Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

وكان هذا العمل مدعوما من قبل La رابطه المكافحة السرطان إلى الجهد الحاد والماجستير ، والرابطة من أجل البحوث والسرطان إلى PS ، الانكا (معهد السرطان الوطنية) و Canceropole باكا إلى التنفيذ المشترك. مرفق الطيف الكتلي من البروتينات مرسيليا (marseille-proteomique.univ-amu.fr) بدعم من IBISA (البنية التحتية بيولوج Santé et Agronomie) ، الهضبة التكنولوجية ايكس مرسيليا ، والمركز الكبير ، بروفانس-ألب-كوت دازور ريجيون ، ومعهد باولي-كالميتيتس ، ومركز البحوث الخاصة بمرسيليا.

1. توليد خطوط الخلايا مستقره التعبير عن 6His-العلم-Ubl
ملاحظه: الانتقال المشترك للخلايا 293T مع Pكونتيننت-6HF-Ubl ، pVSVG ودلتا-المساعد.
<ol><li>اليوم 0: البذور 293T الخلايا في لوحه 6 حسنا للحصول علي 50-70 ٪ التقاء في اليوم التالي.</li>
	<li>اليوم الأول: شارك في transfect 50-70 ٪ متموج الخلايا مع مزيج من 1 ميك?...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

لقد وضعنا منهجيه قويه وموثوق بها لتوليد لمحات من البروتينات التي تم تعديلها من قبل أعضاء الاسره الرئيسية اوبيكويتين. في الواقع ، لقد نجحنا في تطبيق هذا البروتوكول لتوليد لمحات من PTMs من قبل اوبيكويتين ، وأيضا من قبل السومو و Nedd8 ، وللكشف عن التعديلات المرتبطة بالعلاج7، استجابه ...

الطريقة المقترحة هنا مكرسه لدراسة PTMs بوساطة افراد الاسره اوبيكويتين من خلايا الثدييات مثقف من أجل تحديد التغييرات المحتملة المرتبطة بحاله معينه (العلاج ، والتمايز ، الخ). PTMs تمثل الخطوة الاخيره من تنظيم وظائف البروتينات1. في الواقع ، مره واحده التي تنتجها آلات الانتقالية ، ومعظم ان لم يكن جميع البروتينات الخضوع لأنواع مختلفه من PTMs التي تعدل نشاطها ، والتفاعلات الجزيئية ، والموقع داخل الخلايا1. من بين عدد كبير من PTMs هي تلك التي توسط من قبل عائله اوبيكييتين من البروتينات ، اوبيكويتين نفسها وجميع الأمثال اوبيكويتين ، لديها القدرة علي تنظيم جميع البروتينات الخلوية أو جزئيا الخلايا الدهنية2. لأنها هي نفسها البروتينات ، ويمكن ان تكون مترافقة مع بعضها البعض ، وتشكيل سلاسل متجانسة وغير متجانسة من طبولوجيا متنوعة ، كل المرتبطة بوظائف تنظيميه محدده2. هناك حاجه إلى أدوات لمحاولة فك وفهم هذه آلات المعقدة. تم تطوير العديد من النهج في جميع انحاء العالم ، وجود مزاياها وعيوبها الخاصة ، وهنا نقترح واحده مع أداء عاليه مناسبه للخلايا مثقف.
الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي دقتها. في الواقع ، يتم تحسين نقاء البروتينات المعدلة المعزولة بشكل كبير من خلال استخدام التوافقية اثنين من العلامات (6 له والعلم) والاجراء خطوتين ، التالي فانه هو أكثر انتقائية بكثير من الانصهار علامة واحده Ub/ubl3،4. ان وجود العلامة السادسة يتيح الخطوة الاولي لتنقيه الحالة بشكل كامل التالي تجنب اي تنقيه مشتركه للبروتينات التي تحتوي علي النطاقات الملزمة بالبالكامل أو البروتينات الأخرى الملزمة لتلك البروتينات. هذه هي مشكله تقنيه واجهتها العديد من النهج الأخرى علي أساس التقارب تنقيه البروتينات اوبيتامينيد باستخدام اما الأجسام المضادة المحددة5 أو جنبا بالترادف العناصر الملزمة (أنابيب)6. الأهم من ذلك ، فان هذه التقنية ليست متحيزة لصالح تنقيه نوع معين من العرافة ، كما انه يمكن ان يكون الحال بالنسبة لبعض النهج الأخرى ، لأنه تم تحديد كل من أحاديه وأنواع مختلفه من polyubiquitinations7. التالي ، وبمجرد العثور عليها ، سيكون من الممكن دراسة تغيير في الكل بمزيد من التفاصيل عن طريق النهج الكيميائية الحيوية القياسية من أجل التعرف علي النوع الدقيق من الرغبة المطلقة المعنية.
وأخيرا ، ميزه تقنيه أخرى من هذا البروتوكول هو استخدام لينتيفيروسيس ، التي بسهوله وسرعه يخلق مستقره خطوط الخلايا التعبير مع مستوي معقول من التعبيرات معدل الموسومة دون التدخل في السلوك الخلوي العادي.
في حين ان أحد الأدوار الهامه للإبداء هو استهداف البروتينات للتحلل البروتيني ، فمن المعروف الآن ان لديها العديد من الخصائص التنظيمية الأخرى للبروتينات المحتملة داخل الخلايا أو جزئيا1. زادت الرقم من هذا اعمال أكثر بالوجود من كثير [اوبيقوتين] مثل بروتينات, يشكل أسره البروتينات ينظم تقريبا كل خليه اليه1. تعديلاتها يمكن ان يكون لها تاثير جذري علي بيولوجيا الخلية ، ويمكن ان يؤدي أو المشاركة في الحالات المرضية8، مثل السرطان9. التالي ، هناك حاجه إلى أدوات لاستكشاف هذه المناظر الطبيعية الشاسعة وتحديد التعديلات المرتبطة بحاله مرضيه يمكن ان تكون بمثابه أهداف علاجيه جديده.
ويكرس هذا البروتوكول للخلايا في الثقافة لأنها تحتاج إلى ان تكون محوله للتعبير عن الخارجية الموسومة Ub/Ubl. وبمجرد إنشائها ، يمكن استخدام هذه الخطوط الخلوية المستقرة لتوليد ملفات Ubl من الثقافة في 2D أو 3D أو xenografts ، التالي توسيع أفق النماذج التجريبية المختلفة التي يمكن تطبيقها لدراسة لمحات PTMs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

