Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door la Ligue contre le Cancer aan HV en MS, en de ARC (Association pour la Recherche sur le Cancer) aan PS, INCa (Institute National du Cancer) en Canceropole PACA naar JI. De massaspectrometrie faciliteit van Marseille Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) ondersteund door IBISA (infrastructuur Biologie santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, de Cancéropôle PACA, de Provence-Alpes-Côte d'Azur Regio, het Institut Paoli-Calmettes en het Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

1. generatie van stabiele cellijnen uitdrukken 6His-vlag-UBL
Opmerking: Co-transfectie van HEK-293T cellen met pCCL-6HF-UBL, pVSVG en Delta-helper.
<ol><li>Dag 0: zaad 293T cellen in een 6-put plaat te verkrijgen 50-70% samenvloeiing de dag na.</li>
	<li>Dag 1: Co-transfect 50-70% confluente cellen met een mengsel van 1 μg PCCL-6hf-UBL of PCCL-GFP, 1 μg pvsvg en 1 μg Delta-helper vectoren, met behulp van een transfectie reagens en protocol voor lintvirus productie. Na 6 h van transfectie,...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

We hebben een robuuste en betrouwbare methodologie ontwikkeld om profielen van eiwitten te genereren die zijn aangepast door de belangrijkste ubiquitine-familieleden. Inderdaad, we hebben dit protocol met succes toegepast om profielen van Ptm's te genereren door ubiquitin, en ook door SUMO en Nedd8, en om veranderingen in verband met een behandeling te detecteren7, in reactie op de over expressie of knockdown van een bepaald gen (gegevens niet weergegeven) en in cellen die een resistent fenotype h...

De hier voorgestelde methode is gewijd aan het bestuderen van Ptm's gemedieerd door de ubiquitine familieleden uit gekweekte zoogdiercellen om mogelijke veranderingen in verband met een specifieke aandoening te identificeren (behandeling, differentiatie, enz.). Ptm's vertegenwoordigen de laatste stap in de regulering van de functies van eiwitten1. Inderdaad, eenmaal geproduceerd door de translationele machines, de meeste zo niet alle eiwitten ondergaan verschillende soorten Ptm's die hun activiteit moduleren, moleculaire interacties, en intracellulaire locatie1. Onder de overvloed aan Ptm's zijn degenen die worden bemiddeld door de ubiquitine familie van eiwitten, ubiquitine zelf en alle ubiquitine-likes, hebben het potentieel om alle intracellulaire of gedeeltelijk cytoplasmische eiwitten reguleren2. Omdat ze zelf eiwitten zijn, kunnen ze aan elkaar worden geconjugeerd, en vormen homogene en heterogene ketens van verschillende topologieën, elk geassocieerd met specifieke regelgevende functies2. Tools zijn nodig om te proberen om deze complexe machines te ontcijferen en te begrijpen. Veel benaderingen werden wereldwijd ontwikkeld, met hun eigen voor-en nadelen, en hier stellen we een met hoge prestaties geschikt voor gekweekte cellen.
Het belangrijkste voordeel van deze methode is de nauwkeurigheid. Inderdaad, de zuiverheid van geïsoleerde gemodificeerde eiwitten wordt sterk verbeterd door het combinatorische gebruik van de twee tags (6his en vlag) en de twee stap-procedure en daarom is het veel selectiever dan een enkele tag Fusion UB/UBL3,4. De aanwezigheid van de 6His-tag maakt een eerste stap van zuivering mogelijk in een volledig denaturerende aandoening, waardoor elke co-zuivering van eiwitten die ubiquitine-bindende domeinen of andere eiwitten bevatten die aan de alomtegenwoordige stoffen binden, wordt vermeden. Dit is een technisch probleem dat wordt ondervonden door verschillende andere benaderingen op basis van affiniteits zuivering van alomtegenwoordige proteomes met behulp van specifieke antilichamen5 of tandem ubiquitine bindings elementen (buizen)6. Belangrijk is dat deze techniek niet bevooroordeeld is ten gunste van de zuivering van een bepaald type Ubiquitination, omdat het voor sommige andere benaderingen het geval zou kunnen zijn, omdat zowel mono als verschillende soorten polyubiquitinaties werden geïdentificeerd7. Als gevolg hiervan zal een wijziging van ubiquitatie in meer details moeten worden bestudeerd door standaard biochemische benaderingen om de exacte soort alomtegenwoordige activiteiten te identificeren.
