Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
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这项工作得到了癌症癌症与HV和MS的La Ligue Contre le，以及ARC（癌症再癌症协会）到PS、INCa（国家癌症研究所）和癌症PACA到JI的支持。马赛蛋白质组学（marseille-proteomique.univ-amu.fr）的质谱设施，由IBISA（基础设施生物学圣特和阿格罗诺米）、Plateforme技术系统艾克斯-马赛、坎塞罗佩莱PACA、普罗旺斯-阿尔卑斯-阿尔特斯-阿祖尔大学支持格雷戈里翁、保利-卡尔梅特研究所和马赛研究中心。

1. 生成表示 6His-Flag-Ubl 的稳定细胞系
注：用pCCL-6HF-Ubl、pVSVG和增量帮助器联合转染HEK-293T细胞。
<ol><li>第0天：种子293T细胞在6孔板获得50-70%汇合后天。</li>
	<li>第1天：联合转染50-70%的转染细胞，混合1μgpCL-6HF-Ubl或pCCL-GFP，1μgpVSVG和1μg的增量-帮助剂载体，使用转染试剂和试剂生产慢病毒。转染6小时后，将培养基改为与要转导的细胞对应的新鲜介质。将细胞分在6孔盘中，以便?...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

我们已经开发出一种强大而可靠的方法，用于生成由主要泛性家族成员修饰的蛋白质的配置文件。事实上，我们已经成功地应用了该协议，通过泛素、SUMO和Nedd8生成PTM的配置文件，并检测与治疗7相关的改变，以回应特定基因的过度表达或敲除（数据不显示）和在细胞中获得对各种化疗药物的耐药表型。
在操作程序过程中，操作者应小心的只是几个关键步骤?...

这里提出的方法致力于研究由培养的哺乳动物细胞中泛素家族成员介导的PTM，以便识别与特定条件（治疗、分化等）相关的潜在变化。PTM代表蛋白质功能调节的最后一步1。事实上，一旦由翻译机制产生，大多数（如果不是全部）蛋白质会经历不同类型的PTM，调节其活性、分子相互作用和细胞内位置1。在过多的PTM中，由无素蛋白家族、泛素本身和所有泛素样子介导，具有调节所有细胞内或部分细胞质蛋白2的潜力。因为它们本身是蛋白质，它们可以相互结合，形成不同拓扑的同质和异质链，每个与特定的调控函数2相关。需要工具来尝试破译和理解这个复杂的机器。世界各地的许多方法都是开发的，各有优缺点，在这里，我们提出了一种适合培养细胞的高性能方法。
该方法的主要优点是精度高。事实上，通过组合使用两个标记（6His和Flag）和两个步骤过程，分离修饰蛋白的纯度大大提高，因此它比单个标记融合Ub/Ubl3，4更具选择性。6His 标签的存在使纯化在完全变性条件下迈出了第一步，从而避免了任何含有泛素结合域的蛋白质或与泛素结合的其他蛋白质结合。这是一个技术问题，其他几个方法基于亲和纯化泛化蛋白酶使用特定抗体5或串联泛性结合元素（TUBEs）6。重要的是，这种技术没有偏向于对某种泛化的纯化，因为其他一些方法可能如此，因为单体和不同种类的多聚体被识别7。因此，一旦发现，泛化的变化将不得不更详细地研究标准生化方法，以确定所涉及的完全化的确切类型。
最后，该协议的另一个技术优势是使用慢病毒，它可以轻松快速地创建稳定的表达细胞系，具有合理的标记修饰剂表达水平，而不会干扰正常的细胞行为。
虽然泛化的一个重要作用是靶向蛋白进行蛋白体降解，但现在已知它具有许多其他调节特性，可能大多数细胞内或部分细胞内蛋白质1。这些功能的数量进一步增加与许多泛素像蛋白质的存在，形成一个蛋白质家族调节几乎每一个细胞机制1。它们的改变会对细胞生物学产生剧烈的影响，并可能导致或参与病理情况8，如癌症9。因此，需要工具来探索这一广阔的景观，并确定与病理学疾病相关的改变，可以作为新的治疗目标。
该协议专用于培养中的细胞，因为它们需要转导以表达外源标记 Ub/Ubl。一旦创建，这些稳定的细胞系可用于从 2D 或 3D 或异种移植培养物中生成 Ubl 轮廓，从而扩展可用于研究 PTM 轮廓的不同实验模型的视野。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

