Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af La Ligue contre Le Cancer til HV og MS, og ARC (Association pour la Recherche Sur Le Cancer) til PS, INCa (Institute National du Cancer) og Canceropole PACA til JI. Den massespektrometriske facilitet i Marseille proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) støttet af IBISA (infrastrukturer biologie santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, Cancéropôle PACA, Provence-Alpes-Côte d'Azur Institut Paoli-Calmettes og Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

1. generering af stabile cellelinjer, som udtrykker 6His-flaget-UBL
Bemærk: Co-transfection af HEK-293T celler med pCCL-6HF-UBL, pVSVG og Delta-Helper.
<ol><li>Dag 0: frø 293T celler i en 6-brønd plade for at opnå 50-70% sammenløbet dagen efter.</li>
	<li>Dag 1: Co-transfect 50-70% flydende-celler med en blanding af 1 μg pccl-6hf-UBL eller pccl-gfp, 1 μg pvsvg og 1 μg Delta-Helper vektorer, ved hjælp af et transfektering reagens og protokol for lentivirus produktion. Efter 6 timer a...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

Vi har udviklet en robust og pålidelig metode til at generere profiler af proteiner modificeret af de vigtigste ubiquitin familiemedlemmer. Faktisk har vi med succes anvendt denne protokol til at generere profiler af PTMs af ubiquitin, og også af SUMO og Nedd8, og til at opdage ændringer i forbindelse med en behandling7, som reaktion på over ekspression eller Knockdown af et bestemt gen (data ikke viste) og i celler, der erhvervede en resistent fænotype til forskellige kemoterapeutika.
<p...

Den metode, der foreslås her, er dedikeret til at studere PTMs medieret af ubiquitin familiemedlemmer fra dyrkede pattedyrceller for at identificere potentielle ændringer i forbindelse med en bestemt tilstand (behandling, differentiering, osv.). PTMs repræsenterer det sidste trin i reguleringen af proteiner ' funktioner1. Faktisk, når fremstillet af translationelle maskiner, de fleste, hvis ikke alle proteiner gennemgår forskellige former for PTMs at moduere deres aktivitet, molekylære interaktioner, og intracellulære placering1. Blandt de overflod af PTMs er dem, medieret af ubiquitin-familien af proteiner, ubiquitin selv og alle ubiquitin-Likes, har potentiale til at regulere alle intracellulære eller delvist cytoplasmiske proteiner2. Fordi de selv er proteiner, kan de konjugeres til hinanden og danne homogene og heterogene kæder af forskellige topologier, der hver er forbundet med specifikke reguleringsfunktioner2. Værktøjer er nødvendige for at forsøge at dechifrere og forstå dette komplekse maskineri. Mange tilgange blev udviklet i hele verden, har deres egne fordele og ulemper, og her foreslår vi en med høj ydeevne egnet til dyrkede celler.
Den største fordel ved denne metode er dens nøjagtighed. Faktisk er renheden af isolerede modificerede proteiner stærkt forbedret ved kombinatorisk brug af de to Tags (6his og flag) og de to trin-procedure, og derfor er det meget mere selektiv end et enkelt tag fusion UB/UBL3,4. Tilstedeværelsen af 6His-mærket muliggør et første rensningstrin i en fuldt Denaturerings tilstand og undgår derved enhver samtidig rensning af proteiner, der indeholder ubiquitin-bindings domæner eller andre proteiner, som binder sig til de allestedsnærværende. Dette er et teknisk problem stødt på flere andre tilgange baseret på affinitet rensning af allestedsnærværende proteomer ved hjælp af enten specifikke antistoffer5 eller tandem ubiquitin bindende elementer (rør)6. Vigtigere, denne teknik er ikke partisk til fordel for rensning af en bestemt type af allestedsnærværende, som det kunne være tilfældet for nogle andre tilgange, da både mono og forskellige former for polyubiquitinationer blev identificeret7. Derfor vil en ændring af allestedsnærværende, når den er fundet, skulle undersøgt nærmere ved standard biokemiske tilgange for at identificere den nøjagtige form for allestedsnærværende.
Endelig, en anden teknisk fordel ved denne protokol er brugen af lentivira, der nemt og hurtigt skaber stabile udtrykker cellelinjer med et rimeligt niveau af udtryk for Tagged modifikator uden at forstyrre den normale cellulære adfærd.
Der henviser til, at en vigtig rolle for allestedsnærværende er at målrette proteiner mod proteasomal nedbrydning, er det nu kendt, at det har mange andre regulerende egenskaber for potentielt mest intracellulære eller delvist intracellulære proteiner1. Antallet af disse funktioner forstærkes yderligere af eksistensen af mange ubiquitin som proteiner, der danner en familie af proteiner regulerer næsten hver celle mekanismer1. Deres ændringer kan have drastiske konsekvenser for cellebiologi og kan føre eller deltage i patologiske situationer8, såsom kræft9. Derfor, værktøjer er nødvendige for at udforske dette store landskab og identificere de ændringer, der er forbundet med en patologisk tilstand, som kunne tjene som nye terapeutiske mål.
Denne protokol er dedikeret til celler i kultur, da de skal transduceres til at udtrykke eksogene Tagged UB/UBL. Når de er oprettet, kan disse stabile cellelinjer bruges til at generere UBL profiler fra kultur i 2D eller 3D eller xenografts, og derved forlænge horisonten for de forskellige eksperimentelle modeller, der kan anvendes til at studere PTMs profiler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