Tot slot, een ander technisch voordeel van dit protocol is het gebruik van lentivirussen, dat gemakkelijk en snel creëert stabiele uitdrukken cellijnen met redelijke niveau van expressies van Tagged modifier zonder interfereren met de normale cellulaire gedrag.
Overwegende dat een belangrijke rol van ubiquitisatie is om eiwitten te richten op proteasomale afbraak, het is nu bekend dat het vele andere regulatoire eigenschappen heeft voor potentieel meest intracellulaire of gedeeltelijk intracellulaire eiwitten1. Het aantal van deze functies wordt verder versterkt door het bestaan van veel ubiquitine zoals eiwitten, het vormen van een familie van eiwitten die bijna elke cel mechanismen reguleren1. Hun wijzigingen kunnen drastische gevolgen hebben voor de celbiologie en kunnen leiden of deelnemen aan pathologische situaties8, zoals kanker9. Daarom zijn gereedschappen nodig om dit uitgestrekte landschap te verkennen en de veranderingen te identificeren die gepaard gaan met een pathologische aandoening die als nieuwe therapeutische doelen kan dienen.
Dit protocol is gewijd aan cellen in de cultuur, omdat ze moeten worden getransduceerde om exogene Tagged UB/UBL uit te drukken. Eenmaal gemaakt, kunnen deze stabiele cellijnen worden gebruikt om UBL-profielen te genereren van cultuur in 2D of 3D of xenografts, waardoor de horizon van de verschillende experimentele modellen die kunnen worden toegepast om PTMs-profielen te bestuderen, wordt verlengd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

Ubiquitin (UB) en ubiquitin-achtige (UBL) afhankelijke post-translationele modificaties van eiwitten spelen fundamentele biologische regelgevende rollen binnen de cel door het beheersen van de stabiliteit van het eiwit, activiteit, interacties en intracellulaire lokalisatie. Ze stellen de cel in staat om te reageren op signalen en zich aan te passen aan veranderingen in de omgeving. Veranderingen binnen deze mechanismen kunnen leiden tot ernstige pathologische situaties zoals neurodegeneratieve ziekten en kankers. Het doel van de hier beschreven techniek is om UB/ubls afhankelijke PTMs-profielen, snel en nauwkeurig, uit gekweekte cellijnen vast te stellen. De vergelijking van verschillende profielen die uit verschillende omstandigheden zijn verkregen, maakt het mogelijk specifieke veranderingen te identificeren, zoals die welke worden veroorzaakt door bijvoorbeeld een behandeling. Lentivirale gemedieerde celtransductie wordt uitgevoerd om stabiele cellijnen te creëren die een twee-tags (6His en Flag) versie van de modifier uitdrukken (ubiquitin of een UBL zoals SUMO1 of Nedd8). Deze tags staan de zuivering van ubiquitine en dus van alomtegenwoordige eiwitten uit de cellen toe. Dit wordt gedaan door middel van een twee stappen zuiveringsproces: de eerste wordt uitgevoerd in denaturerende omstandigheden met behulp van de 6His tag, en de tweede in inheemse omstandigheden met behulp van de vlag tag. Dit leidt tot een zeer specifieke en zuivere isolatie van gemodificeerde eiwitten die vervolgens worden geïdentificeerd en semi-gekwantificeerd door vloeistofchromatografie, gevolgd door tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) technologie. Eenvoudige informatica analyse van MS-gegevens met behulp van Excel-software maakt het mogelijk PTM-profielen te creëren door achtergrond signalen te elimineren. Deze profielen worden vergeleken tussen elke aandoening om specifieke veranderingen te identificeren die dan specifieker bestudeerd zullen worden, te beginnen met hun validering door standaard biochemie technieken.