蛋白质的泛素（ub）和泛素样（ubl）依赖性转化后修饰通过控制蛋白质稳定性、活性、相互作用和细胞内定位，在细胞内发挥基本的生物调节作用。它们使细胞能够响应信号并适应其环境的变化。这些机制内的改变可能导致严重的病理情况，如神经退行性疾病和癌症。此处描述的技术的目的是从培养的细胞系快速准确地建立 ub/ubls 依赖型 PTM 配置文件。比较从不同条件下获得的不同轮廓，可以识别特定的改变，例如治疗引起的改变。Lentiviral介导细胞转导用于创建稳定的细胞系，表达修饰剂的双标记（6His和Flag）版本（泛素或ubl，如SUMO1或Nedd8）。这些标签允许从细胞中纯化泛基蛋白，因此也允许泛泛蛋白。这通过两步纯化过程完成：第一个在变性条件下使用 6His 标记执行，第二个在本机条件下使用 Flag 标记执行。这导致对修饰蛋白进行高度特异性和纯分离，随后通过液相色谱技术进行识别和半量化，然后采用串联质谱法（LC-MS/MS）技术。使用 Excel 软件对 MS 数据进行轻松的信息化分析，通过消除背景信号，可以建立 PTM 配置文件。这些配置文件在每个条件之间进行比较，以便确定具体的变化，然后更具体地研究，从标准生物化学技术验证开始。

培养哺乳动物细胞的转导，以创建GFP和6HF-Ub表达细胞 为了产生以后用于转导MiaPaCa-2细胞的慢病毒，70%的转化HEK-293T细胞与三种载体（pCCL-6HF-Ubiquitin或GFP/Delta-Helper/pvSvG）的等量共同转染。生产24小时后，回收并过滤含有慢病毒颗粒的介质。此时，通过检查在倒置显微镜上表达 293T 细胞的 GFP 的绿色荧光，可以控制转染效率。它应该接近100%的细胞。MiaPaCa-2细胞?...

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Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