Ubiquitin (UB) og ubiquitin-lignende (UBL) afhængige post-translationelle modifikationer af proteiner spiller grundlæggende biologiske regulerings roller i cellen ved at kontrollere protein stabilitet, aktivitet, interaktioner og intracellulær lokalisering. De gør det muligt for cellen at reagere på signaler og tilpasse sig ændringer i dens miljø. Ændringer inden for disse mekanismer kan føre til alvorlige patologiske situationer, såsom neurodegenerative sygdomme og kræft. Formålet med den teknik, der er beskrevet her, er at etablere UB/ubls afhængige PTMs-profiler, hurtigt og præcist, fra dyrkede cellelinjer. Sammenligningen af forskellige profiler opnået fra forskellige betingelser gør det muligt at identificere specifikke ændringer, såsom dem, der er fremkaldt af en behandling f. eks. Lentiviral medieret celle transduktion udføres for at skabe stabile cellelinjer, der udtrykker en to-Tags (6His og flag) version af modifikatoren (ubiquitin eller en UBL såsom SUMO1 eller Nedd8). Disse mærker tillader rensning af ubiquitin og derfor af allestedsnærværende proteiner fra cellerne. Dette gøres gennem en to-trins rensningsproces: den første er udført i Denaturerings betingelser ved hjælp af 6His tag, og den anden i indfødte forhold ved hjælp af flaget tag. Dette fører til en meget specifik og ren isolering af modificerede proteiner, som efterfølgende identificeres og semi-kvantificeres ved væskekromatografi efterfulgt af tandem massespektrometri (LC-MS/MS) teknologi. Easy Informatik analyse af MS data ved hjælp af Excel-software gør det muligt at etablere PTM profiler ved at eliminere baggrunds signaler. Disse profiler sammenlignes mellem hver betingelse for at identificere specifikke ændringer, som derefter vil blive undersøgt mere specifikt, begyndende med deres validering af standard biokemiske teknikker.

Transduktion af kultur pattedyrceller til at skabe GFP og 6HF-UB udtrykker celler For at producere lentivira, som vil blive brugt senere til at transduce miapaca-2 celler, 70% flydende hek-293t celler er co-transficeret med en tilsvarende mængde af de tre vektorer, pccl-6hf-ubiquitin eller gfp/Delta-Helper/pvsvg. Efter 24 timers produktion opsamles det medium, der indeholder lentiviral partikler, og filtreres. Det er muligt på dette tidspunkt at kontrollere effektivi...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Denne protokol tager sigte på at etablere ubiquitin (UB) og ubiquitin-Likes (Ubls) specifikke proteomer med henblik på at identificere ændringer af denne form for post-translationelle modifikationer (PTMs), forbundet med en bestemt tilstand, såsom en behandling eller en fænotype.

Profilering af Ubiquitin og Ubiquitin-lignende afhængige posttranslationelle ændringer og identificering af væsentlige ændringer