Transductie van kweek zoogdiercellen om GFP en 6HF-UB te creëren die cellen uitdrukken Om lentivirussen te produceren die later zullen worden gebruikt om MiaPaCa-2 cellen te leiden, worden 70% Confluent Health HEK-293T cellen samen met een gelijke hoeveelheid van de drie vectoren, pCCL-6HF-Ubiquitin of GFP/Delta-helper/pvSvG. Na 24 h van de productie wordt het medium dat linvirale deeltjes bevat, teruggewonnen en gefilterd. Het is mogelijk op dit punt om de efficiënt...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Dit protocol is een eenvoudige manier om de profielen van ubiquitine en ubiquitine-achtige post-translationele wijzigingen te genereren door het identificeren en semi-kwantificeren van specifieke geïdentificeerde eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van lentivirussen om stabiele cellijn van expressie binnen een week te creëren, en het gebruik van twee tags om specifiek eiwitten te zuiveren. In feite zijn dit soort post-translationele wijzigingen betrokken bij de meeste biologische functies, en veranderingen van dit mechanisme worden gevonden in de meeste ziekten.Daarom kan het identificeren van deze veranderingen dienen als een prognostische en/of diagnose en natuurlijk als moleculaire doelen. Ubiquitine is een van de meest geconserveerde eiwitten in eukaryotische cellen en dit essentieel voor hun overleving. Daarom kan dit soort methode worden toegepast op elk eukaryotisch model, van zoogdieren tot gist.Echter, ons lentivirale systeem is beperkt tot de studie van cellen. Aangezien de hele procedure vrij lang is met soms lange incubatietijd, is het mogelijk om het gedurende twee dagen te doen in plaats van één. Het eluaat van nikkel kralen kunnen worden ingevroren bij min 20 en voor het toevoegen van de vlag kralen.Dit protocol bevat vele stappen waaronder sommige van cruciaal belang zijn om het uiteindelijke succes van de zuivering te garanderen, en dus de nauwkeurige vaststelling van het post-translationele wijzigingsprofiel. Het demonstreren van de procedure zal worden uitgevoerd door Mirna Swayden en Aurelie Dobric, twee promovendi van het lab. Om te beginnen, voeg 0,5 keer 10 toe aan de zesde van HEK 293T-cellen in een zes-put plaat met twee milliliters per put van DMEM met 10%FBS aan zaad, en uitbroeden bij 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en 100% vochtigheid.De volgende dag wordt 50 tot 70% samenvloeiing bereikt. Cotransfect de cellen met een mix van een microgram pCCL-6HF ubiquitine-achtig of pCCL-GFP, een microgram PBS VG en één microgram deltahelpervectoren met behulp van een transfectiereagens en protocol voor de productie van lentivirus. Na zes uur transfectie, verander het medium in een verse die overeenkomt met de media van cellen worden getransduceerd.Zaad de cellen worden omgezet in een zes-put plaat met hun standaard cultuur media om 10 tot 20% samenvloeiing de dag erna te verkrijgen. 24 uur na transfectie, herstel het medium met lentivirale deeltjes en filter met 0,45 micronfilters. Vervang het medium van de cellen dat moet worden omgezet door het gefilterde medium dat lentivirussen bevat.Incubeer de cellen met lentivirussen gedurende 24 tot 72 uur in een couveuse bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, en verander het medium vervolgens met verse, standaard. Controleer de GFP-expressie met behulp van een omgekeerde fluorescerende microscoop om de efficiëntie van transductie te evalueren. Als er geen fluorescentie wordt gedetecteerd, wacht dan nog twee tot drie dagen.Als de GFP-controle positief is met groene fluorescentie, groeien