Name: rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad at JoVE.com

Bu çalışma Hollings Kanser Merkezi Destek Hibe P30 CA138313 ulusal Sağlık Enstitüleri pilot araştırma fonu tarafından finanse edilmiştir<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">(https://www.nih.gov/</a>), ve Güney Carolina Tıp Üniversitesi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü fonları. Marijne Smiths'e röportaj açıklamalarını kaydettiği için teşekkür ederiz.

Tüm hayvanlar AAALAC onaylı bir tesiste barındı ve bakımını aldı ve bu protokolde açıklanan deneyler MUSC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Karşılıklı transplantasyonda kullanılacak hayvanlar, en az 6 nesil boyunca konjenikojenik durum tercih edilen veya backcrossed olan, inbred veya izojenik bir tür olmalıdır.
1. Hasat donör sıçan meme bezi epitel
<ol><li>Transplantasyon için gerekli donör sıçan sayısını belirleyin. N...

Bu protokol, sıçanlarla çalışmak için optimize edilmiş bir meme epitel hücre nakli tekniğini tanımlar. Donör sıçanlardan izole edilmiş meme epitel organoidleri (3-5 haftalık yaş) alıcı sıçanların interskapular beyaz yağ yastığına (ayrıca 3-5 haftalık) aşılanır. Sonuçlar 4-6 hafta sonra, aşılı dokuyu incelemek için ışık mikroskobu kullanılarak yorumlanabilir; ancak, tam bir deney uygulamadan önce transplantasyon ve kurban arasında en uygun süre belirlenmelidir. Çok az veya çok f...