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Denne protokol er en nem måde at generere profiler af ubiquitin og ubiquitin-lignende post-translationelle ændringer ved at identificere og semi-kvantificere specifikke identificerede proteiner. Den største fordel ved denne teknik er brugen af lentivirus til at skabe stabile celle linje udtryk inden for en uge, og brugen af to tags til specifikt at rense proteiner. Faktisk er denne form for post-translationelle ændringer involveret i de fleste biologiske funktioner, og ændringer af denne mekanisme findes i de fleste sygdomme.Derfor kan identifikation af disse ændringer tjene som en prognose og / eller diagnose og selvfølgelig som molekylære mål. Ubiquitin er et af de mest bevarede protein i eukaryote celler, og dette er afgørende for deres overlevelse. Derfor kan denne form for metode anvendes på enhver eukaryote model, fra pattedyr til gær.Men vores lentivirale system er begrænset til studiet af celler. Da hele proceduren er ganske lang med nogle gange lang inkubationstid, er det muligt at gøre det over to dage i stedet for en. Eluatet fra nikkelperler kan fryses ved minus 20 og før du tilføjer flagperlerne.Denne protokol indeholder mange trin, blandt hvilke nogle er kritiske for at sikre den endelige succes for rensningen, og så den nøjagtige etablering af post-translationel ændring profil. Demonstration af proceduren vil blive udført af Mirna Swayden og Aurelie Dobric, to ph.d.-studerende i laboratoriet. Til at begynde, tilføje 0,5 gange 10 til den sjette af HEK 293T celler i en seks-brønd plade med to milliliter pr brønd af DMEM med 10% FBS til frø, og inkubere ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid, og 100% fugtighed.Den næste dag opnås 50 til 70%sammenløb. Cotransfect cellerne med en blanding af et mikrogram pCCL-6HF ubiquitin-lignende eller pCCL-GFP, et mikrogram PBS VG, og et mikrogram delta hjælper vektorer ved hjælp af en transfection reagens og protokol for lentivirus produktion. Efter seks timers transfektion, ændre mediet til en frisk en svarende til medierne i celler, der skal trans induceres.Frø de celler, der skal trans induceres i en seks-brønd plade med deres standard kultur medier for at opnå 10 til 20% sammenløb dagen efter. 24 timer efter transfektion, genvinde medium, der indeholder lentivirale partikler, og filter ved hjælp af 0,45-mikron filtre. Mediet af de celler, der skal transproduceres, udskiftes med det filtrerede medium, der indeholder lentivirus.Inkuber cellerne med lentivirus i 24 til 72 timer i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, og derefter ændre mediet med frisk, standard en. Kontroller GFP-udtrykket ved hjælp af et inverteret fluorescerende mikroskop for at evaluere effektiviteten af transduktion. Hvis der ikke registreres fluorescens, skal du vente i yderligere to til tre dage.Hvis GFP-kontrollen er positiv med grøn fluorescens, skal alle celler dyrkes, indtil de har nok til at udføre et udtrykskontrol af 6-His-FLAG ubiquitin-lignende ved immunfluorescens, som vist her, og vestlige blot ved hjælp af anti-FLAG antistof. Efter dyrkning af cellerne i 15-centimeter retter, vaske kultur retter mindst én gang med fosfat-buffered saltvand ved stuetemperatur. For at begynde celle lysis, tilføje to milliliter buffer en i hver 15-centimeter skål ved stuetemperatur.Brug en celleskraber til at genvinde alle lysater i 50-milliliter koniske centrifugerør. Sonikere lystates tre gange i 30 sekunder, adskilt af en et-minutters pause. Centrifuge de sonikerede lysater ved 15,000 gange g i 15 minutter.Overfør supernatanten til et nyt rør gennem en 40-mikron cellesting. Det er meget vigtigt at filtrere lysater efter sonikering og centrifugering. Hvis dette ikke gør dette, kan det resultere i copurification af mange ikke-specifikke proteiner, hvilket øger baggrunden og kraftigt reducerer størrelsen af PTM-profilen.Overfør en tilsvarende mængde protein mellem 50 og 100 mg til nye Falcon rør. Tilføj nikkel ion NTA perler i hvert rør med mængden af to mikroliter af perler pr et milligram protein. Anvend rørene på en rotator for at rotere ved 30 omdrejninger i 2 1/2 time ved stuetemperatur.Pellet derefter perlerne ved 500 gange g i fem minutter. Vask perlerne med en milliliter buffer en, og overfør prøverne til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Læg røret på is.Vask to gange med en milliliter iskold buffer to indeholdende ti-millimolar imidazol. For at elutere proteiner tilsættes 600 mikroliter buffer to indeholdende 250 millimolar imidazol, og roter i to timer ved fire grader Celsius. Efter pelletering af perlerne ved centrifugering ved 500 gange g i et minut, overføre supernatanten til en ny forkølet 1,5-milliliter rør, og tilsæt 50 mikroliter anti-FLAG M2 antistof-konjugerede perler.Roter ved 30 omdrejninger i 2 1/2 time ved fire grader Celsius. Derefter vaskes to gange med 500 mikroliter buffer to, derefter to gange med 500 mikroliter buffer tre. Til den endelige elution tilsættes 100 mikroliter buffer tre, der indeholder et FLAG-peptid ved 0,01 