variabler.Ett ömsesidigt transplantationsexperiment där varje faktor har två nivåer som vild typ kontra knockout kommer att skapa fyra transplantationsgrupper för hypotestestning. Representativa hela monteras interscapular fett pad visas här innehåller positiva epitelial utväxt på båda platserna för transplantation. Vid analys av bilderna, brist på epitel i den interscapular fett pad över många prover kan tyda på ett tekniskt problem med förfarandet och bör behandlas som ett negativt resultat.Givaren epitelial utväxt kan också jämföras med den endogena bröstkörteln och kan underlätta ytterligare slutsatser. I exemplet som visas här föreslog resultaten av ömsesidig transplantation med vildtyp och CDKN1B knockout-råttor icke-bröstcell autonoma effekter på bröstkörtelutvecklingen. Kom ihåg donator epitelceller och organoider måste förberedas noggrant och hållas vid liv tills injiceras i mottagardjuret.Det är absolut nödvändigt att planera framåt och att utföra proceduren noggrant och utan några avbrott. Primära carcinogenesis analyser kan utföras efter transplantation för att förhöra mammary cell autonomi i etiologin eller behandling av bröstcancer. Genredigering kan också införlivas med att genetiskt ingenjör givaren celler eller mottagaren råtta.Som den enda metoden för att utföra mjölke epitelial cell transplantation hos råttor, detta förfarande underlättar bröstkörtel utveckling samt carcinogenes studier. Denna teknik är särskilt viktig för att forska om interaktioner mellan bröstcancerceller och/eller däggdjursepitelceller med värdmikromiljöen. Det möjliggör studier i bröstkörtelutveckling samt bröstcancerforskning.De som försöker denna teknik för första gången bör optimera förberedelserna givare cell för att säkerställa maximal cell avkastning och livskraft, sedan utföra små pilot experiment för att öva kirurgiska ingrepp och bestämma cellnummer för att injicera och även bestämma post-kirurgiska inkubationstider som krävs för experiment.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Kirurgiska förfaranden och metodik för en preklinisk murinmodell av<em&gt; De Novo</em&gt; Mammakreftmetastas

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation av sebrafiskpediatriska hjärntumörer till immunkompetenta värdar för långvarig studie av tumörcellsbeteende och drogrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Live-imaging av bröstcancer epitelial cellmigration efter övergående utarmning av TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Villkorliga Nedslagning av genuttryck i Cancer cellinjer att studera rekrytering av monocyter/makrofager att den tumör mikromiljö

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

En syngena pankreascancer musmodell att studera effekterna av irreversibel elektroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Ortotop injektion av bröstcancerceller i möss mjölkkörtlar fettet Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro tumör Cell återinsättning för förutsägande utvärdering av chimära Antigen receptorn T Cell antitumöreffekt funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modellering bröst cancer via en intraductal injektion av CRE-uttrycker adenovirus i musen bröstkörteln

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Utvärdering av differentierings kapacitet av mus prostata epitelceller med Organoid kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...