Postnatal meme bezi gelişimi ve duktal morfogenez büyük ölçüde ergenlik başlangıcında hormonal sinyal etkilenir süreçlerdir. Farelerde ve sıçanlarda, meme bezi biyolojisinin yaygın olarak kullanılan model organizmalar, bu süreç yaş yaklaşık 3 hafta başlar, hızlı çoğalma ve farklılaşma olgun parankim oluşumuile sonuçlanır. Olgun meme bezi genişleme ve involution, erken20. Hiperproliferasyon ve kanser gelişimi bağlamında, meme bezi transplantasyon teknikleri 1950'lerde geliştirilmiş ve 1977 yılında Gould ve ark. tarafından katkıda kantitatif metodoloji ile geliştirilmiş2,3,4. Kemirgenlerde transplantasyon tekniğinin iyileştirilmesi, çeşitli tedavilerin ve genetik manipülasyonun normal meme bezi gelişimi ve hastalık durumları üzerindeki etkisini incelemek için hala yaygın olarak kullanılan normal meme bezi biyolojisinin anlaşılmasında önemli ilerlemelere katkıda bulunmuştur.
Birçok hipotez ler üretilmiş ve daha sonra meme bezi nakli kullanılarak test edilmiştir, ilk olarak DeOme ve ark. tarafından 19591. Birkaç on yıl boyunca deneyler tüm yağ pedi yeniden doldurmak için donör meme bezleri nden excised duktal doku eğilimi gösterdi5,6,7 ve meme bezi gelişiminin kritik bir bileşeni bu epitel yapılarda bulunduğunu belirtti. Farelerde daha sonra yapılan çalışmalar, tek bir meme kök hücresi temizlenmiş bir yağ yastığı yeniden doldurmak ve bazal ve luminal meme epitel hücrelerinin tek, ortak atasının keşfine katkıda bulundu gösterdi8,9,10. Bu sonuçlar doğrultusunda, bu transplantasyon plastisite sonucu multilineage-repopulating potansiyeli ile hücrelerin havuzu artırır, aşılanmış hücrelerin fonksiyonel bir memebezi7büyümeye izin,10,11,12,13olduğu ileri sürülmüştür. Daha da önemlisi, kemirgenlerde transplantasyon tekniklerinin kullanımı hücre kültürüne bağlı anormalliklerin14'ün sınırlarını aşar ve genellikle sadece birkaç hafta içinde sonuç verir.
Prosedür aslında farelerde preneoplastik lezyonlar bağlamında açıklanan iken, yakında sıçanlara genişletilmiş ve kanser duyarlılığı bir ölçüsü olarak çokluk kurmak için kanserojen tedavi ile birlikte kullanılan15, ama transplantasyon teknikleri popülaritesi her tür için genetik araçların geliştirilmesi izledi. Transplantasyon içeren fare çalışmaları birçok çeviri bulgular katkıda bulunmuş olsa da, sıçan meme bezinin parankim daha yakından insan benzer16,17 ve östrojen reseptörü-pozitif çalışma için farklı avantajlar sunuyor (ER +) meme kanseri. Meme tümörleri her iki türde de indükleyicidir, ancak hormon duyarlılığı ve gen ekspresyonu profilleri açısından farklılık gösterirler. Birincil bir fark sıçan meme tümörleri ifade ve yumurtalık ve hipofiz hormon reseptörlerinin işlevine bağlıdır, yani, östrojen ve progesteron (PR), insan meme kanseriluma benzer-A alt tipi. Nitekim, meme epitel hücre nakli, bu protokolde açıklandığı gibi, meme kanseri nde yer genetik varyantları incelemek ve meme epitel hücreleri üzerindeki etkilerihücresel özerkliğini belirlemek için kullanılmıştır18.
Tümör biyolojisine ek olarak, normal sıçan meme bezinin duktal epitel dallanma daha yüksek bir düzeyde sergiler ve fare daha stroma daha kalın bir tabaka ile çevrilidir. Meme epitelyal transplantasyon çalışmalarında stromanın önemi iyi belgelenmiştir. Meme epitel yağ stroma ile etkileşim gerekir, ve ideal olarak kendi mezenkim, karakteristik morfogenez geçmesiiçin 19,20. Alıcı meme beziiçine doku aşılama optimal bir ortam sağlar; ancak, endojen epitel varlığı sonuçları etkileyebilir. Endojen epitelin meme bezinin temizlenmesi genellikle fare transplantasyonu tahlillerinde yapılır ve endojen meme dokusunun cerrahi eksizyonu ve/veya meme ucunun çıkarılmasını gerektirir1,21,22. Mümkün olsa da, post-kesişen sıçanlarda meme epitel preclearing yaygın olarak gerçekleştirilen değildir, özellikle post-kesen sıçanlarda büyüyen meme ağacı temizleme etkisizliği nedeniyle. Vücudun başka bir yerinde yağ dokusu bölgeleri nakledilen meme epitel büyümesini destekleyebilir gösterilmiştir beri21,23,24, interscapular beyaz yağ yastığı içine doku aşılayarak sıçanlarda preclearing süreci kolayca önlenebilir.
Bu yazıda açıklanan transplantasyon yöntemi enzimatik olarak ayrıştırılmış meme bezi organoidlerinin (meme duktal epitel ve morfogenez yeteneğine sahip diğer hücre tipleri parçaları) veya laboratuvar sıçanlarının inbred, izojenik veya konjenik suşları interskapular yağ yastığı içine monodispersed hücrelerin enjeksiyonu içerir2. Interscapular yağ yastığı normalde meme dokusu yoksun olduğundan, endojen epitel önceden temizlemek için gerek kalmadan birden fazla transplantasyon siteleri için uygun bir ortam sağlar. Sonuç olarak, konak hayvanın endojen, abdominal-inguinal meme bezleri cerrahi manipülasyona tabi değildir, normal gelişir ve sonuçların yorumlanmasına engel olamaz. Ayrıca, bozulmamış meme bezleri memmary epitel gelişimi ve tümörigenez18,25konak karşı donör etkilerini değerlendirmek için karşılaştırma için kullanılabilir. Tek bir kök hücreden meme bezinin repopülasyonfareler için kullanılabilir olmasına rağmen, henüz sıçan için geliştirilmiş değil, özellikle sıçan meme kök hücreleri için seçmek için antikorların durumu eksikliği nedeniyle25,26,27. Buna rağmen, repopulating potansiyelini ölçmek için monodispersedilmiş meme epitel hücrelerinin nakli başarıyla yapılabilir, ve bu hücreler uygunçerçeve2,3,4aşılı zaman normal gelişecektir . Organoidler birçok amaç için iyi olsa da, monodispersed hücreler kantitatif uygulamalar için gereklidir, örneğin, iyonlaştırıcı radyasyon tedavisi28 aşağıdaki kanser inisiyasyonu için gerekli meme epitel hücrelerinin sayısını belirlemek için veya akış sitometrik olarak seçilmiş meme epitel hücre popülasyonlarının özelliklerini karşılaştırmak için29.