اوبيكويتين (ub) و اوبيكويتين (ubl) تعتمد التعديلات بعد الانتقالية من البروتينات تلعب الأدوار التنظيمية البيولوجية الاساسيه داخل الخلية عن طريق التحكم في استقرار البروتين ، والنشاط ، والتفاعلات ، وتوطين الخلايا. فهي تمكن الخلية من الاستجابة للإشارات والتكيف مع التغيرات في بيئتها. التعديلات داخل هذه أليات يمكن ان يؤدي إلى حالات مرضيه شديده مثل امراض الأعصاب والسرطان. والهدف من هذه التقنية الموصوفة هنا هو إنشاء ملفات PTMs التابعة ل ub/ubls ، بسرعة ودقه ، من خطوط الخلايا المستزرعة. وتسمح المقارنة بين الملامح المختلفة التي يتم الحصول عليها من ظروف مختلفه بتحديد التعديلات المحددة ، مثل تلك التي يسببها العلاج علي سبيل المثال. يتم تنفيذ لينتيفيرال الخلية بوساطة لإنشاء خطوط خلايا مستقره التعبير عن اثنين من العلامات (6 له والعلم) الإصدار من المعدل (اوبيكويتين أو ubl مثل SUMO1 أو Nedd8). هذه العلامات تسمح لتنقيه اوبيكويتين التالي من البروتينات اوبيتاميناتيد من الخلايا. ويتم ذلك من خلال عمليه تنقيه من خطوتين: يتم تنفيذ أول واحد في ظروف التعتيم باستخدام علامة 6 له ، والثانية في الظروف الاصليه باستخدام علامة العلم. وهذا يؤدي إلى عزله شديده التحديد ونقيه من البروتينات المعدلة التي يتم تحديدها فيما بعد ونصف الكمية بواسطة اللوني السائل متبوعا بتكنولوجيا الطيف الكتلي (LC-MS/MS) الترادفية. يتيح التحليل المعلوماتي السهل لبيانات MS باستخدام برنامج Excel إنشاء ملفات تعريف PTM عن طريق القضاء علي إشارات الخلفية. وتقارن هذه التوصيفات بين كل حاله من أجل تحديد التعديلات المحددة التي ستدرس بعد ذلك بشكل أكثر تحديدا ، بدءا من التحقق من صحتها بواسطة تقنيات الكيمياء الحيوية القياسية.