mikrogram pr. mikroliter, og der roteres ved fire grader Celsius i 1 1/2 time.Efter centrifugering ved 500 gange g i et minut overføres supernatanten til et nyt forkølet rør. Tag 10 mikroliter til at indlæse på SDS-PAGE, og udføre en sølv farvning af gelen til at styre rensning kvalitet. Hvis rensningen ser godt ud, skal du analysere de 90 %, der er tilbage af LC-MS.For at udføre normalisering, bruge formlerne til at normalisere værdier mellem stofbehandlede celler og ubehandlede celler for ubiquitin og GFP. Hvis du vil fjerne baggrunden, skal du trække værdierne i kontrolprøven GFP fra værdierne i ubiquitinprøverne for at opnå specifikke værdier for hvert identificeret protein under begge forhold. For at opnå variationen af ubiquitination, opnå en score mellem minus 100 og plus 100 for positive og negative variationer af Ptms induceret af et lægemiddel.Forskellen mellem de specifikke værdier af behandlede og ubehandlede prøver divideres med summen af alle værdier, herunder værdierne i kontrolelementet, og ganges med 100. Variationer under minus 50, der repræsenterer undertrykkelse af PTM eller over 50, og som repræsenterer induktion af PTM, betragtes som signifikante. Brug denne formel til at opnå en konfidensværdi mellem nul og 100 %Værdier over 50 anses normalt for at være sikre.For at opnå en pænere fordeling af induktions- og undertrykkelsesværdier og for at overveje både variations- og konfidensparametre skal du bruge denne formel til at multiplicere varians- og konfidensværdierne. I denne undersøgelse blev transduktion af kulturpattepatteceller opnået for at skabe GFP og 6-histidin FLAG ubiquitin udtrykke celler. Effekten af lentiviral transduktion blev først kontrolleret ved at se på GFP fluorescens af GFP-transduced celler.Ekspressionen af FLAG-ubiquitin blev udført ved immunfluorescensfarvning ved hjælp af et anti-FLAG antistof, som viser procentdelen af transduced celler. For at kontrollere eksogene FLAG-ubiquitins udtryksniveau blev lysater fra transducedceller analyseret af SDS-PAGE efterfulgt af western blot med anti-FLAG antistof. Efter rensning af de ubiquitinerede proteiner blev 10% af den endelige dannelse brugt til at kontrollere mængden og integriteten af renset materiale ved SDS-PAGE og sølvfarvning af gelen.Baggrund GFP prøve subtraktion identificeret 364 proteiner betydeligt ubiquitinated med en score over 50%A gensæt berigelse analyse af disse ubiquitinated proteiner blev udført for at fremhæve de biologiske processer, som de var involveret. Potentielle interagerende netværk dannet af gemcitabin-induceret ændringer af allestedsnærværende. Dette førte til identifikation af funktionelle interagerende netværk stærkt påvirket af øget eller nedsat allestedsnærværende af de involverede proteiner.Det blev også bekræftet, at ubiquitination af PCNA steg efter gemcitabin behandling. Det er meget vigtigt at undgå overførsel af nogle perler efter begge elution trin, da det kan resultere i en betydelig stigning i baggrunden. Denne procedure vil medføre specifikke ændringer efter oversættelsen, som ved at sammenligne forskellige betingelser vil gøre det muligt at identificere specifikke ændringer.Det første næste skridt vil være at validere i det mindste de interesseændringer, der er baseret på biokemiske tilgange. Vi udviklede denne metode til at udforske ubiquitin-baserede, post-translationelle ændringer for at identificere nye måder og mekanismer af kræft i bugspytkirtlen celler. Da denne protokol og andre udviklede verden over har været ansat med succes til at dechifrere forskellige biologiske processer.Lentivirus skal anvendes i det mindste i BL-2 laboratorium. Guanidine er et stærkt denatureringsmiddel og skal anvendes omhyggeligt. Sonikatoren kan også være skadelig for ørerne og skal bruges efter anbefalinger.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metode til måling af RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ændringer i celler og væv

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering af Intermediate Filament Proteiner fra Multiple Musvæv til Studie Aging-associerede Post-translationelle Modifikationer

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Udnytte en omfattende Immunoprecipitation berigelse System for at identificere en endogen posttranslationel modifikation profil for Target proteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikation af Cyclin-afhængig Kinase 1 specifikke fosforylering websteder ved en In Vitro -Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Funktionel karakterisering af RING type E3 Ubiquitin-Ligaser in vitro og i planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Ubiquitin kædeanalyse ved parallel reaktionsovervågning

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Rensning af Tubulin med kontrollerede posttranslationale modifikationer og isotyper fra begrænsede kilder ved polymerisering-depolymeriseringscyklusser

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosidekstraktion, rensning og profilering

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...