Bugüne kadar, burada açıklanan prosedür meme bezi gelişimi ve meme kanseri gelişimi altında yatan mekanizmaları çalışma genel bir amacı ile sıçanda meme bezi nakli gerçekleştirmek için en sağlam yöntemdir. Genellikle, donör ve / veya alıcı hayvanlar önce farklı değişkenlere maruz kalan, sırasında veya epitel nakli nden sonra. Örnekler kimyasal karsinogenez içeren tek gen çalışmaları içerir30, radyasyon28,31,32, konak / donör genom genetik manipülasyon18, ve hormonal manipülasyon12. Bu protokolde tanımlanan enzimatik ayrışmanın en önemli avantajı, akış sitometrisi, 3-B kültürü, gen düzenleme ve daha fazlasını içeren tamamlayıcı deneyler için epitel organoidleri veya monodispersi hücreleri izole etme fırsatıdır. Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları genetik mühendisliği ile donör ve / veya konak doku ek manipülasyon içerecektir. Örneğin, donör hücreler CRISPR-Cas9 gen düzenleme sistemi kullanılarak seçilen herhangi bir genomik lokusta genetik olarak ex vivo değiştirilebilir. Benzer şekilde, alıcı sıçanlar da genetik donör ve alıcı mühendislik genetik faktörler arasındaki etkileşimi incelemek için değiştirilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;M syringe filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-715G</td>
			<td>sterile-filtering collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td>filtering brain homogenate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 uL gastight syringes with 25 gauge needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81001 &#38; 90525</td>
			<td>For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 uL pipette tips + pipette</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>transferring cells/mixtures/tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352196</td>
			<td>brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;M cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td>filtering organoids after washing the cell pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td>for collagenase digestion of donor mammary gland tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130181</td>
			<td>for mincing tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alum Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>243361/237086</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia vaporizer for veterinary use</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-dine or iodine</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass culture tube for homogenization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td>for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carmine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6152/1022</td>
			<td>staining mammary gland whole mount slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting apparatus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean animal cages for recovery</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 3</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS004183</td>
			<td>enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for chemical solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11320033</td>
			<td>for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2705/2701</td>
			<td>mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>-</td>
			<td>inactivation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-212</td>
			<td>use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>-</td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pads</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets (x2)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital rotation</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>must be capable of maintaining 37&#176;C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthesia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope or digital camera</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>TissueMiser or alternative models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td>long-term storage of cleared mammary gland whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks for anesthesia vaporizer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>follow institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels or delicate task wipes</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively-charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P4981-001</td>
			<td>mammary gland tissue whole mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postoperative analgesic</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Institutional protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>electric clippers, or other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jars</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile field drapes</td>
			<td>IMCO</td>
			<td>4410-IMC</td>
			<td>used during transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>autoclave surgical tools used for donors and recipients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes: 5 mL (or greater)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for sterile filtration of collagenase digestion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td></td>
			<td>monodispersion mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier, clips, and removal tool</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12020-00</td>
			<td>Closing the skin incision over the interscapular white pad pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>clearing mammary gland whole mount slides after staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rat mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad

1970'lerin başlarında araştırmacılar, meme epitel hücrelerini farelerin kesiler arası beyaz yağ yastığına başarıyla naklettiler. Transplantasyon teknikleri kullanılarak meme epitelinin aşılanması, ergen kemirgen konaktarafından sağlanan hormonal ortamdan yararlanır. Bu çalışmalar ideal meme bezi gelişimi üzerinde çeşitli biyolojik manipülasyonlar etkisini keşfetmek ve meme bezi biyolojisi birçok yönlerini incelemek için uygundur. Yaygın ama sınırlayıcı bir özellik, nakledilen epitel hücrelerinin çevredeki stromadan güçlü bir şekilde etkilenmesi ve endojen epitelile daha fazla rekabet etmiş olmasıdır; yerli meme dokusu kullanmak için, karın-inguinal beyaz yağ yastığı transplantasyon öncesi ev sahibi meme epitel kaldırmak için temizlenmelidir. Fare modeli organizma kullanırken önemli bir engel post-kesilmiş sıçanlarda gelişmekte olan meme ağacı temizleme verimli değildir. Bezsiz yağ pedleri içine nakledildiğinde, donör epitel hücreleri temizlenmiş konak yağ pedi yeniden doldurmak ve fonksiyonel bir meme bezi oluşturabilirsiniz. Interscapular yağ yastığı bu greftler için alternatif bir yerdir. Önemli bir avantajı, duktal yapılar henüz epitel büyümesini teşvik etmek için gerekli olan ve sıçan kolayca erişilebilir normal stroma sağlar olmasıdır. Bu tekniğin bir diğer önemli avantajı minimal invaziv olmasıdır, çünkü büyüyen endojen meme ağacını kaldırma ihtiyacını ortadan kaldırır. Ayrıca, interscapular yağ yastığı aşılama için ayrı siteler için kullanılabilecek bir medial kan damarı içerir. Endojen bezleri bozulmamış kalır çünkü, Bu teknik de nakledilen bezi endojen meme bezi karşılaştırarak çalışmalar için kullanılabilir. Bu yazıda farelerin interscapular beyaz yağ yastığı içine meme epitel hücre nakli yöntemi açıklanmaktadır.