توصيل خلايا الثدييات الثقافية لإنشاء خلايا GFP و 6HF-Ub التي تعبر عن لإنتاج لينتيفيروسيس التي سيتم استخدامها في وقت لاحق إلى transduce MiaPaCa-2 الخلايا ، 70 ٪ متموج يشيك-293T الخلايا هي المشتركة مع كميه متساوية من المتجات الثلاثة ، Pكونتيننت-6HF-اوبيكويتين أو GFP/دلتا-المساعد/pvSv...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء اوبيكييتين (Ub) و اوبيكويتين-أمثال (Ubls) بروتينيه محدده من أجل تحديد التعديلات من هذا النوع من التعديلات بعد الانتقالية (PTMs) ، المرتبطة بحاله معينه مثل العلاج أو النمط الظاهري.

تنميط اوبيكويتين و اوبيكويتين-مثل التعديلات اللاحقة الانتقالية وتحديد التعديلات الهامه

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

هذا البروتوكول هو وسيلة سهلة لتوليد ملامح من كل مكان و في كل مكان مثل التعديلات ما بعد الترجمة من خلال تحديد وشبه الكمي بروتينات محددة محددة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام فيروسات العدس لإنشاء خط تعبير خلية مستقر في غضون أسبوع ، واستخدام اثنين من العلامات لتنقية البروتينات على وجه التحديد. في الواقع ، وهذا النوع من التعديلات بعد الترجمة تشارك في معظم الوظائف البيولوجية ، والتغيرات في هذه الآلية وجدت في معظم الأمراض.ولذلك، فإن تحديد هذه التعديلات قد يكون بمثابة تشخيص و/أو تشخيص، وبالطبع كأهداف جزيئية. يوبيكيتين هو واحد من البروتين الأكثر حفظا في الخلايا eukaryotic وهذا ضروري لبقائهم. لذلك، يمكن تطبيق هذا النوع من الأسلوب على أي نموذج eukaryotic، من الثدييات إلى الخميرة.ومع ذلك، يقتصر نظامنا العدتي فيروسي لدراسة الخلايا. منذ الإجراء كله طويل جدا مع وقت الحضانة في بعض الأحيان طويلة، فمن الممكن أن تفعل ذلك على مدى يومين بدلا من واحد. يمكن تجميد الـ eluate من حبات النيكل عند ناقص 20 وقبل إضافة حبات العلم.يحتوي هذا البروتوكول على العديد من الخطوات التي من بينها بعض حاسمة من أجل ضمان النجاح النهائي لتنقية، وبالتالي إنشاء دقيق لملف تعريف التعديل ما بعد الترجمة. سيتم إجراء إثبات الإجراء من قبل ميرنا سوايدن وأوريلي دوبريك، وهما طالبان دكتوراه في المختبر. للبدء، إضافة 0.5 مرات 10 إلى السادسة من خلايا HEK 293T في لوحة ستة جيدا مع اثنين من ملليلتر في بئر من DMEM مع 10٪ FBS إلى البذور، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، والرطوبة 100٪.في اليوم التالي، يتم تحقيق التقاء 50 إلى 70٪. Cotransfect الخلايا مع مزيج من ميكروغرام واحد من pCCL-6HF في كل مكان مثل أو pCCL-GFP، ميكروغرام واحد من برنامج تلفزيوني VG، وم ميكروغرام واحد من ناقلات مساعد دلتا باستخدام كاشف transfection وبروتوكول لإنتاج فيروس العدس. بعد ست ساعات من التهيّم، غيّر الوسيط إلى واحد جديد يقابل وسائل الخلايا التي سيتم تحويلها.بذور الخلايا التي سيتم تحويلها في لوحة ستة جيدا مع وسائل الإعلام الثقافة القياسية من أجل الحصول على 10 إلى 20٪ التقاء في اليوم التالي. بعد 24 ساعة من عملية التنا نقل المواليد، استرجع الوسيط الذي يحتوي على جزيئات العدسي، وتصفية باستخدام مرشحات 0.45 ميكرون. استبدال وسط الخلايا التي سيتم تحويلها بواسطة المتوسطة المصفاة التي تحتوي على فيروسات العدسية.احتضان الخلايا مع فيروسات العدس لمدة 24 إلى 72 ساعة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، ومن ثم تغيير المتوسطة مع الطازجة، واحدة القياسية. تحقق من تعبير GFP باستخدام مجهر فلوري مقلوب لتقييم كفاءة النقل. إذا لم يتم الكشف عن الفلوريس، انتظر لمدة يومين إلى ثلاثة أيام إضافية.