该协议旨在建立泛素 （Ub） 和泛素样 （Ubls） 特定蛋白酶，以便识别与特定条件（如治疗或表型）相关的此类翻译后修饰 （PTM） 的更改。

分析泛性基质和泛性基质样的依从性转化后修饰和重大改变的识别

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

该协议是一种简单的方法来生成泛素和泛素的轮廓，通过识别和半量化特定的识别蛋白质。这项技术的主要优点是使用扁病毒在一周内创建稳定的细胞表达线，并使用两个标签专门纯化蛋白质。事实上，这种翻译后修饰涉及大多数生物功能，而这种机制的改变在大多数疾病中都被发现。因此，识别这些改变可以作为预测和/或诊断，当然作为分子靶点。泛素是真核细胞中最保守的蛋白质之一，这对它们的生存至关重要。因此，这种方法可以应用于任何真核模型，从哺乳动物到酵母。然而，我们的扁病毒系统仅限于细胞的研究。由于整个过程相当长，有时潜伏时间很长，所以有可能在两天内完成，而不是一天。从镍珠的埃卢酸盐可以冻结在负20和之前添加旗珠。该协议包含许多步骤，其中有些是关键，以确保最终成功的纯化，因此准确建立翻译后修改配置文件。实验室的两名博士生米尔娜·斯威登和奥雷利·多布里奇将进行手术演示。首先，在六井板中加入 0.5 倍至 6 个 HEK 293T 细胞，每井 DMEM 有两毫升，种子为 10%FBS，并在 37 摄氏度、5%二氧化碳和 100% 湿度下孵育。第二天，达到50%到70%的汇合。使用一微克pCCL-6HF泛素样或pCCL-GFP、1微克PBS VG和一微克的增量帮助器载体，使用转染试剂和扁病毒生产方案，对细胞进行混合。转染六小时后，将介质更改为与要转导的细胞介质对应的新鲜介质。种子细胞被转导在一个六井板与他们的标准培养媒体，以获得10至20%的汇合后一天。转染后24小时，回收含有扁病毒颗粒的介质，并使用0.45微米过滤器进行过滤。更换由含有扁病毒的过滤介质转导的细胞介质。在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中用扁病毒孵育细胞24至72小时，然后用新鲜标准培养基体改变培养基。使用倒置荧光显微镜检查 GFP 表达，以评估转导效率。如果未检测到荧光，请再等待两到三天。如果GP对绿色荧光呈阳性，生长所有细胞，直到有足够的通过免疫荧光执行6-His-FLAG泛素样表达控制，如这里所示，以及使用抗 FLAG 抗体的西方印迹。在15厘米的培养皿中培养细胞后，在室温下至少用磷酸盐缓冲盐水清洗培养皿一次。要开始细胞解，在室温下，将两毫升缓冲液加入每个15厘米的培养皿中。使用细胞刮刀将所有酸盐回收到 50 毫升锥形离心管中。声波三次，30秒，用一分钟的停顿分开。将声波化的 15，000 次 g 离心 15 分钟。通过40微米细胞过滤器将上流液转移到新管中。在声波和离心后过滤酸盐是非常重要的。不这样做可能会导致许多非特异性蛋白质的共纯，从而增加背景并强烈减少PTM轮廓的大小。将 50 到 100 毫克之间的等量蛋白质转移到新的猎鹰管中。将镍离子 NTA 珠子加入每个管中，每一毫克蛋白质含有两微升珠。将管子放在旋转器上，在室温下以 30 rpm 转速旋转 2 个半小时。然后在500倍g下粒珠5分钟。用一毫升缓冲器清洗珠子，然后将样品转移到1.5毫升微离心管中。将管子放在冰上。用一毫升的冰冷缓冲液洗两次，其中两粒含有十毫升的 imidazole。为了使用束缚的蛋白质，加入600微升缓冲液，其中含有250毫摩尔伊米达佐尔，并在4摄氏度下旋转两小时。在以500倍g离心对珠子进行造粒后，将上清液转移到新的预冷却1.5毫升管中，并加入50微升的抗 FLAG M2 抗体结合珠。在 4 摄氏度下以 30 rpm 转速旋转 2 个半小时。然后用500微升的缓冲器洗两次，然后用500微升的缓冲器洗两次。对于最后的洗脱，添加100微升缓冲液三，含有一个 FLAG肽，每微升0.01微克，并在4摄氏度旋转1个半小时。在500次g下离心一分钟后，将上清液转移到一个新的预冷却管中。将 10 微升加载到 SDS-PAGE 上，对凝胶进行银染色以控制纯化质量。如果纯化效果良好，请分析 LC-MS 留下的 90%。要执行规范化，请使用配方使药物治疗细胞和未经治疗的细胞之间的值正常化，用于泛素和GP。要去除背景，请从泛素样本中的值中减去对照样本GP中的值，以获得两种条件下每种已识别蛋白质的特定值。为了获得泛泛的变异，获得药物引起的PTM正和负变异的负100和正负变化的分数在负100和正负之间。处理样品和未经处理样品的特定值之间的差值除以所有值（包括控制值）的总和，并乘以 100。低于负 50 的变异（表示 PTM 的抑制，或高于 50 的变动，表示 PTM 的感应）被视为显著。使用此公式获取介于 50 以上的 0 和 100% 值之间的置信值通常被视为自信值。若要获得更好的感应和压量值分布，并考虑变化和置信度参数，请使用此公式将方差和置信值相乘。在这项研究中，实现了培养哺乳动物细胞的转导，以产生GP和6-组织旗泛素表达细胞。通过研究GP转导细胞的GGFP荧光，首先控制了扁病毒转导的功效。FLAG-泛素的表达是使用抗 FLAG抗体进行免疫荧光染色，该抗体显示转导细胞的百分比。为了控制外源 FLAG-泛素的表达水平，SDS-PAGE对转导细胞中的乳解酶进行了分析，然后用抗 FLAG抗体对西印迹进行了分析。纯化泛素蛋白后，10%的最终洗脱用于控制纯化材料的数量和完整性的SDS-PAGE和凝胶的银染色。背景GP样本减法识别了364种蛋白质明显泛化，得分超过50%，对这些泛素蛋白进行了基因集富集分析，以突出它们所涉及的生物过程。由宝石素引起的泛泛变化形成的潜在相互作用网络。这导致功能相互作用网络的识别强烈受到有关蛋白质的泛化增加或减少的影响。还证实，在宝石类氨酸处理后，PCNA的泛化增加。避免在两个洗脱步骤后转移一些珠子是非常重要的，因为它可能会导致背景显著增加。此过程将产生特定的翻译后修改，通过比较不同的条件，将使我们能够识别特定的修改。第一步将至少验证基于生化方法的兴趣变化。我们开发了这种方法来探索基于泛素的翻译后修饰，以确定胰腺癌细胞的新方法和机制。自该议定书和全球开发以来，已经成功地用于破译不同的生物过程。扁病毒必须至少在BL-2实验室使用。瓜尼丁是一种强变性剂，必须慎用。声波器也可能对耳朵有害，必须按照建议使用。

Research

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Biochemistry

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