alle cellen totdat ze genoeg hebben om een expressiecontrole van 6-His-FLAG ubiquitine-achtige uit te voeren door immunofluorescentie, zoals hier getoond, en westerse vlek met behulp van anti-FLAG antilichaam. Na het kweken van de cellen in 15-centimeter schotels, was de cultuur gerechten ten minste een keer met fosfaat-gebufferde zoutoplossing bij kamertemperatuur. Om te beginnen cel lysis, voeg twee milliliter buffer een in elke 15-centimeter schotel op kamertemperatuur.Gebruik een celschraper om alle lysates terug te krijgen in 50-milliliter conische centrifugebuizen. Sonicate de lystates drie keer gedurende 30 seconden, gescheiden door een pauze van een minuut. Centrifugeren de gesoniceerde lysates op 15.000 keer g gedurende 15 minuten.Breng de supernatant naar een nieuwe buis door middel van een 40-micron cel zeef. Het is erg belangrijk om lysates te filteren na sonicatie en centrifugatie. Als u dit niet doet, kan dit leiden tot copurificatie van veel niet-specifieke eiwitten, waardoor de achtergrond toeneemt en de grootte van het PTM-profiel sterk wordt verminderd.Breng een gelijke hoeveelheid eiwit tussen 50 en 100 milligram over naar nieuwe Falcon buizen. Voeg nikkel ion NTA kralen in elke buis met de hoeveelheid van twee microliter kralen per een milligram eiwit. Plaats de buizen op een rotator om 2 1/2 uur bij kamertemperatuur bij 30 tpm te draaien.Dan pellet de kralen op 500 keer g gedurende vijf minuten. Was de kralen met een milliliter buffer een, en breng de monsters naar een 1,5-milliliter microcentrifuge buis. Zet de buis op ijs.Was twee maal met een milliliter ijskoude buffer twee met tien millimolar imidazool. Voeg aan elute-gebonden eiwitten 600 microliter buffer twee toe met 250 millimolar imidazool en draai twee uur lang bij vier graden Celsius. Na het pelleteren van de kralen door centrifugatie op 500 keer g gedurende een minuut, breng de supernatant naar een nieuwe voorgekoelde 1,5-milliliter buis, en voeg 50 microliter van anti-FLAG M2 anti-geconjugatte kralen.Draai bij 30 rpm gedurende 2 1/2 uur bij vier graden Celsius. Was dan twee keer met 500 microliters van buffer twee, dan twee keer met 500 microliters van buffer drie. Voor de laatste elutie, voeg 100 microliter buffer drie met een VLAG peptide op 0,01 microgram per microliter, en draaien op vier graden Celsius gedurende 1 1/2 uur.Na centrifugatie op 500 keer g gedurende een minuut, breng de supernatant naar een nieuwe voorgekoelde buis. Neem 10 microliters om op SDS-PAGE te laden en voer een zilveren kleuring van de gel uit om de zuiveringskwaliteit te controleren. Als de zuivering ziet er goed uit, analyseren van de 90%links door LC-MS.Als u normalisatie wilt uitvoeren, gebruikt u de formules om waarden tussen met geneesmiddelen behandelde cellen en onbehandelde cellen voor alomtegenwoordig en GFP te normaliseren. Om achtergrond te verwijderen, trek je waarden in het controlemonster GFP af van waarden in de ubiquitinemonsters, om specifieke waarden voor elk geïdentificeerd eiwit in beide omstandigheden te verkrijgen. Om de variatie van alomtegenwoordigheid te verkrijgen, verkrijg je een score tussen min 100 en plus 100 voor positieve en negatieve variaties van PTMs die door een medicijn worden veroorzaakt.Het verschil tussen de specifieke waarden van behandelde en onbehandelde monsters wordt gedeeld door de som van alle waarden, inclusief die in de controle, en vermenigvuldigd met 100. Variaties onder min 50, die de repressie van PTM vertegenwoordigen, of hoger dan 50, die de inductie van PTM vertegenwoordigen, worden als significant