Donör ve alıcı meme bezleri Sıçan meme epitel hücrelerini organ nakli için izole etme ve hazırlama adımları Şekil 1A'dagösterilmiştir. 4 haftalık ken, donör sıçan Endojen meme bezi olgunlaşma başladı ve epitel alum karmin ile boyanmış tüm monte slaytlar üzerinde görüntülenebilir (Şekil 1B). Bu yaştaki bir donör sıçan...

Watch this Scientific Journal Video about Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad at JoVE.com

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad (Video) | JoVE

Bu makalede, alıcı hayvanların interscapular beyaz yağ yastığı içine donör sıçan meme epitel hücreleri greft bir transplantasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, meme epitel gelişimi üzerindeki konak ve/veya donör etkilerini incelemek ve ön temizleme ihtiyacını ortadan kaldırmak ve böylece bu tekniğin kullanışlılığını genişletmek için kullanılabilir.

Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Bu protokol 40 yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır ve sıçanda meme hücre nakli tahlilleri için tek güvenilir yöntem olmaya devam etmektedir. Bu yöntem yaygın meme kanseri duyarlılık araştırmalarında meme hücresi otonom karşı konak etkileri sorgulamak için kullanılır. Interscapular yağ yastığı aşılama ile, bu yöntem sıçanlarda etkili değildir endojen membran epitel temizlemek zorunda atlatır.Bu nedenle yöntem daha az invaziv ve endojen meme bezleri bir iç kontrol olarak kullanılabilir. Bu işlem başlamak için, sırtına bir ötenazi dişi sıçan yerleştirin ve iğneler ile güvenli. Sprey tüm ventral yüzey% 70 etanol ile.Torasik erişim sağlayan bir sagittal Y şeklinde kesi olun, karın, ve inguinal meme bezleri. Donör sıçan tüm meme bezi dokusunu incelemek ve tüm görünür lenf düğümlerini kaldırmak için makas kullanın. Sonra, meme dokusu ayıklamak için forceps kullanın.500 mikrolitre serumsuz DMEM F12 ortam içeren etiketli 60 milimetrelik bir tabağa yerleştirin ve buzda tutun. Sonra ince meme dokusu kıyma makas kullanın. İlk olarak, dikkatli bir şekilde uygun bir pozisyonda yerleştirmek ve iğneler ile güvenli donör hayvanın vücut açın.Sprey baş ve üst sırt% 70 etanol ile. Kafatasının tabanını bulun ve oksipital konilerlenin altına bir kesi yapın, derinin altına keskin makas yerleştirin ve başın kenarları da dahil olmak üzere kafatasından deriyi kesin. Daha sonra, kemik kesiciler veya güçlü makas kullanın oksipital frontal kemiklere orta hat boyunca kafatası kesmek için mümkün olduğunca yüzeysel ve altta yatan beyin dokusunun imha önlemek için yukarı doğru açılı olarak bıçak tutmak için emin olun.Kemiği soymak için Rongeurs veya güçlü forceps kullanın. Her iki tarafta kemik kırmak için beyincik için aracı lateral yerleştirin. İşitsel kanalı tamamen teşhir ederek menenjlerle olan bağlantılarını kes.Beyni kafatasından çıkarmak ve ağırlığını kaydetmek için kavisli ince uçlu forseps kullanın. Ek donör beyinler için malzemeleri taze bir başlangıç kullanın. Hemen buz üzerinde depolanan ortam eşit miktarda içeren 15 mililitrelik bir tüp aktarın.Düşük hızda 10 ila 15 saniye boyunca beyni homojenize edin. Sonra büyük parçaları kaldırmak için homojen filtre. Sıvıyı ihtiyaç duyulana kadar buzüzerinde saklayın.İlk olarak, 1.000 mikrolitrelik pipet ucunun ucundan bir santimetre kesin ve pipettorun üzerine manuel olarak yerleştirin. Her 60 milimetrelik çanak tan kolajenaz sindirim tüpü için kıyma donör doku aktarmak için kesilmiş bir pipet ucu kullanın. Kıymalı dokuyu bir veya iki kez yukarı ve aşağı boruyla karıştırarak hafifçe karıştırın.Daha sonra numuneleri sallayarak kuvözde yatay bir pozisyonda sabitleyin. 200 ve 220 RPM arasında bir hızda sallayarak 37 santigrat derece 1,5 ila iki saat boyunca sindirmek için örnekler izin verin. Donör meme bezi dokusu tamamen sindirildiğinde, süspansiyonu 1,200 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.Bir pelet oluşmuştur sağladıktan sonra, yağ tabakası kaldırmak için bir pipet kullanın veya dikkatle supernatant dökün. Peleti 10 mililitre taze DMEM F12 ortamla hafifçe askıya alın. Hücreleri iyice yıkamak için bu işlemi tekrarlayın.Her donör hayvan için 40 mikrometresüz bir 50 mililitrelik tüp hazırlayın. Süzgeci en az bir mililitre DMEM F12 media ile önceden ısla. Sonra kanal parçaları veya organoidler toplamak için filtre yoluyla hücre süspansiyon geçmek için bir pipet kullanın.Organoidler için, sadece filtrede kalan hücreleri saklayın. Yeni bir 50 mililitrelik tüp üzerinde hücre süzgeci ters ve steril ortam herhangi bir hacim ile durulayın tüm hücreleri toplamak için gerekli. Bundan sonra, bir kez daha hücreleri pelet ve sayma için medya küçük bir hacim içinde resuspend.Tüm nakil alıcıları için, hücre süspansiyonunun eşit hacimli ve her nakil bölgesi için %50 beyin homojenate'i birleştirerek tek bir donör malzeme toplu hazırlayın. İlk olarak, kafatasıtabanını belirleyin ve alıcı bir hayvan üzerinde vertebral sütunun başlangıcı. Omurganın aşağı yaslanmış yolun yaklaşık üçte biri, sırtın üst torasik kısmında iki santimetrelik bir alana üç santimetre tıraş.Daha sonra, ameliyat için kullanılacak steril alanı hazırlamak ve gerekli tüm malzemeleri düzenlemek. Hamilton şırıngalarını steril DMEM F12 ortamlarıyla yıkayın ve hücre kaybını önleyin. Her durum için ayrı bir şırınga içine donör malzemenin tüm hacmi yükleyin.