إذا كان التحكم في GFP إيجابيًا مع الفلورس الخضراء ، قم بزراعة جميع الخلايا حتى يكون لديها ما يكفي لتنفيذ تحكم تعبير 6-THE-FLAG ubiquitin-like بواسطة الفلوروسين المناعي ، كما هو موضح هنا ، واللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة لـ FLAG. بعد زراعة الخلايا في أطباق 15 سنتيمترًا ، اغسل أطباق الثقافة مرة واحدة على الأقل مع محلول ملحي مؤقت بالفوسفات في درجة حرارة الغرفة. لبدء تحلل الخلايا، إضافة ملليلتر اثنين من العازلة واحدة في كل طبق 15 سنتيمترا في درجة حرارة الغرفة.استخدام مكشطة الخلية لاسترداد جميع lysates في أنابيب أجهزة الطرد المركزي المخروطية 50 ملليلتر. Sonicate lystates ثلاث مرات لمدة 30 ثانية ، مفصولة وقفة لمدة دقيقة واحدة. الطرد المركزي في lysates سونيكات في 15، 000 مرات ز لمدة 15 دقيقة.نقل المُنَتَكّير إلى أنبوب جديد من خلال مُزاج خلايا 40 ميكرون. من المهم جدا لتصفية lysates بعد صوتنة والطرد المركزي. عدم القيام بذلك قد يؤدي إلى copurification من العديد من البروتينات غير محددة، وبالتالي زيادة الخلفية وتقليل بقوة حجم ملف PTM.نقل كمية مساوية من البروتين بين 50 و 100 ملليغرام إلى أنابيب فالكون الجديدة. إضافة النيكل أيون NTA الخرز في كل أنبوب مع كمية من اثنين microliters من الخرز لكل ملليغرام واحد من البروتين. ضع الأنابيب على دوار لتدويرها عند 30 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين ونصف في درجة حرارة الغرفة.ثم بيليه الخرز في 500 مرات ز لمدة خمس دقائق. غسل الخرز مع ملليلتر واحد من واحد العازلة، ونقل العينات إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر. ضع الأنبوب على الجليد.غسل مرتين مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة العازلة اثنين تحتوي على 10 ملليمتر imidazole. إلى البروتينات المرتبطة بالليوتي، أضف 600 ميكرولترات من العازلة الثانية التي تحتوي على إيميدازول 250 ملليمولار، وتدوير لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية. بعد حنية الخرز عن طريق الطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة دقيقة واحدة، ونقل supernatant إلى أنبوب جديد قبل تبريد 1.5 ملليلتر، وإضافة 50 ميكرولترات من الخرز المضادة للأجسام المضادة للجسم M2 العلم.تدوير في 30 دورة في الدقيقة لمدة 2 1/2 ساعة في أربع درجات مئوية. ثم يغسل مرتين مع 500 ميكرولترات من العازلة اثنين، ثم مرتين مع 500 ميكرولترات من العازلة ثلاثة. ل elution النهائي، إضافة 100 ميكرولترات من العازلة ثلاثة تحتوي على ببتيد FLAG في 0.01 ميكروغرام لكل ميكرولتر، وتدوير في أربع درجات مئوية لمدة 1 1/2 ساعة.بعد الطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة دقيقة واحدة، ونقل عظمى إلى أنبوب جديد قبل التبريد. اتخاذ 10 ميكرولترات لتحميل على SDS-PAGE، وتنفيذ تلطيخ الفضة من هلام للسيطرة على جودة تنقية. إذا كانت تنقية تبدو جيدة، وتحليل 90٪ اليسار من قبل LC-MS.لتنفيذ التطبيع، استخدم الصيغ لتطبيع القيم بين الخلايا المعالجة بالعقاقير والخلايا غير المعالجة في كل مكان وGFP. لإزالة الخلفية، اطرح القيم في عينة التحكم GFP من القيم في عينات ubiquitin، للحصول على قيم محددة لكل بروتين محدد في كلتا الحالتين. للحصول على اختلاف في كل مكان، الحصول على درجة بين ناقص 100 زائد 100 للتغيرات الإيجابية والسلبية من PTMs الناجمة عن المخدرات.يتم تقسيم الفرق بين القيم المحددة للعينات المعالجة وغير المعالجة على مجموع جميع القيم، بما في ذلك تلك الموجودة في عنصر التحكم، ويتم ضربها في 100. الاختلافات تحت ناقص 50، تمثل قمع PTM، أو فوق 50، تمثل تحريض PTM، تعتبر كبيرة. استخدم هذه الصيغة للحصول على قيمة ثقة بين صفر و100٪ القيم فوق 50 عادة ما تعتبر واثقة.