beschouwd. Gebruik deze formule om een betrouwbaarheidswaarde te verkrijgen tussen nul en 100%Waarden boven de 50 worden meestal als zelfverzekerd beschouwd.Om een mooiere verdeling van inductie- en repressiewaarden te verkrijgen en om zowel variatie- als vertrouwensparameters te overwegen, gebruikt u deze formule om de variantie- en betrouwbaarheidswaarden te vermenigvuldigen. In deze studie, transductie van de cultuur zoogdiercellen werd bereikt om GFP en 6-histidine FLAG ubiquitine uitdrukken cellen te creëren. De werkzaamheid van lentivirale transductie werd eerst gecontroleerd door te kijken naar de GFP-fluorescentie van GFP-transduceerde cellen.De expressie van FLAG-ubiquitine werd gedaan door immunofluorescentie kleuring met behulp van een anti-FLAG antilichaam, dat het percentage van de getransduceerde cellen toont. Om het expressieniveau van exogene FLAG-ubiquitine te controleren, werden lysates uit getransduceerde cellen geanalyseerd door SDS-PAGE gevolgd door western blot met anti-FLAG antilichaam. Na zuivering van de alomtegenwoordige eiwitten werd 10% van de uiteindelijke elutie gebruikt om de hoeveelheid en integriteit van gezuiverd materiaal door SDS-PAGE en zilveren kleuring van de gel te controleren.Achtergrond GFP monster aftrekken geïdentificeerd 364 eiwitten aanzienlijk alomtegenwoordig met een score van meer dan 50%Een gen set verrijking analyse van deze alomtegenwoordige eiwitten werd uitgevoerd om de biologische processen waarin ze betrokken waren te markeren. Potentiële interactienetwerken gevormd door gemcitabine-geïnduceerde veranderingen van alomtegenwoordigheid. Dit leidde tot de identificatie van functionele interactienetwerken die sterk werden beïnvloed door verhoogde of verminderde alomtegenwoordigheid van de betrokken eiwitten.Het werd ook bevestigd dat de alomtegenwoordigheid van PCNA steeg na gemcitabine behandeling. Het is erg belangrijk om de overdracht van sommige kralen te voorkomen na beide elutiestappen, omdat het kan resulteren in een aanzienlijke toename van de achtergrond. Deze procedure zal specifieke post translationele wijzigingen opleveren die, door verschillende voorwaarden te vergelijken, het mogelijk maken specifieke wijzigingen te identificeren.De eerste volgende stap is het valideren van ten minste de veranderingen van de rente op basis van biochemische benaderingen. We ontwikkelden deze methode om ubiquitine-gebaseerde, post-translationele wijzigingen te onderzoeken om nieuwe manieren en mechanismen van alvleesklierkankercellen te identificeren. Sinds dit protocol en andere wereldwijd ontwikkeld zijn met succes gebruikt om verschillende biologische processen te ontcijferen.De lentivirussen moeten ten minste in bl-2 laboratorium worden gebruikt. Guanidine is een sterk denatureringsmiddel en moet zorgvuldig worden gebruikt. De sonicator kan ook schadelijk zijn voor de oren en moeten worden gebruikt volgens aanbevelingen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Een methode voor het meten van RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Wijzigingen in cellen en weefsels

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Functionele karakterisatie van RING-type E3 Ubiquitin ligases in vitro en in planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Zuivering van tubuline met gecontroleerde posttranslationele modificaties en isotypes uit beperkte bronnen door polymerisatie-depolymerisatiecycli

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Ganglioside extractie, zuivering en profilering

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...