Şırınga tamamen yüklendikten sonra, onu ters çevirin ve iğnenin ucundaki hava kabarcıklarını çıkarmak için pistonu hafifçe bastırın. Prosedür boyunca şırıngayı buzda tutun. Hayvan ın derin uyaranlara karşı tepkisiz kaldığından emin olun.Sonra küçük bir interscapular kesi yapmak için keskin bir cerrahi bıçak kullanın. Oryantasyon için medial kan damarını bulun ve kesinin bir tarafındaki deriyi kaldırmak için forseps kullanın. Yağ yastığıuzak deri tutun ve nakil yapılırken altta yatan kahverengi yağ kaçının.Sonra iğneyi greft bölgesine takın. Hücre karışımının 40 mikrolitresini interskapular beyaz yağ yastığı dokusuna dikkatlice enjekte edin. İğneyi yavaşça çıkar.Dokuyu yerinde tutun ve nakledilen hücrelerin 3-5 saniye yerleşmesine izin verin. Daha önce transplantasyon ikinci yerinde açıklandığı gibi tüm enjeksiyon prosedürü tekrarlayın. Bundan sonra, yara klipleri veya dikişler kullanarak cerrahi yara kapatın ve daha sonra anestezi durdurun.Hayvanı feda ettikten sonra, diseksiyon için hazırlayın. Interskapular yağ yastığında greft bölgelerini ayıran medial kan damarını belirleyin. Tek bir doku parçası olarak tüm pedi çıkar.Tüm montaj için pozitif yüklü mikroskop slayt üzerinde doku yerleştirin. Doku yağlamak için yedi ila 10 gün boyunca% 70 etanol slaytlar yerleştirin. Sonra şap karmin leke hazırlamak ve doku yeterince opak olduğunda slaytlar süreci.İşlem tamamlandığında ve slayttaki doku temizlendiğinde, analiz için slaytların görüntülerini elde etmek için düşük güçlü ışık mikroskobu veya yüksek çözünürlüklü dijital fotoğraf kullanın. Bu çalışmada, meme epitel hücreleri donör sıçanlardan izole meme epitel organoidler alıcı sıçanların interscapular beyaz yağ yastığı içine aşılanır sıçanlar ile çalışmak için optimize edilmiş bir teknik kullanılarak nakledilir. Epitelin varlığı, yokluğu veya bolluğu, deneyin başarısını ve deneysel değişkenlerle ilgili etkilerin özerkliğini belirlemek için değerlendirilebilir.Her faktörün vahşi tip ekarşı nakavt gibi iki düzeyi olan karşılıklı transplantasyon deneyi hipotez testi için dört nakil grubu oluşturacaktır. Burada gösterilen temsili tüm monte interscapular yağ yastığı transplantasyon her iki sitede olumlu epitel outgrowth içerir. Slaytlar analiz edilirken, birçok örnek arasında interscapular yağ yastığı epitel eksikliği prosedür ile teknik bir sorun gösterebilir ve olumsuz bir sonuç olarak ele alınmalıdır.Donör epitel büyüme de endojen meme bezi ile karşılaştırılabilir ve ek sonuçlar kolaylaştırabilir. Burada gösterilen örnekte, yabani tip ve CDKN1B nakavt sıçanlar kullanılarak karşılıklı transplantasyon sonuçları meme bezi gelişimi üzerinde non-meme hücre otonom etkileri önerdi. Donör epitel hücreleri ve organoidler dikkatle hazırlanmış ve alıcı hayvan içine enjekte kadar canlı tutulmalıdır unutmayın.Önceden planlamak ve prosedürü dikkatli ve kesintisiz olarak gerçekleştirmek zorunludur. Meme kanserinin etiyolojisinde veya tedavisinde meme hücre özerkliğini sorgulamak için transplantasyon sonrası primer karsinogenez tahlilleri yapılabilir. Gen düzenleme de genetik donör hücreleri veya alıcı sıçan mühendisi dahil edilebilir.Sıçanlarda meme epitel hücre naklinin tek yöntemi olan bu işlem meme bezi gelişimini ve karsinogenez çalışmalarını kolaylaştırır. Bu teknik özellikle meme kanseri hücreleri ve/veya meme epitel hücreleri arasındaki etkileşimleri konak mikroçevre ile araştırmak için önemlidir. Meme bezi gelişiminde ve meme kanseri araştırmalarında çalışmalara olanak sağlar.Bu tekniği ilk kez deneyenler, maksimum hücre verimi ve canlılığını sağlamak için donör hücre preparatlarını optimize etmeli, daha sonra cerrahi prosedürleri uygulamak ve enjekte etmek için hücre sayılarını belirlemek ve ayrıca deneyler için gerekli cerrahi sonrası kuluçka sürelerini belirlemek için küçük pilot deneyler yapmalıdır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis (Video) | JoVE

Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji<emDe Novo</emMeme Kanseri Metastazı

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response (Video) | JoVE

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60 (Video) | JoVE

Meme epitel hücre göç TIP60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE

Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation (Video) | JoVE

Geri dönüşü olmayan Elektroporasyon etkilerini incelemek için bir Syngeneic pankreas kanseri fare modeli

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad (Video) | JoVE

Fareler meme yağ yastığı içine meme kanser hücrelerinin Orthotopic enjeksiyon

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function (Video) | JoVE

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland (Video) | JoVE

CRE-ifade Adenovirus fare mammary bezi içine bir Intraductal enjeksiyon yoluyla meme kanseri modelleme

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture (Video) | JoVE

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells (Video) | JoVE

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...