للحصول على توزيع أفضل لقيم الحث والقمع، وللحصول على المعلمات المختلفة والثقة، استخدم هذه الصيغة لمضاعفة قيم التباين والثقة. في هذه الدراسة، تم تحقيق نقل الخلايا الثديية الثقافة لإنشاء GFP و 6-الهستيدين العلم في كل مكان التعبير عن الخلايا. تم التحكم في فعالية عملية نقل فيروسات العدسي لأول مرة من خلال النظر إلى الفلورية GFP للخلايا المستحثة بواسطة GFP.تم التعبير عن FLAG-ubiquitin عن طريق تلطيخ الفلوروس المناعي باستخدام جسم مضاد لـ FLAG ، مما يظهر النسبة المئوية للخلايا المستحثة. من أجل السيطرة على مستوى التعبير من خارجية FLAG-ubiquitin، تم تحليل lysates من الخلايا المستحثة من قبل SDS-PAGE تليها لطخة الغربية مع الأجسام المضادة العلم. بعد تنقية البروتينات في كل مكان، تم استخدام 10٪ من elution النهائي للسيطرة على كمية وسلامة المواد النقية من قبل SDS-PAGE والفضة تلطيخ الجل.خلفية GFP عينة الطرح حددت 364 البروتينات في كل مكان بشكل ملحوظ مع درجة أعلى من 50٪ تم إجراء تحليل إثراء مجموعة الجينات من هذه البروتينات في كل مكان من أجل تسليط الضوء على العمليات البيولوجية التي كانت تشارك فيها. شبكات التفاعل المحتملة التي شكلتها التغييرات التي يسببها gemcitabine في كل مكان. وأدى ذلك إلى تحديد الشبكات التفاعلية الوظيفية التي تتأثر بشدة بزيادة أو نقصان انتشار البروتينات المعنية.كما تم التأكيد على أن انتشار PCNA ازداد بعد العلاج gemcitabine. من المهم جدا تجنب نقل بعض الخرز بعد كل من الخطوات elution، لأنه قد يؤدي إلى زيادة كبيرة في الخلفية. وسيولد هذا الإجراء تعديلات محددة بعد تحويلها، مما يتيح، بمقارنة الظروف المختلفة، تحديد تعديلات محددة.وستكون الخطوة التالية الأولى هي التحقق من صحة تغيرات الاهتمام على الأقل استناداً إلى النهج الكيميائية الحيوية. لقد طورنا هذه الطريقة لاستكشاف التعديلات القائمة على أساس ubiquitin ، بعد الترجمة من أجل تحديد طرق وآليات جديدة للخلايا السرطانية البنكرياس. منذ هذا البروتوكول وغيرها من المتقدمة في جميع أنحاء العالم وقد استخدمت بنجاح لفك العمليات البيولوجية المختلفة.يجب استخدام فيروسات العدس على الأقل في مختبر BL-2. غوانيدين هو وكيل denaturing قوية ويجب استخدامها بعناية. يمكن أن تكون أيضا sonicator ضارة للآذان ويجب أن تستخدم بعد التوصيات.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

طريقة لقياس الحمض النووي الريبي<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

عزل بروتينات الشعيرة المتوسطة من أنسجة الفئران المتعددة لدراسة التعديلات المرتبطة بالشيخوخة بعد الترجمة

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

استخدام نظام إثراء إيمونوبريسيبيتيشن شاملة لتحديد ملف تعريف تعديل بوستترانسلاشونال ذاتية للبروتينات المستهدفة

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome التنميط في الليشمانياوالخلايا البشرية والخصية الماوس

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

توصيف وظيفي لحلقه من نوع E3 اوبيكويتين الاربطه في المختبر وفي بلانتa

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

تنقية توبولين مع التعديلات ما بعد النقل الخاضعة للرقابة وIsotypes من مصادر محدودة من قبل دورات البلمرة- Depolymerization

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

استخراج جانجليوسيد وتنقيته وتوصيفه

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...